本发明涉及到抗制瘤素M的单克隆抗体。本发明的抗体特征在于能够结合到制瘤素M上，抑制制瘤素M受体结合，和/或抑制制瘤素M的生物活性。本发明的单克隆抗体可以用来在体内或体外检测制瘤素M的存在和/或调节制瘤素M的生物活性。 目前公认，体细胞杂种（“杂种”）是不能从短期原始培养中得到的特定细胞产物的一个重要来源。关于这方面的最佳实例是由Milstein和其他人建立的产生杂交骨髓瘤的系统，用这种杂交骨髓瘤可以制备一种抗选择性抗原的单克隆抗体（Kohler和Milstein，1985，自然杂志（伦敦）256∶495;Galfre et al。，1977，自然杂志（伦敦）266∶550）。这种杂交产物可以不断地提供特异性抗原的单克隆抗体。且这些抗体可以作为药剂用于任何已经预先运用过抗体的方法中，但是它还赋予了高认别力、低背景和能够不断提供抗体来源的优选性。
一般情况单克隆抗体的制备首先包括免疫接种、免疫应答细胞的分离，这些细胞在例如聚乙二醇中，与所选择地不断地分裂的不能够分泌免疫球蛋白的肿瘤细胞（“未灭活的”）进行融合。将所产生的细胞（杂交瘤）在，例如，HAT（6-羟基嘌呤，氨基喋呤，胸苷）培养基中生长被识别。每个杂交瘤都是一种单一的抗体形成细胞和肿瘤细胞的融合产物。这种杂交瘤具有前者的分泌一种单一特异性抗体的能力和后者的永久成活能力，使之能连续地繁殖，从而提供一种可以永久产生单一特异性抗体的细胞后代。
本发明涉及到对制瘤素M具有特异性的单克隆抗体的制备和运用，制瘤素M是一种对多种正常和转化细胞具有多效性效应的新型细胞分裂素（Cytokine）。具有本文所描述的单克隆抗体特征的任何单克隆抗体都属于本发明的范围之内。例如，能够竞争性抑制本文所述单克隆抗体与其制瘤素M抗原决定簇的免疫特异性结合和/或能调节制瘤素生物活性的一种单克隆或嵌合性抗体均属于本发明的范围之内。
用于描述本发明的实施例中使用了杂交瘤技术以产生本发明的抗制瘤素M抗体，但是本发明的范围并不局限于这些细胞杂交技术的运用。根据是否能够与天然制瘤素M，变性制瘤素M，或者两者都可以形成免疫沉淀物对这些典型的抗体进行了分类。每一类还据其对制瘤素M调节的生长抑制的阻断能力和/或制瘤素M与其细胞表面受体结合的能力而进一步特征化。这种抗体可以用于绘制新型制瘤素M蛋白质的表面决定簇及功能位点结构图。
下列所用术语具有如下所述的含义：
DDEIA-双决定性酶联免疫测定
GIA-生长抑制测定
HRP-辣根过氧化物酶
micro-EIA-微量酶联免疫测定
MAb-单克隆抗体
OM-制瘤素M
RRA-放射性受体测定
OM1-1R10F11单克隆抗体
OM2-11R2F8单克隆抗体
OM3-12R13D7单克隆抗体
OM4-4R12C7单克隆抗体
OM5-3R9D9单克隆抗体
OM6-3R13F4单克隆抗体
OM7-12R13B5单克隆抗体
OM8-12R19E3单克隆抗体
图1表示从cDNA编码制瘤素M稳定转染的CHO细胞系的上清液中得到的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸标记的制瘤素M的免疫沉淀试验。图1A表示抗制瘤素M单克隆抗体与“天然”代谢标记的制瘤素M（从代谢性标记的CHO转染物中收集的上清液）的一系列反应。图1B表示这些相同抗体与从代谢性标记的CHO细胞中收集的上清液的反应，这些上清液通过用SDS，2-巯基乙醇处理以及在与单克隆抗体一起培养前煮沸而使之变性。谱带1：阴性对照抗体;谱带2：OM1;谱带3：OM5;谱带4：OM6;谱带5：OM4;谱带6：OM2;谱带7：OM7;谱带8：OM3;谱带9：OM8。
图2提供了两种不同抗制瘤素M单克隆抗体在GIA测定中对A375黑色瘤细胞系的中和活性测定数据。图2A表示不同浓度的OM2的活性而图2B表示不同浓度OM1的活性。
图3表示在放射性受体测定中各种抗制瘤素M单克隆抗体对125I-制瘤素M与H2981肺癌细胞系结合的影响。
图4表示通过EIA所测定的两种不同抗制瘤素M单克隆抗体与用含有氨基酸缺失或改变的一系列突变制瘤素M结构转染的COS细胞所分泌的上清液之间的结合。所提供的数据是表示oD460时的总吸收单位。没有减去背景结合。在此图中，“del”表示从C-末端去掉的最后一个氨基酸，而英文字母表示所进行的氨基酸变化。
图5表示不同的抗制瘤素M单克隆抗体对由亲代结构，“SPOM”，或缺失突变体△44-47分泌的制瘤素M的免疫沉淀能力比较。谱带1：阴性对照抗体;谱带2：OM1;谱带3：OM2;谱带4：OM3。
图6表示由两种不同抗-制瘤素M单克隆抗体OM3和OM4测定的表面决定簇的定位图。将以吸收单位表示的OM3和OM4的相对结合与阴性对照抗体和从质粒△188-227，△188-227/L108S，和GAG104转染的COS细胞的无血清条件培养基中得到的OM的结合进行比较。结合水平与COS细胞（“SPOM”）分泌的OM的结合水平进行比较（Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10：1882-1890）。
图7是可以影响一系列抗制瘤素M单克隆抗体结合的制瘤素M突变图解。OM引导顺序位于残基-25到-1。从COS细胞中分泌的未加工分子为227个氨基酸长，被切割成一种成熟的196个氨基酸的蛋白质。（Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10：1882-1890）。在184（△）以内和包括184的C-末端氨基酸缺失可以破坏OM1和OM2的结合。另外，通过残基22-36或44-47的缺失可以取消OM2结合。抗体OM3的表面决定簇位于含有残基108（箭头所指）的位点，因为在这个残基处把亮氨酸换成丝氨酸可以破坏这种mAb的结合。在残基104（）处插入甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽可以取消OM4结合。
本发明涉及到对制瘤素M（一种对多种不同的正常和转化细胞具有多效性作用的新型细胞分裂素（Cytokine））具有特异性的单克隆抗体。并对结合制瘤素M，抑制制瘤素M受体结合，和/或抑制制瘤素M生物活性的单克隆抗体进行了描述。
所描述的单克隆抗体可以用来绘制制瘤素M的表面决定簇图并且定义其领域的结构-功能关系。这种抗体可以用于诊断测定，例如，检测制瘤素M，或制瘤素M突变形式的存在。也可以使用这种单克隆抗体在体内或体外调节制瘤素M的生物活性。通过下面的章节对本发明进行详细的描述。
由对制瘤素M的特异性所定义的单克隆抗体的特性
对定义天然或变性形式的制瘤素M的各种表面决定簇的单克隆抗体进行了描述。并且根据他们对制瘤素M生物活性抑制能力和/或结合细胞表面受体的能力对单克隆抗体进一步分类。能够竞争性抑制所述单克隆抗体与他们的制瘤素M表面决定簇免疫特异性结合的任何单克隆抗体，包括嵌合抗体，都属于本发明的范围之内。
制瘤素M抗原的识别
制瘤素M起初以其对人体癌细胞系的抑制性作用而被鉴别，它首先是从佛波醇12-十四酸盐13-乙酸盐“PMA”）-诱导的人体组织细胞淋巴瘤细胞（Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）83：9739-9743）和从激活的T淋巴细胞（Brown et al.，1987，J.Immunol.139：2977-2983）中分离出来。该分子是一种含有Mr＝28，000的单一多肽链的热和酸稳定性蛋白质。象其他自然形成的生长调节因子一样，制瘤素M具有各种生物活性。发现它对某些，但不是全部的，人体癌细胞系具有生长制抑作用。相反，制瘤素M可以刺激某些正常成纤维细胞，如人体包皮成纤维细胞或WI-38细胞的生长（Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci（USA）83：9739-9743）。已经克隆和定序出制瘤素M的基因，并且最近在哺乳动物细胞中已经表达出一种活性的重组制瘤素M（见于1988年1月15号申请的美国申请流水日.144，574，相同的欧洲专利申请公开号EPA0290948（1988年11月17日公开），本发明参考并结合了该专利全部内容）。切割下信号肽后的成熟形式是一种含有227个氨基酸的糖蛋白，其中五个氨基酸是半胱氨酸残基。该蛋白质具有一个强亲水性的羧基末端区，尽管制瘤素M与其他已知细胞分裂素在结构上不相关，但是它的mRNA在其3′未翻译端含有一个富AU区。在制瘤素M信使RNA中的这个区与许多细胞分裂素、淋巴激活素和其他生长-调节分子同源，这提示了一种调节基因表达的共同方式。在各种哺乳动物细胞中发现了制瘤素M的细胞受体存在。主要的制瘤素M受体分子是一种Mr＝150，000-160，000的特异性蛋白质（Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.264：4282-4289）。
通过本领域的已知技术从各种可以合成活性制瘤素M的细胞源中获得制瘤素M，这种细胞源包括，例如，能够自然产生制瘤素M的细胞和用能够控制合成和/或分泌制瘤素M的重组DNA分子转染的细胞。也可以通过化学合成方法包括但不局限于固相肽合成方法来合成制瘤素M。对制备制瘤素M的方法描述见美国系列申请No.144，574，申请日1988年1月15日，等同于公开的欧洲专利申请EPA0290948（1988年11月17日公开），本文参考了并结合了该申请的全部内容。
可以使用许多免疫测定方法中的任何一种方法，通过测定其结合制瘤素M的能力来选择对制瘤素M具有亲和性的单克隆抗体，这些免疫测定方法包括但不局限于酶联免疫吸附测定（ELISA），免疫沉淀，Western印迹分析，放射免疫公制测定，竞争和非竞争性免疫测定。例如，可以容易地使用下述的固相微量酶测定方法（“Micro EIA”）。总之，要通过测定其对覆盖在孔（Well）固体表面上的制瘤素M的结合能力来确定杂交产物上清液中抗体的存在。加入上清液之后，向孔（Well）中加入过氧化物酶连接的F（ab′）2羊抗鼠Ig。把所有未结合的物质冲洗掉之后，通过加入一种出现一种颜色变化的底物来展现已结合的酶。这种颜色的变化间接地表示了孔中单克隆抗体/制瘤素M复合物的形成。
制瘤素M活性的抑制
抑制制瘤素M生物活性的抗体在治疗应用中具有特殊的用途。可以通过下述的生长抑制测定方法（“GIA”）来识别这种抗体。总地来讲，GIA可以做为一种测试系统来评价一种抗体中和制瘤素M对靶细胞生长和繁殖抑制作用的能力。
对制瘤素受体结合的抑制
细胞表面受体一般对其配体具有高度的亲合性。配体与特定细胞表面受体的结合是控制各种细胞活动的开端。运用下面所述的以及在前面引用的1988年1月15日申请的美国申请流水号.144，574中所述放射性受体测定方法已经表明了制瘤素M与一种膜受体的结合。所测定的人体癌细胞包括A375（黑素瘤）;A875（黑素瘤）;Me1109（黑素瘤）;T24（膀胱癌）;A549（肺腺癌）;H1477（黑素瘤）;Me180（黑素瘤）;和MCF（乳腺癌）。125I-制瘤素M的结合具有特异性和可饱和性，并且不被其他已知多肽生长调节因子所抑制。与各种不同细胞系结合所得数据的Scatchard分析表明，125I-制瘤素M以Kd为大约10-9M结合到每个细胞的1-2×104个结合位点上，使用下面所述的放射性受体测定方法，测定杂交细胞系产生的单克隆抗体阻碍制瘤素M与其细胞表面受体结合的能力。
抗制瘤素M的单克隆抗体的制备方法
可以运用将制瘤素M作为免疫原注射到哺乳动物宿主中，如鼠，牛，山羊，绵羊，兔等，尤其是与一种佐剂一起注射，如完整Freund′s佐剂，氢氧化铝凝胶或类似物的各种方法中任何一种来制备本发明的抗-制瘤素M抗体。然后将宿主放血，将血液用于分离多克隆抗体。也可以使用外周血淋巴细胞，脾淋巴细胞（B-Cells），或淋巴结淋巴细胞与一种合适的骨髓瘤细胞进行融合，以使单克隆表达制瘤素M特异性抗体的染色体永久成活。
虽然在描述本发明时使用了鼠单克隆抗体的实施例，但是本发明并不局限于此，并且还包括，例如人抗体的使用。这种抗体可以通过运用人体杂交瘤（Cote et al.，1983，Proc.Natl。Acad.Sci（U.S.A），80：2026-2030）或通过用EBV（Epstein Barr病毒）在体外转化人体B细胞（Cole et al.，1985，in“Monclonal Antibodies and Cancer Therapy”Alan R.Liss，PP.77-96）来获得。并且可以使用最近建立的产生“嵌合抗体”的方法（Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A），81：6851-6855;Neuberger et al.，1984，Nature 312：604-608;Takeda etal.，1985，Nature 314：452-454）。后者的方法包括将从一种具有合适抗原特异性的鼠抗体分子中得到的基因与从具有合适生物活性的人抗体分子中得到的基因融接在一起。
可以使用近来公开的一种方法制备一种可以定义制瘤素M的单克隆抗体的全部组成成份（见Sastry，et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A）86：5728-5732，和Huse et al.，1989，Seience 246：1275-1281）。因此，一种从制瘤素M免疫的动物脾DNA中得到的Fab片段cDNA库可以在细菌宿主细胞中产生。
用合适的蛋白酶，如，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，及其类似物，进行处理可以对本发明的单克隆抗体进行修饰，以产生可以与制瘤素M免疫特异性结合的Fab，F（ab′）2或Fv片段。
也可以将整个抗体分子或它的Fab，F（ab′）2或Fv片段结合到一种化合物上，这些化合物包括，但不局限于，信号产生化合物如荧光发光剂，放射性标记物，一种发色团，酶，化学发光或生物发光分子等。也可以把整个抗体或它的Fab，F（ab′）2或Fv片段连接到可以增强或抑制制瘤素M生物活性一种生长因子上，或者结合到毒素上以致于可以有选择性地将在细胞表面上表达制瘤素M前体的细胞杀死。用来将标记物、蛋白质，毒素等结合到抗体和抗体片段上的方法在本领域中是已知的。见，例如，美国专利.4，220，450;4，235，869;3，935，074;和3，996，345。
因此，在本发明的另一个实施例中，提供了制备一种其抗原结合位点可与制瘤素结合的单克隆抗体，或其片段的方法，包括
（a）培养一种细胞系，所说的细胞系能够产生一种抗制瘤素M抗体，或其片段，并且回收所制备的产物;或
（b）从一种完整的抗制瘤素M抗体中制备一种抗制瘤素M抗体片段，和，如果需要的话，
（c）把（a）或（b）中制备的抗体或抗体片段结合到一种标记物、生长因子，或毒素上。
抗制瘤素M单克隆抗体的用途
本发明抗体的优越性是可以用来检测天然的或变性形式的自然或重组制瘤素M或者检测血清样本中制瘤素M以游离形式或与其结合蛋白联合形式的存在。本发明抗体也可以用于体内抑制制瘤素M的生物活性。多克隆或单克隆抗体都可以用来检测样本中，如细胞或生理体液，如血液中的制瘤素M。体液内制瘤素M的发现也可以作为瘤细胞的存在的指示。就此而言，抗制瘤素M抗体可以用于诊断和/或预后癌症和/或其他细胞生长相关疾病。还可以将该抗体用在亲和性色谱分析中，分离和纯化从自然或合成来源的制瘤素M。也可以将这些抗体用于控制体内或培养基中与细胞结合在一起的制瘤素M的量，借此通过形成一种特异性抗体：制瘤素M复合物以竞争性抑制制瘤素M：制瘤素M受体的结合，来调节细胞的生长。因此可以将本发明抗体用作治疗药物，来治疗以制瘤素M生长刺激活性为发病因素的细胞生长紊乱性疾病。
因此，为了此目的，还提供了一种药物组合物，它包括做为活性成份的本发明抗体，或其片段，并与医药上可接受的稀释剂、赋形剂，或其载体结合。
模仿制瘤素M效果的抗个体基因型抗体的产生
也可以用本发明的单克隆抗体来制备可以模仿制瘤素M生物活性的抗个体基因型抗体。抗个体基因型抗体或抗个体基因型是直接与抗另一种抗体分子的抗原结合区或可变区（称为个体基因型）的抗体。从理论上讲，根据Jerne的个体基因型关系的网络模型（Jerne，N.K.，1974，Ann.Immunol.（Paris）125：373;Jerne，N.K.et al.，1982，EMBO 234），用一种表达对应于某一已给定的抗原的抗体结合部位的抗体分子进行免疫接种应当产生一组抗个体基因型抗体，其中部分抗体与该抗原都有一种与该抗体结合部位互补的结构。接着用抑制制瘤素M与其受体结合的单克隆抗体进行免疫接种应当可以产生模仿制瘤素M和并与制瘤素M受体结合的抗个体基因型。因此，这些能够用直接抗制瘤素M的单克隆抗体制备的并且可以在体内和体外模仿制瘤素效应的抗个体基因型都属于本发明的范围之内。同样，与制瘤素M结合的抗个体基因型抗体包括在本文中制瘤素M的单克隆抗体的定义范围之内。
制瘤素M的抗原决定簇定位
对这种生长调节因子，制瘤素M的结构分析是确定这种新型细胞激动素在自身平衡或病理状态中所起生物作用的一个重要前序过程。在后面所述的实施例中，对一系列所制备的抗重组制瘤素M的单克隆抗体（OM1至OM8）进行了分析，以确定它们结构上的结合需求和抗原表面决定簇位置。这些抗体可以检测线性的（OM3和OM4）也可以检测折叠（OM1和OM2）抗原的表面决定簇。用OM3和OM4检测的线性抗原表面决定簇位置非常接近。其抗原表面决定簇包括残基108的OM3与折叠的和变性的制瘤素M都可发生反应。而MabOM4，其抗原表面决定簇通过在氨基酸残基104插入一个三肽后可被破坏，只能与变性的制瘤素M结合。
在一种生长抑制测定中单克隆抗体OM2可以去除制瘤素M的功能效应。后面所提供的数据表明抗体OM2是通过限制OM与其受体的结合而中和了OM的效应。通过血清学分析，已经确定特定的氨基酸插入、缺失、或取代突变可以影响中和抗体的结合。这些实验结果与这些突变分子的GIA和RRA活性分析所得结果非常密切相关，从而表明这种中和抗体结合位点位于因生物活性需要进行适当折叠的OM分子三级结构中。
在非邻近（C-末端，△22-36，△44-47）氨基酸残基中间具有缺失或改变的突变体中受体和OM2结合的破坏有力地证实了制瘤素M的功能重要区是高度依赖于合适的三级结构这一观点。这些数据还表明成熟分子的N-末端和C-末端中的区，或者通过直接形成受体结合位点或者通过间接稳定其活性所必需的三级结构，是制瘤素M功能活性的基本区域。
对于白细胞介素-6有类似的发现，白细胞介素与制瘤素M具有某些相同的功能特性，包括抑制体外某些癌细胞系的生长和诱导血浆酶原活化剂抑制因子（Brown，et al.，1990，in“Molecular Biology of the Cardiovascular System，Elsevier，Amsterdam，PP.195-206）。IL-6的N-末端氨基酸后残基31和前五个羧基末端氨基酸的伴行缺失显著地减少其活性，而第16位C-末端残基的缺失完全取消了其功能活性。IL-6的一系列中和抗体表现为能够识别由氨基和羧基末端氨基酸形成的抗原表面决定簇，并且同样认为IL-6的7个C一末端氨基酸是一种α螺旋结构（Brakenhoff，et al.，1990，J.Immunol.145：561-568）。与制瘤素M所得到的结果相反，分子内的二硫化键似乎不是IL-6之功能活性的基本结构（Jambou，et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A）85：9462-9430）。已经制备出α-干扰素（Cebrian，et al.，1987，J.Immunol.138：484-490）和β-干扰素（Redlich & Grossberg，1989，J.Immunol 143：1887-1893）的中和单克隆抗体，并且和制瘤素M一样，二硫化键是必须的功能结构。尚没有公开过突变干扰素分子的抗原表面决定簇定位图。汇总这些和其他细胞分裂素的结构一功能分析将有助于描述不同基本结构是如何调节这些分子的相似三级结构和功能特征的。图7是就用OM2，和用OM3与OM4抗原表面决定簇的定位图所确定的制瘤素M分子功能重要区的图解模型图。
虽然中和抗体结合位点已不存在，内部缺失变异数据表明由非中和性抗体，OM1，测定的抗原表面决定簇仍保留完整。通过人体生长激素的丙氨酸筛选诱变获得了类似的结果，在其中许多突变可以影响受体的结合，而不影响抗表面决定簇而不是抗受体结合区的那些单克隆抗体的结合（Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085）。这些数据表明在不引起制瘤素M三级结构大规模破坏的情况下可以出现受体结合位点的局部破坏。到目前为止运用突变尚不可能得出OM1抗原表面决定簇的定位图。OM1抗原表面决定簇可能依赖于C-末端折叠而稳定的三级结构。
本发明与其他文献中已经叙述了检查制瘤素M结构一功能关系的几种互测方法。因为抗体OM2似乎是通过阻遏制瘤素与其受体的结合而展现其中和活性，因此有可能制备一种可以与能识别制瘤素M受体的中和抗体内部结构直接结合的抗个体基因型抗体。已经成功地运用这种方法制备出直接作用于一些不同受体的抗体，如胰岛素受体（Sege and Peterson，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A）75：2443-2444）和β-肾上腺素能受体（Schreiber，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A）77：7385-7389;Homey，et al.，1982，J.Clin.Invest.69：1147-1154）。其他一些（Gaulton and Green，1986，Ann.Rev.Immunol.4：253-280;Vaux，et.al.，1990，Nature.345：495-502）。用本文所描述的单克隆抗体检测出的表面抗原决定筛的定位可以作为重要工具以用来检查制瘤素M的生物功能和组织分布。
下列的非限制性实施例和方法是用来对本发明做进一步的发明。
制瘤素M单克隆抗体的产生
A.免疫接种和融合
用5μg或10μg由质粒pBOM转染的CHO细胞表达的重组制瘤素M对4Balb/C鼠进行免疫接种以制备杂交瘤（Linsley，et al.，1989，J.Biol.Chem.264：4282-4289）并且按文献所述进行纯化（Zarling，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）83：9739-9743）。转染的CHO细胞分泌的制瘤素M是一种从227残基前体分子加工而成的有196氨基酸的成熟分子（Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10：1882-1890）。
总的来讲，将制瘤素M再悬浮于PBS中，并在一种等体积的完全弗氏佐剂中乳化，把25μg的乳化液皮下注射到一支后腿的爪褥内。两周以后，在同一后腿爪褥内进行相同方法的免疫接种，并且所用制瘤素浓度与第一次免疫接种时相同。第二次免疫接种两周后，在同一后爪褥上用制瘤素M与非完全弗氏佐剂乳化的第三次制剂给鼠注射。最后一次免疫接种三天后，取下腘部淋巴结，然后以淋巴结细胞与骨髓瘤细胞比为1∶1的比率用40%聚乙二醇做为融合剂，将鼠骨髓瘤653/AG8细胞与淋巴结细胞进行融合。以5×104细胞/孔的浓度将融合产物在含有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷做为选择剂的96-孔平板上进行培养，培养基为含有10%胎牛血清，丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的Iscoves修改的Dulbecco′s修改Eagle′s培养基（“IDMEM”）。一周之后，用含有选择剂的新鲜培养基更换原始培养基。当在显微镜下可见杂交产物时，通过下述的固相微量酶联测定（“Micro EIA”）对杂交产物进行筛选。
B.酶联免疫测定
用下面的Micro EIA方法表明对用杂交瘤制备的制瘤素M的抗体特异性的特征。用一种适用于微量测试平板（Robbins Scientific，San Francisco）的固相EIA在杂交瘤上清液中筛选活性成份。将2到4μg/ml浓度的纯化制瘤素以每孔5μl的量进行平板培养，并且使之空气干燥过夜。在用5%的脱脂奶粉PBS溶液和0.1%叠氮化钠阻遏1小时之后，加入1μl体积的杂交瘤上清液，并在室温下保温1小时。通过在PBS中浸渍的方法将平板洗涤6次。向每孔中各以5μl量加入浓度为1∶1500的过氧化物酶结合的F（ab′）2羊抗鼠IgG（Pel-Freez，Rogers AK）的PBS+2%BSA溶液。孵育1小时后，按如前所述方法冲洗平板6次;加入10μl的底物，2，2′-连氮基-双-（3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸）（“ABTS”，Sigma Chemical Co.，st.Louis，MO.）并且在20分钟之后以OD＝660nm对平板进行测值读数。根据与前面制备的兔抗制瘤素M抗血清的信号相关的背景信号确定阳性孔。在软琼脂上对阳性杂交产物进行克隆。
使用一种双决定簇EIA（DDEIA）方法来评价其具有三级结构抗原表面决定簇的单克隆抗体与一系列突变制瘤素M分子的结合能力。这些突变体在分子的不同位点有氨基酸残基的插入、缺失或取代。在进行DDEIA的分析之前先用一种利用mAb OM3的直接EIA方法来测定上清液中突变分子的浓度。为进行DDEIA分析，将100μl浓度为10μg/ml的蛋白质G（Pharmacia）亲合纯化单克隆抗体OM3的0.05M碳酸盐缓冲液，PH9.6，加入到96孔平底平板中，然后于4℃下孵化过夜。取出抗体，在用PBS，1%BSA，0.05%吐温20阻遏1小时之后，加入特定浓度的纯化制瘤素M或者加入从编码突变形式OM的质粒转染的COS细胞中得到的一系列不同稀释浓度的上清液。将该平板在37℃下保温2小时，用PBS洗涤5次，再用100μl浓度为200ng/ml的生物素化的（biotinylated）单克隆抗体（OM1或OM2）于37℃下保温1小时。于37℃下保温1小时之后，将平板洗涤5次;加入100μl HRP-结合的抗生蛋白链菌素（vector）的1∶10，000稀释液，并把平板于37℃下保温30分钟。洗涤之后，用3，3′，5，5′四甲替联苯胺（“TMB”）与之发生反应，用1N硫酸终止该反应，并于A450读数。
C.免疫沉淀
在一种60×15cm的佩特里细菌培养皿中各用4ml200μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸与制瘤素-M-编码cDNA转染的CHO细胞（Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.264：4282-4289）一起培养4-8小时。收集上清液并过滤;加入10mM苯甲基磺酰氟化物（“PMSF”）和100mM甲苯磺酰-赖氨酸-氯甲基酮（“TLCK”）以抑止蛋白酶。为了进行免疫沉淀，用200μl从分泌单克隆抗体的杂交产物中得到的耗尽（spent）上清液与100-200μl标记上清液在4℃下震荡培养过夜。通过与一种和Reactigel颗粒（Pierce Chemicals）共价结合的单克隆鼠抗鼠k轻链单克隆抗体一起培养来分离抗原抗体复合物。冲洗之后，在含有1%SDS和5%2-巯基乙醇的样本缓冲液中煮沸来洗脱抗原抗体复合物。将洗脱的物质在15%SDS-PAGE中进行电泳。用AmplifyTM（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）对凝胶进行荧光X线照相，干燥，用柯达X-AR5 X-线胶片进行放射自显影照相。
D.生长抑制测定
测定抗体以确定是否都能够中和制瘤素M在生长抑制测试（“GIA”）中的抑制效应。在GIA中使用A375黑素瘤细胞（4×103细胞/50μl）做为指示细胞。将A375细胞在平底96孔组织培养平板（Costar 3595，Cambridge，MA）上在含有添加10%热灭活胎牛血清，和青霉素/链霉素的Dulbecco修改的Eagle培养基（“DMEM”）的生长培养基中进行次代培养4小时。将制瘤素M在生长培养基中稀释，在每个孔中加入50μl的稀释样本一式三份来测定其生长抑制性。然后将该细胞在37℃下培养72小时。此培养期结束后，每个孔用100μl含有〔125I〕碘-2′-脱氧尿嘧啶核苷（0.05μCi/孔（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL））的生长培养基作用24小时。将单细胞层在磷酸盐缓冲盐水（“PBS”）中洗涤，在95%甲醇中固定，然后空气干燥。将细胞结合的〔125I〕-碘脱氧尿嘧啶核苷溶于200μl的1N氢氧化钠中，根据结合到活性生长细胞DNA中的〔125I〕-碘脱氧尿嘧啶核苷的量来测定细胞生长数量。一单位活性定义为相对于未处理细胞而言A375细胞生长受到50%抑制所需要的制瘤素M的量。
E.制瘤素M放射性受体测定
用一种放射性受体测定方法来测定抗体对于125I-标记制瘤素M与人体癌细胞系H2981上制瘤素M的相应细胞表面受体结合的抑制能力。将H2981细胞以2×105细胞/孔的密度置于48孔平板上，并在测定开始之前于37℃下保持16-24小时。然后用结合缓冲液（Linsley et al.，1986，Biochemistry 25：2978-2986）对细胞单层洗涤一次。为测定总结合量，加入浓度为0.5-100ng/ml的125I-制瘤素M。为了测定非特异性结合，在加入125I-制瘤素M的同时把高于125I-制瘤素M浓度20到100倍浓度的未标记的制瘤素M，加入到固体的平板中。在23℃下使结合进行2-5小时，然后用结合缓冲液洗涤单细胞层4次。将细胞结合的放射性活性成份溶于1N NaoH中并用γ计数器进行计数。通过从总结合中减去非特异性结合计算出特异性结合。运用Scatchard分析来确定分离常数（Kd）和结合活性（Scatchard，1949，Ann.N.Y.Acal.Sci 51：660）。
F.制瘤素M突变体
对与一系列在DNA水平上发生插入、缺失或取代的重组制瘤素M突变体进行结合的抗制瘤素M单克隆抗体进行检测。按照对从各种亲代和突变结构短暂转染的COS细胞培养中得到的耗尽（Spent）上清液进行EIA的方法对抗体进行测定。
G.用单克隆抗体测定血清中的制瘤素M
血清中制瘤素M存在的测定方法如下：首先将人血清样本置于一种S-300大小的柱子上根据分子量分离血清蛋白。在血清样本酸化前后检查从S-300柱子中收集到的流份的GIA活性。在酸化前，在空隙体积流份中，大多数血清不显示GIA活性，而在加入到GIA之前进行酸化，然后又中和过的血清样本部分中，分子量大于200千道尔顿的流份展现的活性表明血清中的制瘤素一般是与一种大于200kd的结合因子结合在一起的，并且在这种状态下是无活性的。用Western印迹分析检查各种血清样本。制瘤素M特异性单克隆抗体与相应于制瘤素M分子量的高分子量流份中的蛋白质的结合，证明了该流份中制瘤素M的存在。已经纯化出存在于血清的制瘤素M，并且N-末端氨基酸顺序表明它与已前得到的天然结果和重复制瘤素M相同。
H.用对制瘤素M的特异性选择单克隆抗体结果
进行两组融合实验，每组由四种融合组成，每种融合使用从每个鼠中得到的一个淋巴结。在第一组中，对四种杂交产物进行更为广泛地检查。从第二组中，该组是更为成功地融合组（以在Micro EIA中识别出的阳性杂交产物的数目表示），可以识别出至20个其他的抗制瘤素M单克隆受体。从这些当中根据其EIA中的相关信号和免疫沉淀天然或变性代谢标记制瘤素M的能力选择下列杂种作进一步研究：OM2，OM7，OM3，和OM8。根据下面描述的免疫沉淀数据，将这些杂种依据其与天然制瘤素M、变性制瘤素M，或者二者（表Ⅰ）的反应能力归类到三类当中的一类中。然后检查这些单克隆抗体中的5种以确定是否他们当中是否有一种能够中和生长抑制测试中制瘤素M的抑制效应。这些结果如下所述。
I.单克隆抗体与制瘤素M的免疫沉淀
免疫沉淀数据结果识别出三种单克隆抗体（OM2，OM2和OM7），它们只能与从CHO转染子中分泌出的35S-蛋氨酸标记的制瘤素M形式发生反应（组1（谱带2，6，7;图1;见用于识别抗体的表Ⅰ）。另外三种单克隆抗体（OM4，OM5和OM6）只能与用SDS和还原剂处理首先还原和变性再在100℃煮沸的35S-蛋氨酸标记制瘤素M进行反应，但不与天然制瘤素M反应（组2，谱带3，4，5）。其他两种单克隆抗体（OM3和OM8）可以与生物合成标记的不论是天然还是变性的制瘤素M发生反应（组3，谱带8，9）。
J.在生长抑制测试中中和制瘤素M的单克隆抗体
从杂化物OM2中纯化的抗体可以浓度依赖方式（图2A）中和制瘤素M的效应。抗天然制瘤素M的抗体OM1不显示阻遏制瘤素M的生长抑制效应（图2B）。通过CIA测定，没有一种识别变性决定簇的抗体能够中和制瘤素M。如下所述，进一步测试中和抗体OM2对制瘤素M受体结合的抑制能力。
K.在放射性受体测试中抑制制瘤素M结合的单克隆抗体
OM2抗体能够以浓度依赖方式抑制制瘤素M受体的结合，这与抗天然非中和位点的OM1抗体，或者是抗变性制瘤素M抗原表面决定簇的第三种抗体OM4相反（图3）。
L.制瘤素M的功能位点与抗原表面决定簇图的分析
下面一部分内容描述了所制备的可以与转染CHO细胞上清液中纯化出的重组OM结合的单克隆抗体特征（Linsley et al.，1989，J.Biol.Chem.264：4282-4289）。通过对由编码一系列突变形式OM的质粒转染的COS细胞分泌的产物进行血清学分析，我们已经确定出某些单克隆抗体所识别的抗原表面决定簇的位置，并且确定了该OM分子的抗体结合和生物活性所需要的某些三级结构。
在能够识别折叠抗原表面决定簇的两种抗体中，根据其在生长抑制测定（GIA）中取消OM活性的能力和在放射性受体测定（“RRA”）中限制OM结合的能力，识别出OM2，而不是OM1，是一种中和抗体。突变OM分子的血清学分析表明OM2的结合位点受OM的非邻近区影响，并且表明两个二硫键（C49-C167）之一的存在是中和抗体结合的基本结构。另外，某些突变可以取消OM2结合而不引起OM分子的球形错误折叠。
这些数据表明由OM2确定的抗原表面决定簇与OM的结合位点有空间相关性，而由OM1，OM3，和OM4识别的那些表面决定簇则与它们不一样。这里描述的抗体做为检查有意义组织和体液中OM的免疫学探针，将有助于确定OM的生理功能和分布。
M.用EIA绘制制瘤素M的抗原表面决定簇的图
生长调节因子制瘤素M（OM）是一种对广泛的正常和转化细胞系具有多向性效应的新型细胞分裂素。为了确定OM的某些生理功能，我们已经制备出如下面所述的抗重组分子的一系列单克隆抗体（OM1，OM2，OM3和OM4）并表明了它们的特征。
抗体OM1和OM2与天然OM结合，但不与变性OM结合，这表明他们是通过三级结构形式来识别抗原表面决定簇的。第三种抗体OM3与天然或变性OM结合，而抗体OM4只与变性OM结合。通过测定抗体与一组突变形式的OM结合即可确定适用于这些单克隆抗体的（mAb）抗原表面决定簇的位置。OM3结合位点含有残基108，而OM4的结合位点被104位的氨基酸插入所破坏。
为了确定这些抗体所识别的抗原表面决定簇的位置，我们对这些抗原表面决定簇在无血清条件培养基中与从用一系列具有该分子中不同位点上氨基酸残基OM突变体编码的质粒转染的COS细胞中得到的OM的结合进行了测试。用直接EIA方法对识别线性抗原表面决定簇的抗体OM3和OM4与一系列突变OM蛋白质的结合进行检查，在这些突变OM蛋白质中利用终止密码子的插入（图6）以顺序方式将C一末端氨基酸删除。突变体△188-227可以被OM3结合，在108位残基处将亮氨酸改换成丝氨酸的，而△188-227/L108S则不被结合。抗体OM4的定位位点在104位（图6）由于一个甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸顺序的插入所破坏。抗体OM5和OM6也是主要与变性OM反应，而不与OM4同样的抗原表面决定簇反应，由于他们与不被OM4所结合的GAG104突变体发生反应。到目前为止所制备的一系列OM突变体中没有一种可以提供这些突变体的抗原表面决定簇定位信息。抗体OM7可能与中和抗体，抗体OM等同，因为它与OM具有相同的Ig同型和OM突变结合方式，而抗体OM8与OM3由于同样的原因可能也等同。
N.OM1和OM2抗原决定簇的血清学分析
为了分析OM与抗体OM1和OM2结合的结构需求，它们只与折叠形式的OM反应，我们建立了一种双决定簇EIA方法。该方法使用既可与天然OM又与变性OM结合的抗体OM3，从COS转染子突变体上清液中寻找OM。将由生物素化的（biotinylated）OM1或OM2结合的OM（来源于突变体分子）的浓度与由相应抗体结合的纯化天然OM的标准曲线进行比较。
做为这些抗体结合的OM突变分子浓度，单位ng/ml，与它们结合纯化OM浓度的对比结果列于表Ⅱ。因为这种测定方法中，OM以饱和浓度存在于突变转染子的未稀释上清液中，因此需要一系列稀释液来测定DDEIA中的线性部分中的OM。在所有被检查的OM的推断值大于200ng/ml的情况中，对应于该分子不同突变体的系列稀释液的吸收值具有相同的斜率，这表明生物素化的（biotinylated）抗体以相同的相关亲和性与这些突变分子进行结合。
对于OM分子的结构分析表明在接近C-末端氨基酸168-196间存在有一个强烈的两性分子/双嗜分子区。对OM1和OM2抗体与具有顺序性C-末端缺失的一系列突变体的结合进行检查。OM1和OM2都能够以高度亲和性识别从那些自186位氨基酸起具有顺序性C末端缺失的突变体中得到的OM（以高浓度的蛋白结合表示）。对于△185-227C-末端缺失突变体来说，两种抗体都以较低的亲和性结合;中和抗体OM2的结合水平比OM1的结合水平低。在C-末端缺失突变体△184-227中两种抗体的结合活性完全丧失。在一系列突变体的两性区中把疏水基或亲水基改变成中性氨基酸可以引起更为复杂的抗体结合方式。在三个苯丙氨酸与甘氨酸的替换中，只有在176位上的改变可以引起两种抗体结合的完全丧失，而在184位的改变可以降低中和抗体OM2的结合，而对OM1不降低。在169位苯丙氨酸与甘氨酸的替换对于两者中任何一种的结合都没有影响。两种分离蛋白质，H174G和H1786，分别在174位和178位将亲水性组氨酸换成甘氨酸，可以以高度亲和性被OM1和OM2结合。
在天然制瘤素M分子中存在有两个分子内二硫键。C6-C167二硫键不影响OM1和OM2表面决定簇的局部三级结构，因为当把6位上的半胱氨酸改换成丝氨酸时不能减少抗体结合。取消两个二硫键（C6S/C167S）可以破坏两种抗体的表面决定簇，可能是由于引起了该分子的球形错误折叠。
两种突变OM分子，△44-47，和△22-36，可以提供信息以辨别抗体OM1和OM2的结合需求。这些缺失突变体可以被非中和抗体OM1结合，但不能被中和抗体OM2结合。图7是用OM2和用OM3与OM4表面决定簇的定位图确定的制瘤素M分子功能重要区的图解示意图。
M.微生物的寄存做为本发明有代表性的下列细胞系已经被寄存在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，并且已得到下列索取号：
细胞系 入藏号 抗体
11R2F8.9 ATCCHB10398 OM2
12R13D7.2 ATCCHB10396 OM3
1R10F11.34.16 ATCCHB10397 OM1
由于所保藏的具体细胞系是为了对本发明的某个方面进行个别说明，因而本发明的范围并不被这些保藏的细胞系限制，而且任何在功能上等同的细胞系或抗体都属于本发明的范围之内。的确，根据前面的描述和附图，除了所述的那些实施例外，还可以对本发明进行各种修改，这对于本领域中的熟练人员来说是显而易见的。这种修改应当属于本发明权利要求范围之内。