一株可降解盐环境中多环芳烃的海旋菌及其应用.pdf

本发明公开了一株可降解盐环境中多环芳烃的海旋菌及其应用。本发明提供了一株海旋菌TSL5-1，其保藏号为CGMCC No.10278。还提供了海旋菌或其菌悬液或其培养产物或其发酵产物在降解多环芳烃中的应用。本发明的实验证明，与现有的技术相比，本发明的海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)可在盐环境中，分别以菲、芘、荧蒽、苯并芘与苯并蒽等多环芳烃化合物作为唯一碳源和能源生长繁殖。

1.  一株海旋菌TSL5-1，其保藏号为CGMCC No.10278。

2.  权利要求1所述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物或其发酵产物在降解盐环境中的多环芳烃中的应用。

3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多环芳烃为芘、菲、荧蒽、苯并芘和/或苯并蒽。

4.  根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述盐环境的盐度为0.5-20.0％。

5.  根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：所述盐环境的盐度为3.5-5.0％。

6.  一种降解多环芳烃的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物降解盐环境中的多环芳烃。

7.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述降解为将权利要求1所述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物接种于被多环芳烃污染的盐环境中，实现多环芳烃的降解。

8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述盐环境的盐度为0.5-20.0％，具体为3.5-5.0％。

9.  根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述多环芳烃为芘、菲、荧蒽、苯并芘和/或苯并蒽。

10.  一种降解盐环境中多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物或其发酵产物；所述多环芳烃类有机污染物为菲、芘、荧蒽、苯并蒽和/或苯并芘；
所述盐环境的盐度为0.5-20.0％，具体为3.5-5.0％。

一株可降解盐环境中多环芳烃的海旋菌及其应用
技术领域
本发明属于环境污染生物处理技术领域，具体涉及一株能在盐环境中降解多环芳烃类有机污染物的海旋菌株及其应用。
背景技术
多环芳香烃化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类由两个或两个以上苯环以线性、角状或者簇聚等不同方式排列形成的有机化合物。PAHs污染物在空气、水体、土壤及其沉积物等环境介质中广泛分布。环境中的PAHs主要来源于自然界的活动(例如森林火灾、动植物遗体腐烂、石油煤炭形成、火山喷发等)和人类活动(如木材加工、石油冶炼、运输业、煤气制造、军事设施、危险物处理和填埋等)。多环芳烃大多数为有毒物质，许多甚至具有三致效应(致癌、致畸变和致突变)，迄今为止已发现的多环芳烃类致癌物及其衍生物已经超过400种，其中不乏苯并芘等这样的强致癌物质。由于多环芳烃类物质具有低水溶解性、亲脂性、难降解性和高生物蓄积性等特性，使得其可以在环境中长期稳定的存在，并且能长距离迁移，最终富集于生物体中，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。因此，上世纪80年代美国环保局(USEPA)就将16种未带分支的PAHs列入了环境优先控制污染物的黑名单，而我国国家环保局在第一批公布的68种优先控制的污染物中就包含了7种PAHs。因此，控制和去除环境中的多环芳烃具有重要的理论和现实意义。
环境中的多环芳烃除少部分可以发生光化学分解外，大部分主要依赖微生物降解途径慢慢消失。自上世纪70年代开始，研究人员就尝试利用微生物技术对受PAHs污染的土壤进行修复(受菲、芘或五氯苯酚污染土壤的蚯蚓强化修复方法，专利号200910184601.1)，80年代科学家认识到微生物技术是修复PAHs污染最有前景的技术，并将其应用于石油污染环境的修复。然而，近些年来科学家们发现多环芳烃污染常常发生在盐浓度较高的环境中，例如由于石油的突发事故、落地油及含油污水排放等造成的盐碱滩环境的污染；同时，含油和含盐量都比较高(盐度>3.5％w/v)的油田采出水的排放，会使接纳环境中的盐度和多环芳烃含量同时升高，形成污染。在这些特殊的盐环境中，普通的多环芳烃高效降解菌株由于难以在较高的盐浓度条件中生长而不能发挥作用，因而嗜盐多环芳烃高效降解菌株的筛选与应用有着迫切的需求与重要的现实意义。
目前已发现并报道的多环芳烃降解菌种嗜盐微生物较少，多集中于假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、分支杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等。Ashok等从炼油厂附近的土壤中筛选出了四株能耐受7.5％NaCl，且 能利用萘、蒽以及能利用萘与菲进行共代谢的菌株，经鉴定它们属于微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和产碱菌属(Alcaligenes)。Sohn等从韩国某海域淤泥中分离到一株能降解2-5个苯环的多环芳烃的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumpentaromativorans)，其能在盐度为1％-6％的丰富培养基中生长。Plotikova等从盐土环境中分离到了15株萘降解菌，有红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)，它们能够耐受5.8％NaCl，其中6株还能利用菲；通过对其中部分含质粒的菌株进行转化改造，获得了两株含有外源质粒的恶臭假单胞菌，其耐盐性有所提高，而且能够降解萘、菲和水杨酸。赵百锁等(一株可降解多环芳烃的海旋菌及其应用，专利号200910080014.8)从高盐度的石油污染土壤中分离得到一株能够高效降解菲的海旋菌(Thalassospiraxianhensis P-4)，在盐度为5％，加有酵母粉的液体培养基中，9天内对菲(初始浓度为100mg/L)的平均降解速率可达10.8mg/(L·d)。由于高环芳香烃的化学结构复杂、水溶性差、热稳定性强、生物可利用性低，高环芳香烃的降解嗜盐菌株的研究就更少了，如目前对于高环芳烃代表物——芘的嗜盐或耐盐降解菌的研究仅限于分支杆菌属(Mycobacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、解环菌属(Cycloclasticus)和海杆菌属(Marinobacter)。最早的一株芘降解耐盐菌株是由Heitkamp等在上世纪90年代从Redfish Bay河口石油污染的沉积物中分离得到的。Cui等从黄海的沉积物中分离得到了三株能降解高环芳烃的嗜盐菌，它们属于解环菌属(Cycloclasticus)。可以看出用于盐环境中多环芳香烃污染修复的微生物有效资源仍然相对匮乏。多环芳烃降解海旋菌Thalassospiratepidiphila sp.nov.1-1B^T(JCM 14578^T＝DSM 18888^T)和Thalassospiraxianhensis sp.nov.P-4^T(CGMCC 1.6849^T＝JCM 14850^T)并不能降解荧蒽、苯并芘和苯并蒽。
可见，这些微生物耐盐范围都相对窄，而且耐受浓度低。多数耐盐微生物只对低环芳香烃有较高的降解性能，不能适用于高盐环境中高环芳香烃污染的生物治理。因此，为解决高盐环境中多环芳烃的污染，亟待研发耐盐范围广、降解效率高的嗜盐性多环芳烃降解菌株。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株海旋菌。
本发明提供的一株海旋菌TSL5-1，其保藏号为CGMCC No.10278。
上述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物或其发酵产物在降解盐环境中的多环芳烃中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述多环芳烃为芘、菲、荧蒽、苯并芘和/或苯并蒽。
上述应用中，所述盐环境的盐度为0.5-20.0％。
上述应用中，所述盐环境的盐度为3.5-5.0％。
本发明的另一个目的是提供一种降解多环芳烃的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物降解盐环境中的多环芳烃。
上述方法中，所述降解为将上述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物接种于被多环芳烃污染的盐环境中，实现降解多环芳烃。
上述方法中，所述盐环境的盐度为0.5-20.0％，具体为3.5-5.0％。
上述方法中，所述多环芳烃为芘、菲、荧蒽、苯并芘和/或苯并蒽。
本发明第三个目的是提供一种降解盐环境中多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂，其活性成分为上述的海旋菌或其菌悬液或其培养产物或其发酵产物；所述多环芳烃类有机污染物为菲、芘、荧蒽、苯并蒽和/或苯并芘；
所述盐环境的盐度为0.5-20.0％，具体为3.5-5.0％。
本发明所提供的高效降解菌——海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1)，已于2015年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.10278，分类命名为海旋菌Thalassospira sp.。
与现有的技术和现有多环芳烃降解菌株相比，本发明的海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)能够在更高盐度下和更大的盐度范围内生长(0.5-20％盐度)，且能在上述盐环境中分别以种类更多、结构更复杂的多环芳烃化合物(包括菲、芘、荧蒽、苯并芘与苯并蒽等)作为唯一碳源和能源生长繁殖，并能更高效地降解这些污染物。在5％盐浓度的纯培养体系中，海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)能够在7天内将40mg/L的菲完全降解；能在25天内将20mg/L的芘或荧蒽降解40.0％左右，甚至能够降解22.1％的苯并蒽(8mg/L)和14.4％的苯并芘(8mg/L)。因此，本发明的海旋菌对控制盐环境中多环芳烃的污染有着独特的优势，在治理盐环境中多环芳香烃污染中具有巨大的应用价值。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。
附图说明
图1是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的扫描电子显微镜图像。
图2是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的透射电子显微镜图像。
图3是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的16S rRNA基因序列的系统发育树。
图4是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的细胞生长与芘的降解曲线关系图。
图5是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)在不同盐度条件下对芘的降解效率。
图6是海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)对多种多环芳香烃的降解效率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的分离鉴定
采用来自胜利油田长期受石油污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：
1)取5.0g土壤，加入到盐度为5.0％的MSM培养基(芘(20mg/L)为唯一碳源与能源的矿物盐)中，30℃，170rpm恒温震荡培养；驯化15天后，取培养菌液以10％的接种量转接到芘浓度依次提高的新鲜培养基中，在相同的培养条件下进行传代。如此连续传代5次。
其中盐度为5.0％的MSM培养基组成为：3.0g/L Na₂SO₄，0.3g/L NH₄Cl，0.15g/L CaCl₂·2H₂O，0.2g/L KH₂PO₄，0.5g/L KCl，50g/L NaCl，7.5g/L MgCl₂·6H₂O，1.0ml/L微量元素溶液，2ml/L维生素溶液；
微量元素溶液成份为：10ml/L HCl(25％)，1.5g/L FeCl₂·4H₂O，190mg/L CoCl₂·6H₂O，100mg/L MnCl₂·4H₂O，70mg/L ZnCl₂，62mg/L H₃BO₃，36mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，24mg/L NiCl₂·6H₂O，17mg/L CuCl₂·2H₂O；
维生素溶液组成为：40mg/L 4-氨基苯甲酸，10mg/L生物素，100mg/L烟酸，50mg/L半侧钙D-(+)-泛酸钙，150mg/L盐酸吡哆辛，100mg/L氯化硫胺素盐酸盐，50mg/L维生素B₁₂，10mg/L DL-6,8-硫辛酸，10mg/L核黄素，4.0mg/L叶酸。
2)取上述0.1mL的传代培养液，将菌液涂布到含有芘(丙酮为溶剂)的MSM固体平板上，30℃静止培养，直至菌落长出。挑取平板上长出来的单菌落在含有芘的MSM固体平板划线培养。多次划线培养后，分离得到纯菌单菌落；
3)最终挑取上述纯菌单菌落，接种到盐度为5.0％的以芘(20mg/L)为唯一碳源与能源的无机盐培养基MSM中，30℃，170rpm恒温震荡培养5天，培养液变浑浊，获得本发明的菌株。
进一步对上述步骤筛选得到的菌株进行形态学、生长特性、生理生化特征及分子生物学鉴定。
一、菌株的形态特征
将分离得到的菌株接种至盐度为5.0％的以芘(20mg/L)为唯一碳源与能源的矿物盐培养基MSM固体平板上，待细胞生长至对数生长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态等。
取上述处于对数生长期的培养细胞，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态，结果如图1和图2所示，同时，进行革兰氏染色，于10×40倍光学显微镜下观察。
结果表明，筛选到的菌株培养2天后，在平板上形成直径约为0.5-0.7mm、光滑、隆起、微黄色、有光泽、边缘整齐的圆形菌落；在显微镜下观察，菌体细胞呈杆状，不形成芽孢，无鞭毛，大小为0.90-1.15μm×0.32-0.45μm，为革兰氏阴性。
二、菌株的生长特性
分离得到的菌株属于兼性厌氧菌，最适生长pH范围为7.3-8.0，可生长pH范围为4.0-10.0；最适生长温度范围为25-30℃，可生长温度范围为15-37℃。除此之外，该菌株属于嗜盐微生物，能在0.5-20.0％的盐度范围内进行生长繁殖，最适宜生长的盐度范围为3.5-5.0％。
三、菌株的生理生化特征
1.碳源利用
以MSM培养基为基本培养基，另包括以Biolog通用的95种碳源的糖、醇、酸作为唯一的碳源，检测菌株细胞的生长。
2.明胶水解
将明胶水解培养基调pH为7.2-7.4，分装于试管中，保证培养基的高度约为4.0-5.0cm。将分离筛选得到的菌株穿刺接种于上述培养基中，20℃培养2天后观察结果。若培养基部分或者全部变成可流动的流体，则菌株为明胶水解阳性菌株；若培养3-4周后，培养基仍为固态，则菌株为明胶水解阴性菌株。其中明胶水解培养基的组成为：5.0g/L蛋白胨、100-150g/L明胶，pH 7.2-7.4。
3.吐温水解
将筛选得到的菌株接种于盐度为5.0％以吐温(吐温40或吐温80，终浓度为1.0％)为唯一碳源的固体MSM培养基平板上，每个平板点接3-5株，30℃培养2-4天。若菌落周围有白色晕圈出现，则该菌株为吐温水解阳性。
4.氧化酶活性
将筛选到的菌株接种于MSM固体培养基上，30℃培养24h。在一干净的培养皿内放一张“新华1号”定性滤纸，滴加质量百分含量为1.0％的四甲基对苯二胺盐酸盐溶液使滤纸浸湿，用竹签挑取菌苔，在滤纸上划线。1min之内滤纸变红色者为阳性反应，反之为阴性反应。
5.过氧化氢酶活性
将筛选到的菌株接种于MSM固体培养基斜面上，30℃培养24h。以铂丝接种环取一小环斜面培养物于已滴有3.0％过氧化氢的玻片上，立即观察结果。若在5min之内出现气泡者为阳性反应；无气泡出现者为阴性反应。
6.脲酶活性
在盐度为5.0％的MSM培养基中加入酚红，调节pH值，使溶液呈橙黄色，0.06MPa灭菌20min，待培养基冷却至40-50℃时加入过滤除菌的尿素溶液，使其在培养基中的终浓度为2.0％，制作试管斜面。将筛选得到的菌株划线接种于上述试管斜面上，30℃培养2-4天后观察结果。若培养基变成粉红色为阳性，反之则为阴性反应。
7.硝酸盐还原反应
硝酸盐还原能力检测培养基的组成为：10g/L蛋白胨，10g/L琥珀酸钠，1.0g/LNaNO₃，1.0g/L K₂HPO₄，0.5g/L MgSO₄，0.2g/L KCl，pH 7.2。
将筛选得到的菌株接种于上述培养基中，分别在接种2、5和7天后检测硝酸盐还原情况，以不接种筛选得到的菌株的培养基为空白对照。
具体的检测方法如下：在白色比色皿中加入一滴含有筛选得到的菌株的菌液，再加入Griess试剂A、B各一滴，如出现粉红、玫瑰红、橙色或棕色，则表明硝酸盐被还原成亚硝酸；如加入Griess试剂后无颜色变化，可加入二苯胺试剂3～5滴，若出现蓝色反应，说明培养液中的硝酸盐依然存在，则该菌为硝酸盐还原反应阴性菌；如果加入二苯胺试剂后无任何颜色出现，则说明亚硝酸盐被进一步分解为其他产物，待测菌株仍为硝酸盐还原反应阳性菌。
8.反硝化反应
反硝化反应活性检测培养基组成为：100mL含1.0g KNO₃的普通肉汁胨培养液，pH 7.2-7.4。
将上述培养基分装于试管中，保证每管培养基高度约为5cm，121℃灭菌30min，冷却待用。将筛选得到的菌株用接种环接种于上述试管中，用凡士林油封管，同时以封油的不含硝酸钾的培养基作对照。培养1～7天后，观察含有硝酸钾的培养基中有无生长和是否产生气泡。如产生气泡表示有反硝化作用产生氮气，是阳性反应，但如不含硝酸钾的对照培养基也产生气泡则只能按可疑或阴性处理；如不产气泡，则为阴性反应。
以上实验结果表明，筛选得到的菌株能够利用葡萄糖进行发酵产酸；能水解明胶、吐温40和吐温80，不能水解淀粉；具有氧化酶活性、过氧化氢酶活性和脲酶活性，能使硝酸盐还原，但却不具有亚硝酸盐还原能力；该菌株能以L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、蔗糖、丙酮酸甲酯、纤维二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、甘露醇为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
四、菌株的分子生物学鉴定
提取筛选得到的菌株的总DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物(正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rRNA基因序列PCR扩增。PCR反应条件为：95℃10min孵育变性。然后以95℃30s，使模板DNA充分变性，56℃30s复性，72℃90s延伸为一个循环，共进行30个循环；最后72℃延伸5min，冷却至4℃。
将上述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，挖胶分离纯化后连接到PMD-T载体上进行测序；将测序结果在NCBI GeneBank数据库进行序列Blast比对，运用MEGA(2.1)软件以近邻结合法和最大简约法进行系统发育分析。
结果表明，本发明筛选得到的菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。在NCBI的GenBank数据库进行Blast比对，发现其与海旋菌MCCCC 1A01288(Thalassospira sp.MCCCC 1A01288，GenBank登录号为EU440806)、深海海旋菌mj01-PW1-OH20(Thalassospiraprofundimarismj01-PW1-OH20，GenBank登录号为HQ425693)、ThalassospirapovalilyticaZumi 95(GenBank登录号为NR_125450)的16SrRNA基因序列的相似性均高达99％。其16S rRNA基因序列的系统发育树如图3所示。因而，结合该菌株的形态特征、生理生化特征，判定本发明所筛选到的菌株属于海旋菌属(Thalassospira)，命名为海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1)
基于以上特征，将海旋菌TSL5-1鉴定为海旋菌属(Thalassospira)。该菌株已于2015年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10278，分类命名为海旋菌Thalassospira sp.。
实施例2、海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)降解芘的性能
1)含有芘的培养基(芘为唯一碳源和能源)：将芘溶于丙酮中，过滤除菌，然后加入到盐度为5.0％的MSM培养基中，使得芘在培养基中的终浓度为20mg/L；
2)细菌接种液：挑取实施例1得到的海旋菌TSL5-1CGMCC No.10278接种于含有芘的培养基中，震荡培养7天后。取培养液以5000rpm离心10min，去上清，离心洗涤三次，重悬于新鲜MSM培养基中，使得菌液的OD₆₀₀约为0.25，作为降解实验的接种菌 液待用。
3)菌株生长和芘降解实验：将上述接种菌液按照20％接种量接种于1)中的培养基中，30℃震荡培养。分别在第0d、2d、3d、5d、7d、10d、15d、25d取样，分别测定芘残余量与培养液的OD₆₀₀吸光度。芘的残余量的测定方法为：向所取样品中加入10mL的二氯甲烷，120rpm震荡5min，以充分萃取吸附在菌体表面的颗粒物，然后过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱法(高效液相色谱，岛津，10Avp；色谱柱为C18反相柱(依利特，Hypersil BDS C18，250mm×4.6mm×5μm)，测定时间20min；流动相为90％甲醇；流速为1.0mL·min-1；柱温为35℃；进样量为20μL；检测波长254nm。)测定滤液中芘的浓度。以接种灭活菌液的上述培养基为空白对照，每个取样点均有三个平行样。
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的芘含量/培养基中芘初始总含量)×100％
海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)的生长曲线和芘降解曲线如图4所示。结果表明，海旋菌TSL5-1对芘的降解与其生长基本同步。在最初2d内，碳源芘几乎不被消耗，海旋菌TSL5-1处于延滞期。从第3d开始，菌株快速生长，细胞数量急剧增加，培养基中芘的含量也开始降低；培养到第7d时，细胞生物量达到最大值(OD₆₀₀＝0.31)，此时芘的降解率为23.3％。培养10d后，菌株数量增长减慢，细胞数量不断减小，培养基中的芘降解缓慢。经过25d的培养，芘的降解率达到41.2％。对照组中未见芘的降解。由此可见，海旋菌TSL5-1能够有效降解盐环境中的芘，可用于芘污染环境的生物修复。
实施例3、海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)在不同盐度下对芘的降解性能
1)不同盐度的含有芘的培养基(芘为唯一碳源和能源)：将芘溶于丙酮中，过滤除菌，然后分别加入到盐度为0.5％，1.5％，3.5％，5％，9.5％和19.5％的MSM培养基(各盐度培养基的配制参考5.0％盐度的MSM培养基，根据盐度要求相应地调整NaCl的添加含量)中，使得芘在培养基中的终浓度为20mg/L；
2)细菌接种液：挑取实施例1得到的海旋菌TSL5-1CGMCC No.10278接种于含有芘的培养基中，震荡培养7天后。取培养液以5000rpm离心10min，去上清，离心洗涤三次，重悬于新鲜MSM培养基中，使得菌液的OD₆₀₀约为0.25，作为降解实验的接种菌液待用。
3)不同盐度条件下，芘降解实验：将上述接种菌液按照20％接种量分别接种于1)中的各个盐度的培养基中，30℃震荡培养，在25天后取样，分别测定芘残余量。芘的残余量的测定方法为：向所取样品中加入10mL的二氯甲烷，120rpm震荡5min，以充 分萃取吸附在菌体表面的颗粒物，然后过0.22μm滤膜，利用高效液相色谱法((高效液相色谱，岛津，10Avp；色谱柱为C18反相柱(依利特，Hypersil BDS C18，250mm×4.6mm×5μm)，测定时间20min；流动相为90％甲醇；流速为1.0mL·min-1；柱温为35℃；进样量为20μL；检测波长254nm。)测定滤液中芘的浓度。以接种灭活菌液的上述培养基为空白对照，每个取样点均有三个平行样。
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的芘含量/培养基中芘初始总含量)×100％
海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)在不同盐度条件想的芘降解曲线如图5所示。结果表明，海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)能够在盐度范围为0.5％～19.5％的条件下降解芘，其中在盐度为3％～5％时，其对芘的降解率高达43％左右。由此可见，海旋菌TSL5-1能够在广盐度范围内有效降解芘，可用于芘污染的盐环境的生物修复。
实施例4、海旋菌TSL5-1(Thalassospira sp.TSL5-1，CGMCC No.10278)降解多种多环芳烃的性能
1)含有单一多环芳烃的培养基
含有菲的培养基：将菲溶于丙酮中，过滤除菌，然后加入到盐度为5.0％的MSM培养基中，使得菲在培养基中的终浓度为40mg/L；
含有荧蒽的培养基：将荧蒽溶于丙酮中，过滤除菌，然后加入到盐度为5.0％的MSM培养基中，使得荧蒽在培养基中的终浓度为20mg/L；
含有苯并芘的培养基：将苯并芘溶于丙酮中，过滤除菌，然后加入到盐度为5.0％的MSM培养基中，使得苯并芘在培养基中的终浓度为8mg/L；
含有苯并蒽的培养基：将苯并蒽溶于丙酮中，过滤除菌，然后加入到盐度为5.0％的MSM培养基中，使得苯并蒽在培养基中的终浓度为8mg/L。
2)细菌接种液
将实施例1得到的海旋菌TSL5-1CGMCC No.10278分别接种于上述1)中含有各种单一多环芳烃的培养基中，震荡培养7天后。取培养液以5000rpm离心10min，去上清，离心洗涤三次，重悬于新鲜MSM培养基中，使得菌液的OD₆₀₀约为0.25，作为降解实验的接种菌液待用。
3)单一多环芳烃降解实验：将上述接种菌液按照20％接种量分别接种于1)各种含有单一多环芳烃的培养基中，30℃震荡培养。分别在第15d和25d取样，利用高效液相色谱测定(高效液相色谱，岛津，10Avp；色谱柱为C18反相柱(依利特，Hypersil BDS C18，250mm×4.6mm×5μm)，测定时间20min；流动相为90％甲醇；流速为1.0mL·min-1；柱温为35℃；进样量为20μL；检测波长254nm。)各降解体系中单一多 环芳烃的残余量。以接种灭活菌液的上述培养基为空白对照，每个取样点均有三个平行样。
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的菲量/培养基中菲初始总含量)×100％
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的荧蒽量/培养基中荧蒽初始总含量)×100％
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的苯并芘量/培养基中苯并芘初始总含量)×100％
降解率的计算公式：降解率＝(1-培养基中残留的苯并蒽量/培养基中苯并蒽初始总含量)×100％
结果如图6所示，海旋菌TSL5-1除了能在盐环境下降解芘以外，还能有效降解菲、荧蒽、苯并蒽和苯并芘。在盐度为5％的条件下，海旋菌TSL5-1在7d内，就能将40mg/L的菲完全降解(数据未显示)，表现出较强的低环芳烃降解能力；海旋菌TSL5-1对荧蒽(20mg/L)的降解率在培养15d后达到35.0％，在25d后增大至42.3％(与芘的降解率41.2％相近)。同时，海旋菌TSL5-1亦能降解五环的苯并芘和苯并蒽(8mg/L)，培养25d后，苯并芘和苯并蒽的降解率分别达到14.4％和22.1％。
由此可见，海旋菌TSL5-1对盐环境中高环芳烃的降解有着独特的优势，可广泛用于盐环境多环芳烃污染的生物修复。