抗肿瘤中药提取物的提取方法和应用.pdf

本发明提供了一种抗肿瘤中药提取物的提取方法和应用，属于中药领域。该抗肿瘤中药提取物的提取方法包括以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，进行乙醇回流提取，并将得到的提取液进行浓缩、干燥，得到抗肿瘤中药提取物。该抗肿瘤中药提取物能够提高HT-29和SW620细胞G1期细胞的百分率，并且能够降低该肿瘤细胞S期和G2期细胞的比率，具有诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞，并抑制该两种肿瘤细胞的增殖能力的效果；另外，该抗肿瘤中药提取物处理结肠癌细胞后，会使得活化形式的caspase-3和caspase-9表达量增加，并且会提高促进细胞凋亡蛋白的表达量，降低抑制细胞凋亡蛋白的表达量。

1.  一种抗肿瘤中药提取物的提取方法，其特征在于，包括以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，进行乙醇回流提取，并将得到的提取液进行浓缩、干燥，得到抗肿瘤中药提取物。

2.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)、以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，用体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-21倍的乙醇回流提取，得到提取液；
2)、将所述提取液浓缩，得到稠膏；
3)、将所述稠膏烘干，得到抗肿瘤中药提取物。

3.  根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，所述原料包括荷青花、多裂荷青花或锐裂荷青花中的一种或多种。

4.  根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，所述原料包括等重量的荷青花、多裂荷青花或锐裂荷青花。

5.  根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，在步骤3)中，所述烘干的温度为65-75℃。

6.  根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，在步骤3)中，具体包括：
将所述稠膏烘干后，进行粉碎，得到粉末状抗肿瘤中药提取物。

7.  根据权利要求3-6任一项所述的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，具体包括：
a)、以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，以体积浓度为60-80％、且质量为所述原料19-21倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；
b)、在所述第一提取药渣中加入体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-19倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；
c)、在所述第二提取药渣中加入体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-19倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；
d)、将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液。

8.  根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，在步骤d)之后还包括：
将所述第三提取药渣干燥后回收。

9.  权利要求1-8任一项所述的提取方法提取的中药提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.  权利要求1-8任一项所述的提取方法提取的中药提取物在制备通过上调肿瘤细胞p21蛋白表达，并抑制Cdk-4/Cdk-6-cyclin D1复合物的活性，使细胞周期停滞于G₁期的抗肿瘤药物中的应用。

抗肿瘤中药提取物的提取方法和应用
技术领域
本发明涉及中药领域，具体而言，涉及一种抗肿瘤中药提取物及其提取方法和应用。
背景技术
我国幅员辽阔，自然条件多样，分布着极为丰富的传统药物资源，是世界上天然药物资源种类最多，栽培历史最悠久的国家。且有许多地道药材驰名中外，并出口到100多个国家和地区。
中草药具有取材天然，作用平稳，毒副作用小等西药无法比拟的独特优点，随着社会的进步，生产力的发展，人们越来越追求健康长寿，现代人越来越把注意力从化合成药转向天然药，希望从天然药中开发出更为安全有效的新药以替代前者，从而减少药源疾病的发生。因此，发展中草药不仅传承了中华民族千百年的精华，也具有广大的市场前景及经济效益。
另外，中草药是天然物质，保持了各种成分的自然性和生物活性，其成分易被吸收利用，不能被吸收的也能顺利排出体外，在体外被细菌等分解。其毒副作用小，并且动物机体不产生抗药性；而一般的化学药物成分会积累在机体内或长期残留；对动物机体具有较大的毒副作用。
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，是目前医学领域中颇为难治的疾病，而且随着人们工作压力的加大，环境污染的加剧等因素，肿瘤呈现出多发趋势。而 传统的肿瘤(恶性肿瘤)治疗多采用西药、放疗、化疗或手术等手段，费用昂贵，且对机体的损伤很大；因此，从中药草为出发点，提供一种具有抗肿瘤药物及其制备方法是人们亟待解决的一个技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗肿瘤中药提取物的提取方法，该方法以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，实现了抗肿瘤中药提取物的制备。该抗肿瘤中药提取物能够提高HT-29和SW620细胞G1期细胞的百分率，并且能够降低该肿瘤细胞S期和G2期细胞的比率，具有诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞，并抑制该两种肿瘤细胞的增殖能力的效果。
本发明的第二目的在于提供上述的方法提取的抗肿瘤中药提取物的用途。
该抗肿瘤中药提取物处理结肠癌细胞后，会使得活化形式的caspase-3和caspase-9表达量增加，并且会提高促进细胞凋亡蛋白的表达量，降低抑制细胞凋亡蛋白的表达量；因此可用于制备抗肿瘤药物中的应用中。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种抗肿瘤中药提取物的提取方法，包括以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，进行乙醇回流提取，并将得到的提取液进行浓缩、干燥，得到抗肿瘤中药提取物。
本发明的这种提取方法，实现了抗肿瘤中药提取物的制备，罂粟科、荷青花属植物的根茎富含大量的生物碱，其根茎本身具有祛风湿、止血、止痛、舒筋活络、散瘀消肿等功效。而经过回流提取 后，浓缩以及干燥后，发现其提取物具有抗肿瘤的效果，该抗肿瘤中药提取物能够提高HT-29和SW620细胞G1期细胞的百分率，并且能够降低该肿瘤细胞S期和G2期细胞的比率，具有诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞，并抑制该两种肿瘤细胞的增殖能力的效果。另外，该提取物还具有提高促进细胞凋亡蛋白的表达量，降低抑制细胞凋亡蛋白的表达量的效果，同时还会降低结肠癌细胞中ERK1/2信号通路蛋白活性，使得结肠癌细胞中磷酸化的ERK1/2和磷酸化的MEK1/2的表达量就下降，从而通过抑制ERK1/2信号转导通路降低肿瘤细胞增殖。而且，该提取物的原料来源广泛，且无副作用，因此可很好的应用于抗肿瘤药物的制备应用中。
可选的，该提取方法具体包括以下步骤：
1)、以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，用体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-21倍的乙醇回流提取，得到提取液；
2)、将所述提取液浓缩，得到稠膏；
3)、将所述稠膏烘干，得到抗肿瘤中药提取物。
利用体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-21倍的乙醇可尽可能充分地将根茎原料中的有效成分提取完全。
可选的，在步骤1)中，所述原料包括荷青花、多裂荷青花或锐裂荷青花中的一种或多种。
上述锁具的三种具体植物种，其根茎的药用价值大，所含的有效成分丰富，因此，可作为优选的提取原料。
可选的，在步骤1)中，所述原料包括等重量的荷青花、多裂荷青花或锐裂荷青花。
将以上三种原料均按照相同的重量进行回流提取，使得得到的提取物的有效成分丰富全面，具有更佳的抗肿瘤效果。
可选的，在步骤3)中，所述烘干的温度为65-75℃。
在该温度范围内进行烘干操作，可减少浓缩液中有效成分的破坏，从而保证了抗肿瘤提取物的药效。
可选的，在步骤3)中，具体包括：将所述稠膏烘干后，进行粉碎，得到粉末状抗肿瘤中药提取物。
在应用的过程中，一般需要将抗肿瘤中药提取物配置成相应的浓度，因此，为了便于应用，将稠膏烘干后进行粉碎，以获得粉末状的抗肿瘤中药提取物。
可选的，在步骤1)中，具体包括：
a)、以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，以体积浓度为60-80％、且质量为所述原料19-21倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；
b)、在所述第一提取药渣中加入体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-19倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；
c)、在所述第二提取药渣中加入体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-19倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；
d)、将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液。
对原料进行三次回流提取，且后两次回流提取所用的乙醇量较少，这样便于将原料中的有效成分提取完全。
可选的，在步骤d)之后还包括：将所述第三提取药渣干燥后回收。
回流提取完毕后，由于药渣中还会含有一定量的有效抗癌成分依旧木质纤维等，因此将得到的药渣干燥后回收利用，以实现资源的合理利用，减少浪费。
所述的提取方法提取的中药提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的提取方法提取的中药提取物在制备通过上调肿瘤细胞p21蛋白表达，并抑制Cdk-4/Cdk-6-cyclin D1复合物的活性，使细胞周期停滞于G1期的抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、该抗肿瘤中药提取物具有提高HT-29和SW620细胞G1期细胞的百分率，并且能够降低该肿瘤细胞S期和G2期细胞的比率，具有诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞，并抑制该两种肿瘤细胞的增殖能力的效果。
(2)、该抗肿瘤中药提取物处理结肠癌细胞后，会使得活化形式的caspase-3和caspase-9表达量增加，并且会提高促进细胞凋亡蛋白的表达量，降低抑制细胞凋亡蛋白的表达量；因此可用于制备抗肿瘤药物中的应用中。
(3)、该抗肿瘤中药提取物会降低结肠癌细胞中ERK1/2信号通路蛋白活性，使得结肠癌细胞中磷酸化的ERK1/2和磷酸化的MEK1/2的表达量就下降，从而通过抑制ERK1/2信号转导通路降低肿瘤细胞增。
(4)、该抗肿瘤中药提取物的原料来源广泛，无副作用，且成本低，因此可很好的应用于抗肿瘤药物的制备应用中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的中药提取物的EdU细胞增值实验结果图；
图2为本发明提供的中药提取物对HT-29的细胞凋亡率图；
图3为本发明提供的中药提取物对SW-620的细胞凋亡率图；
图4-6为本发明提供的中药提取物对HT-29的细胞周期的影响图；
图7-9为本发明提供的中药提取物对SW-620的细胞周期的影响图；
图10为用本发明提供的中药提取物对HT-29和SW-620处理后，凋亡调控相关蛋白表达结果图；
图11为用本发明提供的中药提取物对HT-29和SW-620处理后，细胞周期调控相关蛋白表达结果图；
图12为用本发明提供的中药提取物对HT-29和SW-620处理后，ERK1/2信号通路蛋白表达结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种抗肿瘤中药提取物的提取方法，其包括以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，进行乙醇回流提取，并将得到的提取液进行浓缩、干燥，得到抗肿瘤中药提取物。更具体的，其包括以下步骤：
S1：以罂粟科、荷青花属植物的根茎为原料，用体积浓度为60-80％、且质量为所述原料17-21倍的乙醇回流提取，得到提取液；
S2：将所述提取液浓缩，得到稠膏；
S3：将所述稠膏烘干，得到抗肿瘤中药提取物。
本发明提供的这种方法提取的抗肿瘤中药提取物，能够提高HT-29和SW620细胞G1期细胞的百分率，并且能够降低该肿瘤细胞S期和G2期细胞的比率，具有诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞，并抑制该两种肿瘤细胞的增殖能力的效果；因此可以很好的应用到抗肿瘤药物的制备应用中。
接下来，结合以上的内容，对本发明提取方法举出以下具体的实施例。
实施例1
以荷青花Hylomecon japonica(Thunb.)pratl的干燥根茎为原料，以体积浓度为70％、且质量为所述原料20倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；在所述第一提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；在所述第二提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液；将所述提取液浓缩，得到稠膏；将所述稠膏于70℃烘干后进行粉碎，得到抗肿瘤中药提取物。
实施例2
以多裂荷青花H.japonica(Thunb.)pratl.Var.dissecta(Franch savat.)Fedde的干燥根茎为原料，以体积浓度为60％、且质量为所述原料19倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；在 所述第一提取药渣中加入体积浓度为60％、且质量为所述原料17倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；在所述第二提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料17倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液；将所述提取液浓缩，得到稠膏；将所述稠膏于65℃烘干后进行粉碎，得到抗肿瘤中药提取物。
实施例3
以锐裂荷青花H.japonica(Thunb.)pratl.Var.Subincia Fedde的干燥根茎为原料，以体积浓度为80％、且质量为所述原料21倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；在所述第一提取药渣中加入体积浓度为80％、且质量为所述原料19倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；在所述第二提取药渣中加入体积浓度为80％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液；将所述提取液浓缩，得到稠膏；将所述稠膏于70℃烘干后进行粉碎，得到抗肿瘤中药提取物。
实施例4
以等质量的荷青花Hylomecon japonica(Thunb.)pratl、多裂荷青花H.japonica(Thunb.)pratl.Var.dissecta(Franch savat.)Fedde、锐裂荷青花H.japonica(Thunb.)pratl.Var.Subincia Fedde为原料，以体积浓度为70％、且质量为所述原料20倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；在所述第一提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取 液和第二提取药渣；在所述第二提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液；将所述提取液浓缩，得到稠膏；将所述稠膏于70℃烘干后进行粉碎，得到抗肿瘤中药提取物。
实施例5
以荷青花Hylomecon japonica(Thunb.)pratl的干燥根茎为原料，以体积浓度为70％、且质量为所述原料20倍的乙醇回流提取，得到第一提取液和第一提取药渣；在所述第一提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行二次提取，得到第二提取液和第二提取药渣；在所述第二提取药渣中加入体积浓度为70％、且质量为所述原料18倍的乙醇进行第三次提取，得到第三提取液和第三提取药渣；将所述第一提取液、所述第二提取液以及所述第三提取液合并得到提取液；将所述提取液浓缩，得到稠膏；将所述稠膏于70℃烘干后进行粉碎，得到抗肿瘤中药提取物。
应用例1
将本发明实施例5提供的抗肿瘤中药提取物(老鼠七组)和以其他原料来源(扣子和青蛙七)提取的药物通过HT-29、SW620细胞实验，对肿瘤细胞的IC50进行了初步研究，结果显示老鼠七组提取物具有良好的抗肿瘤作用，具体结果参见表1。
需要指出的是，在本发明中，所示出的老鼠七(又名拐枣七)，其作为一种中药来源，包括罂粟科、荷青花属(荷青花、多裂荷青花或锐裂荷青花)的植物。
表1不同原料来源的抗肿瘤中药提取物的IC50检测结果

应用例2
EdU细胞增殖实验：以常规的EdU试剂盒进行，结果图1所示，结果发现该中药提取物(老鼠七)具有明显地降低肿瘤细胞HT-29增殖的效果。
在图1中，A：con对照；B：5-Fu对照(15umol)；C：老鼠七提取物(0.01mg/ml)；D：老鼠七提取物(0.05mg/ml)；其中，老鼠七提取物为实施例5制备获得。
应用例3
流式-细胞凋亡：将结肠癌细胞(HT-29和SW-620)分别以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待24h贴壁后给予0.01、0.05mg/ml浓度老鼠七提取物(实施例5制备获得)，继续培养分别在24h和48h两个时间点收集细胞，包括所有贴壁和悬浮的细胞。
用预冷的PBS溶液洗涤两次细胞，每个样品用195μL的Annexin-FITC结合缓冲液(10mM Hepes/NaOH,140mM NaCl,2.5mM CaCl₂)重悬细胞。
加入5μL的Annexin-FITC溶液(25μg/mL)轻轻混匀，室温避光孵育10min。离心5min，弃上清，加入190μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。
加入10μL的PI溶液(250μg/mL)轻轻混匀，立即用流式细胞仪检测，波长488nm，功率15mW，用仪器软件处理，得出细胞的凋亡率图2-图3所示。
其中，在图2中，供试细胞为HT-29，且为A：con对照；B：5-Fu对照(15umol)；C：老鼠七提取物(0.01mg/ml)；D：老鼠七提取物(0.05mg/ml)。在图3中，供试细胞为SW-620，A：con对照；B：5-Fu对照(15umol)；C：老鼠七提取物(0.01mg/ml)；D：老鼠七提取物(0.05mg/ml)。从图2和图3可知，本发明提供的这种抗肿瘤中药提取物其具有明显的引起细胞凋亡的效果。
应用例4
对0.01、0.05mg/ml浓度的老鼠七提取物(实施例5制备获得)处理后的HT-29和SW620细胞进行PI染色，通过流式细胞术检测药物对细胞周期的影响。
结果图4-9所示(处于横坐标前段的黑色所示区域为G1期细胞，后段黑色所示区域为G1期细胞)，其中，图4-图6的供试细胞为HT-29；A：con对照；B：老鼠七提取物(0.01mg/ml)；C：老鼠七提取物(0.05mg/ml)；图7-9的供试细胞为SW620细胞；A：con对照；B：老鼠七提取物(0.01mg/ml)；C：老鼠七提取物(0.05mg/ml)；由图4-9可知，与正常对照组相比，G1期细胞的百分率在老鼠七提取物处理后明显升高，提示该浓度的中药提取物可以诱导HT-29和SW620细胞发生G1期阻滞。另外，S期和G2期细胞的比率降低提示细胞的增殖能力受到了老鼠七提取物的抑制。
应用例5
1)给药：分别接种HT29，SW620细胞于6孔板中，每孔2×10⁵个细胞，培养24h后给予老鼠七提取物(实施例5提供)，继续孵育24/48h。
2)提取细胞/组织总蛋白：细胞给药24/48h后，吸尽培养液，用预冷的PBS漂洗3次，刮下细胞后移入1.5mL离心管。4℃，3000rpm离心5min，弃上清液。
向离心管中加入60μL RIPA蛋白裂解液(含10mg/mL PMSF，即用即配)，在冰浴中静置裂解30min，待细胞充分裂解后，4℃，12000rpm离心20min，取上清液待用。
3)蛋白定量：采用BCA法测定细胞裂解液中的蛋白浓度。首先配制梯度浓度的BCA标准溶液：1、0.5、0.25、0.125、0.025、0mg/mL。分别吸取各浓度的标准溶液10μL或样品1μL(补加9μL PBS)至96孔板中，随后向孔中加入200μL工作液，充分混匀，在37℃孵育30min后用酶标仪在570nm波长下测量OD值。以标准浓度对OD值作标准曲线，拟合得标准方程，根据样品OD值计算其蛋白浓度。
4)蛋白制样：向细胞裂解液中加入适当体积的5×蛋白上样缓冲液，混匀后置于沸水中5min。根据蛋白浓度，按照20μg/样品的总蛋白量计算电泳上样量。
5)电泳：选用6％的浓缩胶和12％或10％的分离胶和进行蛋白电泳，将蛋白样品及分子量marker分别上样后以100V的起始电压将样品浓缩至分离胶界面时将电压调整为120V，当溴酚兰溢出分离胶时为止。
6)转膜：将NC膜在预冷的转移缓冲液中浸润。将湿润的NC膜置于凝胶表面，两侧放置润湿的滤纸，排除气泡，夹好后置于转 膜槽内，加入预冷的转移缓冲液，将转移槽置于冰浴中在100V电压下转印70min。
7)剪膜：用蒸馏水将NC膜漂洗干净，置于丽春红S中显色蛋白，按照蛋白分子量marker和所需的蛋白分子量剪裁NC膜，用PBST洗膜脱色。
8)封闭：将NC膜放入用PBST配制的5％脱脂奶粉溶液中，室温封闭2h后用PBST洗膜3次，每次5min。
9)一抗孵育：将剪裁后的NC膜放入相应的抗体稀释液中，4℃孵育过夜。
10)二抗孵育：用PBST洗涤NC膜3次，每次5min/次。用PBST缓冲液按1:10000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠的第二抗体，室温孵育1h。
11)采用化学法发光，对发光结果进行拍照，光密度值扫描，做统计学分析。
上述应用例5的实验结果主要体现在以下几个方面：
1、药物对细胞周期调控相关蛋白表达的影响
半胱氨酸蛋白酶(Caspases)在细胞凋亡调控中占核心地位，其中caspase-8，caspase-9是细胞凋亡的启动酶，caspases-3是细胞凋亡的主要执行酶。
发现用中药提取物处理结肠癌细胞24h后，活化形式的caspase-3和caspase-9表达量开始增加，但caspase-8活化形式的表达量没有变化。
Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中具有重要调控作用，Bcl-2家族蛋白分为两类：促进细胞凋亡的蛋白，包括Bid、Bax、Bak和Bad等；抑制细胞凋亡的蛋白，包括Bcl-xl和Bcl-2。
相应浓度的老鼠七提取物(中药提取物)处理HT29和SW620细胞24/48h后，检测Bax和Bcl-2蛋白表达的变化情况，结果如图10所示。Western blot检测结果表明用药物处理后，HT29和SW620细胞Bax蛋白表达量明显升高，同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低，且呈浓度和时间依赖性。
2、药物对细胞周期调控相关蛋白表达的影响
在细胞周期的调控中，细胞周期蛋白(Cyclin)家族和周期蛋白依赖激酶(Cdk)家族具有重要作用。Cyclin和Cdk结合形成活化的激酶复合体调控细胞周期的持续进行。
通过流式细胞术检测发现中药提取物可诱导结肠癌细胞发生G1期阻滞，细胞周期蛋白Cyclin D1与周期蛋白依赖激酶Cdk4和Cdk6结合后调控细胞从G1期向S期转化，因此本实验首先观察了老鼠七提取物对这三种蛋白表达的影响,结果发现老鼠七提取物处理细胞24/48h后，Cyclin D1，Cdk4和Cdk6的蛋白表达量均明显下降。
P21是Cdk的抑制蛋白，p21作为细胞周期G1的检查站，可阻止损伤DNA通过，抑制受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用。
如图11所示，实验发现HT-29和SW620细胞p21蛋白的表达量在相应浓度的老鼠七提取物处理后有所升高。以上结果提示老鼠七提取物可通过上调p21蛋白表达抑制Cdk-4/Cdk-6-cyclin D1复合物的活性，使细胞周期停滞于G1期。
3、药物对细胞MAPK信号通路的影响
在三组主要的促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号传递途径中，ERK1/2信号转导通路对肿 瘤细胞增殖具有重要促进作用。因此，检测了中药提取物对结肠癌细胞中ERK1/2信号通路蛋白活性的影响。结果如图12所示，在给予相应浓度药物处理30min后，HT-29和SW620细胞中磷酸化的ERK1/2和磷酸化的MEK1/2的表达量就开始下降，并且下降水平呈时间依赖性，表明该中药提取物可抑制ERK1/2信号转导通路的异常活化，从而具有抑制肿瘤细胞增殖的效果。
综上，本发明提供的抗肿瘤中药提取物，其通过控制凋亡调控相关蛋白表达、调控细胞周期调控相关蛋白表达以及细胞MAPK信号通路等方面实现抑制肿瘤细胞增殖的效果，从而体现出明显的抑制肿瘤的效果，且其原料来源广泛，物副作用，因此可以很好的应用于抗肿瘤以及抗肿瘤药物的的制备中，具有极高的潜在应用价值。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。