MIR125及其调控的原癌基因POKEMON表达的用途.pdf

1.  MiR125及其调控的原癌基因Pokemon表达的用途，其特征是：作为治疗肝癌的靶点。

2.  根据权利要求书1所述的miR125及其调控的原癌基因Pokemon表达的用途，其特征是：利用所述靶点制备治疗肝癌的药物。

MiR125及其调控的原癌基因Pokemon表达的用途
技术领域
本发明涉及生物医学治疗领域，特别涉及miR125及其调控的原癌基因Pokemon表达在肝癌治疗中的作用。
背景技术
目前尽管早期癌症患者进行了根治性切除和辅助治疗，但仍具有很大的复发和转移的风险。基因治疗将会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个重要的组成部分。靶基因的选取对于基因治疗的疗效起着至关重要的作用。其中，原癌基因Pokemon位于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游，通过ARF-HDM2-p53和Rb-E2F路径对肿瘤发生发展进行调节，可使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此，将其作为靶基因将有助于肿瘤的根治。Pokemon是POK转录抑制因子家族成员之一，它包括一个氨基末端POZ/BTB结构域和羧基端Krüppel型锌手指结构域，是T淋巴细胞、B淋巴细胞和红细胞系发育和成熟的重要因子。Pokemon基因在乳腺癌、肝癌和淋巴瘤等肿瘤的异常表达在癌基因转化和肿瘤的发生过程中发挥着重要的作用。重点是细胞内Pokemon基因的缺失不会对细胞的正常生长造成影响，这为设计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。
微小RNA（microRNA，或miRNA）是一类由内源性基因编码的长度约为18-25个核苷酸，非编码的单链小RNA分子，广泛存在于真核细胞当中。miRNA不仅在植物和动物的基因位置上保守，在基因序列上也呈现出很高的同源性。miRNA并不能够被翻译成蛋白质，它们通常参与转录后水平调节基因的表达。成熟的miRNA如果要发挥作用需要与多种蛋白质结合形成核糖核蛋白复合体，也称为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)，这个复合体能够识别靶基因的特定区域并与之结合，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，RISC通常是与靶基因mRNA的3'UTR（非编码区域）相结合，而细胞内的核酸酶能够识别这一复合物，降解miRNA与mRNA形成的双链结构，导致mRNA无法正常翻译出蛋白质，从而实现对基因表达的调控。一系列的研究表明，miRNA与细胞的增殖和分化密切相关，在机体的各个生理功能中，如癌症、衰老、代谢、细胞分化等，发挥着重要的调节作用，对于基础理论和实际应用都有深远的意义。
    MiR-125是miRNA家族成员之一。早在2007年，Scott等人就发现miR-125作为潜在的抑制乳腺癌的miRNA，在乳腺癌细胞中能够抑制ERBB2和ERBB3的表达，从而达到抑制乳腺癌细胞增殖和转移的目的。紧接着又有研究小组报道miR-125在乳腺癌中能够抑制HuR的表达来抑制细胞增殖。EGFR可以通过调节miR-125的表达来抑制肺癌的转移。不久，在日本的一个研究小组发现miR-125通过靶向ERBB2，抑制了胃癌细胞的增殖。最近又有研究表明miR-125能够感染HBV病毒转录，下调表面抗原的表达。近期国内学者对miR-125在肝癌中的表达情况进行了研究，发现miR-125在肝癌组织中是低表达，miR-125a通过靶向MMP11和VEGF抑制肝癌细胞的增殖和转移。另发现肝癌HepG2细胞中miR-125a低表达，且过表达miR-125a可抑制增殖、诱导凋亡及G0/G1期细胞阻滞，在肝癌的发生发展中可能起到抑癌基因的作用。
现在对于肝癌发病过程中众多可能复杂的因素及其中的具体分子机制的提示还远远不够，鉴于Pokemon作为靶基因的重要性，对于miR-125是否参与调控Pokemon的表达尚未见报道，该实验结果的获得将会对于肝癌新药的开发提供重要指导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供miR125及其调控的原癌基因Pokemon表达在作为治疗肝癌的靶点的用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供了miR125及其调控的原癌基因Pokemon表达的用途：作为治疗肝癌的靶点。
作为本发明的miR125及其调控的原癌基因Pokemon表达的用途的改进：利用该靶点制备治疗肝癌的药物。
在本发明中：通过荧光素酶报告基因实验，我们发现miR-125能和Pokemon的3’UTR（非编码区）区域特异性结合，从而抑制其荧光活性。我们进一步通过实时荧光定量 PCR 和免疫印迹实验（Western blot）研究发现miR-125能抑制Pokemon的mRNA和蛋白的表达水平，提示miR-125是通过降解Pokemon的 mRNA 水平来调控该靶基因的表达水平。通过构建特异性去除 miR-125可能作用于Pokemon的3’UTR 基因片段，我们发现 miR-125不能抑制其活性，提示 miR-125 是特异性与Pokemon的3’UTR 区域相结合而发挥作用的。通过siRNA 特异抑制Pokemon的内源性表达后，显著降低了肝癌细胞的体内及体外的增殖能力。上述实验证实 miR-125能抑制其下游靶基因Pokemon的表达，从而抑制了肝癌细胞的体内体外增殖，进而达到治疗肝癌的目的。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是双荧光素酶报告基因实验验证Pokemon为miR-125的靶基因。
图1中，pMIR-report表示载体对照组，miR125+pMIR-3’UTR表示含有Pokemon基因 mRNA的miR125作用靶点的3’UTR片段的报告基因载体转染稳定表达miR-125肝癌细胞组，miRcontrol+pMIR-3’UTR表示含有Pokemon基因 mRNA的3’UTR的miR-125结合位点的报告基因载体转染对照肝癌细胞组。
图2是双荧光素酶报告基因提示miR-125特异性作用于Pokemon的3’UTR种子区域。
图2中，pMIR-report组、miR125+pMIR-3’UTR组与miRcontrol+pMIR-3’UTR组均与图1相同，miR125+pMIR-3’UTR-D表示特异性去除miR-125种子区域的Pokemon的3’UTR 载体组。
图3是实时荧光定量PCR实验提示miR-125能下调Pokemon的mRNA水平。
图3中，HepG2-125表示稳定表达miR-125的HepG2细胞组，HepG2-NC表示对照组。
图4是western blot实验提示Pokemon是miR-125的靶基因。
图4中，HepG2-125表示稳定表达miR-125的HepG2细胞组，HepG2-NC表示对照组。
具体实施方式
实施例1：构建Pokemon基因的双荧光报告基因载体
使用试剂盒（Gibco公司）提取肝癌细胞总RNA，合成细胞cDNA。具体操作方法详见试剂盒说明书。构建含有Pokemon基因 mRNA的miR125作用靶点的3’UTR片段，设计特异引物序列，上游引物序列为：5'-GGTCGCAGAAGGTGGAGA-3'，下游引物序列为：5'-GGTCGTAGTTGTGGGCAAA-3'。PCR反应体系设为25μL，其中模板1μL，dNTP mix 12.5μL，上游引物及下游引物（20 μmol/l）各0.5μL，ddH₂O 10.5μL。PCR反应参数为94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环。将该PCR片段克隆入荧光素酶报告基因载体 pMIR-REPORT，酶切鉴定，并经测序证实产物序列正确。
实施例2：稳定过表达 miR-125的肝癌细胞系的构建
根据Genebank中收录的人源miR125的cDNA序列以及为克隆所需要引入的XhoⅠ(5’)、EcoRI (3’)两个酶切位点，设计出上下游两条引物：miR125上游引物序列：5’-CTATGTTTGAATGAGGCTTCAG-3’；miR125下游引物序列：5’-CGCGTCGCCGCGTGTTTAAACG-3’。行PCR反应，PCR反应体系同实施例1，PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环。利用XhoⅠ、EcoRⅠ酶切目的片段和pEGFP-N3载体进行酶切与连接，测序证实产物pEGFP-miR125序列正确。通过脂质体Lipofectamine2000转染将构建好的pEGFP-miR125及pEGFP-N3空质粒转染至事先铺至6孔板的HepG2细胞中，具体转染方法见转染试剂说明书。第一周选用700μg/ml G418高压筛选细胞，待细胞大量死亡后改用350μg/ml G418维持筛选，经过一个月的持续筛选，得到稳定过表达miR125单克隆细胞株。
实施例3：双荧光报告基因实验验证Pokemon是miR125的靶基因
将已经稳定过表达 miR-125的肝癌细胞系 HepG2-miR125或HepG2对照细胞按照 1.5×10⁵/孔接种到24孔板，培养24h；用 Lipofectamine2000试剂将 pMIR-Pokemon-3’UTR或pMIR-control空载体分别与对照质粒 pRL-TK共转染入HepG2- miR125或 HepG2-control细胞；转染 48h 后，吸去细胞培养上清，并用 PBS洗涤1次；每孔加入200μL细胞裂解液，12,000 rpm离心10min；取 20μL上清和荧光素酶检测试剂Ⅱ（Luciferase Assay ReagentⅡ， LARⅡ）100μL 混合，在 TD-20/20 荧光发光计检测萤火虫荧光素酶活性，记录为第一读数，然后加入100μL Stop & Glo试剂，在10 min内充分混合后第二次检测读数检测海肾荧光素酶活性；结果以萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性的比值表示，并进行分析。
结果显示报告基因载体pMIR-Pokemon-3’UTR转染稳定表达miR-125的肝癌细胞，细胞荧光素酶活性较载体转染表达对照 miRNA 的肝癌细胞显著降低（p<0.05）（图1）。结果表明Pokemon是miR-125的靶基因，miR-125通过Pokemon基因mRNA的3’UTR的靶位点对其表达进行负调控。
实施例4：双荧光报告基因实验验证miR125的种子区域
为了进一步确定miR-125是通过作用于Pokemon mRNA的3’UTR 的种子区域而发挥作用的，我们设计引物，通过PCR构建了特异性去除 miR-125可能作用种子区域的Pokemon的3’UTR 载体。PCR引物序列如下：上游引物序列为：5'-GCACACTGAACGTCAAGA-3'，下游引物序列为：5'-CGTAGTAGTACTCTGTAGA-3'。PCR反应体系及反应参数详见实施例1。双荧光素酶报告基因实验具体方法详见实施例3。通过双荧光素酶报告基因实验证明，去除了miR-125作用的种子区域后，荧光活性并无改变（图2），提示 miR-125通过作用于Pokemon的 3’UTR 的种子区域而发挥作用。
实施例5：实时荧光定量 PCR验证Pokemon是miR125靶基因
MiRNA一般是通过和靶基因的mRNA的3‘UTR不完全配对，降解靶基因的mRNA 或者阻碍其转录而达到调节靶基因的蛋白表达水平，而发挥调节细胞信号通路的作用。我们通过实时荧光定量 PCR 进一步检测了Pokemon靶基因的mRNA水平的变化。根据PCR试剂盒与扩增仪说明，采用50 μL反应体系： cDNA 5 μL， 2×PCR Master 25 μL，25 mmol/l MgCl₂ 2 μL， Pokemon上游引物 (10 μmol/l) 2 μL，Pokemon下游引物(10 μmol/l) 2 μL。β-actin上游引物(10 μmol/l) 2 μL，β-actin下游引物(10 μmol/l) 2 μL，ddH₂O 10 μL。 反应条件： 预变性94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保温30 min。
结果提示Pokemon的mRNA水平在稳定表达miR-125的HepG2细胞中显著下调（图3），提示 miR-125通过和Pokemon的 3’UTR 相结合，降解了靶基因的 mRNA 水平。
实施例6：Western Blot检测进一步验证Pokemon是miR125靶基因
收集稳定表达miR-125的HepG2细胞，用PBS洗涤细胞2次，然后加入100 μL细胞裂解液裂解细胞，沸水煮5 min，于12000 rpm 4℃离心10 min，取上清测定蛋白浓度，每孔上样50 μg总蛋白，以10 %聚丙烯酰胺凝胶跑胶分离，转PVDF膜，使用一抗于4℃孵育过夜，洗膜，使用二抗室温标记1 h，DAB法显色，照相或扫描保存。以β-actin为内参。
通过Western Blot试验，在蛋白水平进一步检测了Pokemon的表达情况，发现当 miR-125过表达时，可以抑制Pokemon的表达水平（图4）。
实施例7：Pokemon特异性siRNA的构建
为了进一步研究下调Pokemon的表达水平在肝癌发展中的作用，我们针对Pokemon基因设计了特异性siRNA，正义链：5‘-CUCGCUGGUUUCUAUGAGUUU-3';反义链：3'-UUGAGCGACCAAAGAUACUCA-5'。将处于对数生长期的HepG2细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40%即可用于转染。将siRNA干粉溶解于无RNA酶的无菌水中，配置终浓度为20pmol/L的siRNA溶液。转染时，分别取10μL的siRNA溶液和5μL的lipofectamine2000分别稀释于250μL无血清培养液（Opti-MEM）中，并在室温下孵育5 min，然后将上述siRNA溶液和lipofectamine2000溶液混合，复合物与室温下静置20 min后，把500μL的siRNA-脂质体复合物与1.5 mL无血清DMEM培养基混合后，加到细胞培养板中，6 h后换为10% FBS-DMEM培养基，于48 h后收集细胞进行RT-PCR检测。结果表明对照组细胞的mRNA表达的相对强度为0.729，而siRNA转染组的mRNA表达的相对强度为0.597，抑制率差异显著（P<0.05），说明该siRNA能成功下调靶基因的mRNA水平。
实施例8：下调内源性Pokemon的表达水平能抑制肝癌细胞的增殖
将处于对数生长期的HepG2细胞接种于24孔板中，培养至细胞融合度达到约40%，进行细胞转染（转染操作参照实施例2）。转染后于37℃，5% CO₂条件下培养24 h，于结束前4h加入MTT 10μL/孔（浓度为5mg/mL），继续培养4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，于振荡器上震荡10min左右，酶标仪490nm检测OD值。以转染了阴性对照siRNA的HepG2细胞作为阴性对照，以未加任何小干扰RNA处理的HepG2细胞作为空白对照，细胞生长抑制率＝（阴性对照组A值－转染组A值）/阴性对照组A值×100%。结果显示，与转染阴性对照siRNA组相比，转染POKEMON-siRNA后HepG2细胞增殖速度显著降低，HepG2细胞的生长抑制率为16.5%。通过MTT实验，我们发现下调Pokemon能抑制肝癌细胞的增殖能力，进一步说明，miR-125通过调控Pokemon而抑制了肝癌细胞的增殖。
实施例9：下调内源性Pokemon的表达水平能抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长
选择5-6周龄SPF级雌性BALB/c裸鼠，将细胞用胰酶消化成单细胞悬液后，进行细胞计数，用0.4 mL的培养液悬浮3×10⁶细胞，用一次性注射器将细胞悬液注射至裸鼠右腋皮下。待皮下肿瘤长至足够大时，将其无菌取出，在生理盐水中剪成2×2 mm大小的肿瘤块。和套管针将瘤块移植到裸鼠右侧腋下，待瘤块直径约4 mm时，将裸鼠随机分成2组，空白对照组与siRNA组，每组6只。采用瘤内注射，剂量为40 μg/只，采用微量注射器注射，每隔3 d注射1次，共给药7次。用游标卡尺测量瘤块的大小，根据公式ab²/2计算瘤块体积，a为长径，b为短径。第28 d脱颈椎处死动物，剪开局部皮肤，钝性剥离出瘤体组织，电子天平称重，以组为单位计算平均瘤重和肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(C－T)/C×100％。C=对照组平均瘤重；T=给药组平均瘤重。
结果显示，本实验所用的siRNA的肿瘤抑制率为36.01%。进一步说明，miR-125通过调控Pokemon而抑制了肝癌细胞在裸鼠体内的增殖能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。