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本发明公开了一种植物干馏液、其制备方法及其在提高丹参毛状根有效成分含量中的应用，该植物干馏液是将山楂核、核桃壳、酸枣核进行干馏而得，该方法操作简单，简洁快速，易于实现，所用原料为植物废弃物，实现了废物的充分利用，变废为宝，成本低，便于工业化生产。此外，所得植物干馏液可以明显提高丹参毛状根组织培养中药效成分的含量，经济效益高。

1.  一种植物干馏液的制备方法，其特征是：包括将山楂核、酸枣核和核桃壳进行干馏得干馏液的步骤。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：山楂核、酸枣核和核桃壳的质量比为1～13:1～2:1～3，优选为11:2:2或13:1:1。

3.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：包括将山楂核、酸枣核和核桃壳分别在140～145℃、240～245℃、300～360℃下进行干馏，将这三段温度下所得的干馏液合并的步骤。

4.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：干馏釜在140～145℃保温1-2h，在240～245℃保温2-3小时，在300～360℃保温1-2小时。

5.  根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是：将合并后的干馏液除杂，得植物干馏液。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：合并后的干馏液采用下述方法除杂：将合并后的干馏液搅拌均匀、静置分层，取上清液；将上清液蒸馏，所得蒸馏液用活性炭处理后过滤，所得滤液即为植物干馏液。

7.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：上清液在100～105℃常压蒸馏2h；蒸馏液加入其质量10%的活性炭在95℃下处理45分钟。

8.  一种植物干馏液，其特征是：按照权利要求1-7中任一项所述的植物干馏液的制备方法制得。

9.  一种促进丹参毛状根有效成分含量的方法，其特征是：将权利要求8的植物干馏液作为诱导子，用于丹参毛状根的组织培养中，促进丹参毛状根有效成分的积累。

10.  根据权利要求9所述的方法，其特征是：植物干馏液与培养基的体积比为1:500-2000。

一种植物干馏液、其制备方法及其在提高丹参毛状根有效成分含量中的应用
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取出来的干馏液及其制备方法和应用，具体涉及一种从山楂核、酸枣核和核桃壳中提起得到的干馏液及其制备方法和在提高丹参毛状根有效成分含量中的应用，属于环境与植物有效成分提取技术领域。
背景技术
随着“回归自然”潮流的涌起，从天然植物中提取、分离具有药用价值的活性成分已成为开发新药的一个重要途径。随着市场需求的不断增加，长期不当采集导致生态环境破坏严重，野生药用植物资源日益锐减。而人工引种栽培困难而且易受环境制约，生长缓慢，其体内的药用成分含量不稳定。这些都成为药用植物扩大规模进军国际市场的一大瓶颈。通过药用植物细胞与组织培养手段来规模化生产植物次生代谢物是一种比较有效的手段，其中需要解决的一个关键问题就是筛选并添加诱导子来提高药用植物细胞或组织中有效次生代谢产物的产量，降低生产成本，实现工业化生产。丹参主要用于治疗心、脑、血管疾病、肥胖及高血脂症，主要药效成分为脂溶性成分（二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）和水溶性成分（丹酚酸B、迷迭香酸）。为了提高丹参有效成分的产量，目前较为常用的方法是用发根农杆菌菌株Agrobacterium rhizogenes诱导丹参叶片获得丹参毛状根，通过继代丹参毛状根获得丹参有效成分。为提高有效成分的含量，多在培养基中添加诱导子，如酵母银离子、茉莉酸甲酯、水杨酸等，这些诱导子多为人工合成，存在成本高、效率低及污染严重等问题，严重制约了药用植物药效成分大规模生产的进程。
干馏液是指将植物材料放到干馏釜内加热炭化过程中冒出的烟气自然冷却液化得到的浓缩液体。近年来，干馏液的医用和食用价值受到重视，广泛用于杀菌、疾病预防、食品防腐、调味、水果保鲜等领域。然而，将干馏液用于中药材培育上鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物干馏液，该植物干馏液能作为丹参毛状根培养中的诱导子，显著提高丹参毛状根培养中有效成分的积累，对加速生产丹参组织培养中有效成分具有重要意义。
本发明的另一目的是提供上述植物干馏液的制备方法，该方法简单、有效，能快速获得所需干馏液。
本发明的另一目的是提供上述植物干馏液在促进丹参毛状根培养中有效成分的含量（积累）的应用。
目前，干馏液主要作为杀菌、抑菌成分用于药物中，在促进中药材有效成分积累中未见报道，发明人在研究中发现，将干馏液加入丹参毛状根培养中作为诱导子能显著提高丹参毛状根中有效成分的含量。并且从实验结果看，不同植物来源的干馏液对提高丹参药效成分积累的影响是不同的，同一干馏液对丹参在植株水平和细胞、组织培养水平中药效物质积累的影响也是不同的，同一干馏液对不同药材的有效成分的积累也是不同的。发明人通过深入研究，将多种干馏液用于丹参毛状根组织培养中，经过大量的筛选实验，最终得到了适合丹参毛状根培养中药效成分积累的干馏液，并具体研究了该干馏液的制备方法和使用方法，从而为将干馏液用于提高丹参毛状根培养中药效成分积累提供了重要的技术支持。
本发明具体技术方案如下：
一种植物干馏液的制备方法，包括将山楂核、酸枣核和核桃壳进行干馏得干馏液的步骤。
上述方法中，进一步包括将山楂核、酸枣核和核桃壳分别在140～145℃、240～245℃、300～360℃下进行干馏，将这三段温度下所得的干馏液合并的步骤。
上述方法中，山楂核、酸枣核和核桃壳的质量比为1～13:1～2:1～3，优选为11:2:2或13:1:1。
上述方法中，在140～145℃保温1-2h，在240～245℃保温2-3小时，在300～360℃保温1-2小时。
上述方法中，进一步的，将合并后的干馏液除杂，得植物干馏液。优选的，合并后的干馏液采用下述方法除杂：将合并后的干馏液搅拌均匀、静置分层，取上清液；将上清液蒸馏，所得蒸馏液用活性炭处理后过滤，所得滤液即为植物干馏液。
上述方法中，上清液在100～105℃常压蒸馏。
上述方法中，上清液蒸馏时间为2h。
上述方法中，蒸馏液加入其质量10%的活性炭。
上述方法中，活性炭在95℃下处理45分钟，进行除杂。
按照上述方植物干馏液的制备方法制得的植物干馏液也在本发明的保护范围之内。
本发明植物干馏液可以用于丹参组织培养中，用于促进丹参毛状根有效成分的含量，步骤包括：将上述植物干馏液作为诱导子，用于丹参毛状根的组织培养中，促进丹参毛状根有效成分的积累。
植物干馏液用于丹参毛状根培养时，除了以植物干馏液作为诱导子外，其他方法均可以参照现有技术。
植物干馏液作为诱导子时，植物干馏液与液体培养基按照1:500-2000的体积比混合，然后将所得混合液用于丹参毛状根的培养中，优选按照1:1000的体积比混合。
本发明将山楂核、核桃壳、酸枣核这三种植物的核、壳进行干馏得到干馏液有效成分，通过他们之间的协同作用起到了很好的提高丹参毛状根组织培养中药效成分含量的作用，经济效益高。此外，本发明干馏液制备方法操作简单，简洁快速，易于实现，所用原料为植物废弃物，实现了废物的充分利用，变废为宝，成本低，便于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限制。
实施例1
分别取山楂核、酸枣核和核桃壳2kg，以质量比为1:1:1加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例2
分别取山楂核、酸枣核和核桃壳1 kg，以质量比为1:1:1加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例3
分别取山楂核、酸枣核和核桃壳共计1.5kg，以质量比为1:1:1加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例4
取山楂核、酸枣核和核桃壳共计1.5 kg，质量比为3:1:1加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例5
取山楂核、酸枣核和核桃壳共计1.5 kg，质量比为6:2:3加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例6
取山楂核、酸枣核和核桃壳共计1.5 kg，质量比为11:2:2加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
实施例7
取山楂核、酸枣核和核桃壳共计1.5 kg，质量比为13:1:1加入干馏釜，加热至140～145℃，保温1小时、继续加热至240～245℃，保温2小时，然后温度升至300～360℃维持1小时。收集各时段的干馏液，混合搅拌30分钟，转入分液漏斗中静置12小时，分出上清液。将上清液加入蒸馏釜，于100～105℃蒸馏2小时，收集蒸馏液。蒸馏液加入10wt%的活性炭，搅拌加热至95℃，维持45分钟，过滤，收集过滤液。滤液即为本发明的植物干馏液。
对比例1
按照实施例3的方法制备干馏液，不同的是，所用的植物源为：橡木（Magnolia denudata）、国槐（Sophora japonica）、黄刺玫（Rosa xanthina Lindl）这三种植物的树干，他们的质量比是1:1:1。
对比例2
按照实施例3的方法制备干馏液，不同的是，所用的植物源为：紫荆（Cercis chinensin Bunge）、垂柳（Salix babylonica）、楝树（Melia azedarach）这三种植物的树干，他们的质量比是1:1:1。
应用例
丹参毛状根的培养：丹参毛状根是用发根农杆菌菌株Agrobacterium rhizogenes诱导丹参叶片获得，并在无激素的6-7V液体培养基中进行继代培养。精确称取0.5g毛状根接种于装有50mL液体培养基的250 mL三角瓶中作为受试材料，置于25℃，110-120 r×min^-1摇床上避光培养。
将植物干馏液和6-7V液体培养基按照1:500、1:1000和1:2000的体积比配成干馏液溶液，将培养18天的丹参毛状根分别用干馏液溶液进行处理；同时将丹参毛状根仅采用6-7 V液体培养基进行处理，作为对照，每个处理6个重复。处理3d后将毛状根从液体中取出，迅速用吸水纸吸干水分，进行冷冻干燥以备药效成分含量的测定。
按照上述方法将实施例3、4、5、6、7，对比例1、2的植物干馏液分别与6-7V液体培养基稀释成1:500、1:1000和1:2000的干馏液溶液，然后用于丹参毛状根的培养中，观察丹参毛状根生长及有效物质积累情况，其中实施例3、4、5、6、7作为实验组，对比例1、2作为阴性对照组，直接采用6-7 V液体培养基的作为空白对照组。各组丹参毛状根培育方式一致，不同的是：实验组分别用实施例3、4、5、6、7的植物干馏液处理；阴性对照组分别用对比例1、2的植物干馏液处理；空白对照组不用干馏液，仅用6-7 V液体培养基培养丹参毛状根。  
丹参主要用于治疗心、脑、血管疾病、肥胖及高血脂症，主要药效成分为脂溶性成分（二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）和水溶性成分（丹酚酸B、迷迭香酸）。因此，此实验中以测定上述药效成分含量的方式来判断丹参药效成分的积累。  
脂溶性成分含量的测定：
色谱条件：色谱柱为C₁₈柱(4.6 mm × 250 mm，1.7 μm)。流动相为0.2%乙酸-乙腈（45:55）；流速：0.8 mL·min^-1；进样量为10 mL；洗脱时间65 min；检测波长为270 nm，柱温：25 ℃。
对照品的配制：分别精密称取对照品二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA（均购自中国药品生物制品检定所）置于棕色量瓶中，以乙醇为溶剂，配制成单组分对照品溶液，再配制混合对照品溶液，其中二氢丹参酮0.020 μg·mL^-1、隐丹参酮0.076μg·mL^-1、丹参酮Ⅰ0.076μg·mL^-1、丹参酮ⅡA 0.068μg·mL^-1。取上述混合对照品溶液1、2、6、10和20 μL，按色谱条件进样，以色谱峰面积和对应的浓度做标准曲线，计算回归方程。  
供试液的制备：取干燥至恒重的丹参毛状根，研磨过40目筛，混匀。取粉末约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇5mL，精密称重，超声（300 W，25 kHz）提取40min，放冷，再称定重量，加甲醇补重，摇匀，过滤，定容备用。
 水溶性成分含量测定:
色谱条件：色谱柱为C₁₈柱(4.6 mm × 250 mm，1.7 μm)。流动相为0.2%乙酸（A）～乙腈（B），洗脱梯度为0 min（95%A～5%B），30 min（65%A～35%B），31 min（0% A～100%B），36 min（0%A～100%B），37min（95%A～5%B），43min（95%A～5%B）；流速：1 ml·min^-1；检测波长为280 nm；柱温：25℃。  
对照品的配制：分别精密称取对照品迷迭香酸、丹酚酸B标准品（均购自中国药品生物制品检定所）置于棕色量瓶中，以乙醇为溶剂，配制成单组分对照品溶液，再配制混合对照品溶液，其中迷迭香酸0.3 μg·mL^-1、丹酚酸B 3.0 μg·mL^-1。分别精密吸取标准品溶液2、5、10、20和40 μL注入Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦），以色谱峰面积和对应的浓度做标准曲线，计算回归方程。
供试液的制备同上述脂溶性成分检测中供试液的制备。
各组丹参毛状根按照上述方法培养3天后有效成分含量如下所示：

从上述表1 的数据可以看出，本发明实施例3、4、5、6、7的干馏液与空白对照相比均能不同程度的促进丹参有效成分的积累，且通过他们之间的对比可以看出，实施例6和实施例7的促进作用较显著，实施例4、5次之。通过本发明干馏液与对比例干馏液的对比可以看出，本发明制备方法所得的干馏液都能很好的促进丹参中丹参酮I、参酮IIA、隐丹参酮、迷迭香酸和丹酚酸B的积累，而对比例的干馏液促进作用不明显。