本发明属于应用微生物方法转化的技术领域。 于1966年开始，Wall等报导从我国引种的喜树（Camptotheca acuminata Denc）中分离得到抗癌有效成分喜树碱Camptothecine（Ⅰ），10-羟基喜树碱10-Hydroxy Camptothecine（Ⅱ）和10-甲氧基喜树碱10-Methoxy Camptothecine（Ⅲ）等。1971年Stork和Schultz等完成了喜树碱的全合成工作，我国以1969年起，陆续从喜树中也分离到喜树碱和10-羟基喜树碱等有关的化合物，1976年又完成了喜树碱和10-羟基喜树碱的全合成。
（Ⅰ）R＝H （Ⅱ）R＝OH （Ⅲ）R＝OCH3
10-羟基喜树碱的化学结构与喜树碱相似，仅在10位上的氢由羟基取代，经动物药理和临床试验证明，在治疗肿瘤方面比喜树碱有较好治疗效果和较低的毒付反应。于1977年10-羟基喜树碱作为肿瘤临床的一只新药，在国内通过鉴定，並应用于治疗肝癌、胃癌、头颈部肿瘤和白血病等。
过去10-羟基喜树碱从喜树中提取，得率甚低，约为生药的十万分之二，提取过程中需用大量有毒的氯仿和甲醇，以及接触有毒的喜树碱等本身物质，致使10-羟基喜树碱的生产发生困难，成本昂贵。制造10-羟基喜树碱的全合成虽然获得成功，由于步骤多;总收率较低，也无生产实际意义。
本发明的目的是为了解决10-羟基喜树碱的生产问题。本发明采用生物转化的方法，将喜树中含量较高的喜树碱（提取得量为万分之七左右），转变为10-羟基喜树碱。作者曾于1978年在科学通报上简单地报导了利用曲霉T-36菌株，可将喜树碱转化为10-羟基喜树碱。后又经过菌种的诱变，菌体生长和转化条件的改进。现采用黄曲霉T-419菌株，使转化率从20%提高到50%以上。特别又研究成功采用了隋性大孔树脂分离提取10-羟基喜树碱的新工艺，进一步降低了生产成本和解决了劳动保护问题，使10-羟基喜树碱具备了实际生产的条件。
利用本发明生产10-羟基喜树碱比原来从喜树中提取10-羟基喜树碱的方法有如下优点。
1.扩大了生产10-羟基喜树碱的来源，用原来从喜树中提取地方法，只能得到十万分之二的10-羟基喜树碱，而另一产量较高的喜树碱因临床毒性较大，而成为无用物质。通过本发明可将这部分喜树碱转变为临床上有较好评价的10-羟基喜树碱。
2.革除了大量氯仿和甲醇以及上硅胶柱分离的工艺，使操作人员免去接触大量有毒气体和喜树碱类本身的粉末。
3.节约了大量溶剂和试剂，再利用了喜树碱后致使10-羟基喜树碱的生产量可大大增加等，使生产成本要比原方法低得多。
一、生物转化的菌株鉴定
我们共筛选了数百株真菌，其中T-36菌株通过对其转化产物的理化分析证明，确具有转化喜树碱为10-羟基喜树碱的能力，后又将T-36菌株的孢子经过紫外光处理10分钟后，所分离得到的变株T-419其形态和培养的基本特征与T-36菌株一致，仅在10-羟基喜树碱的转化率上比T-36菌株高6-10%，故以后的工艺试验皆用黄曲霉菌株T-419，T-419菌株的形态和培养特征：T-419菌株在Czapek′s固体培养基上菌落近园形，很快向四周蔓延，菌落表面带黄绿色的分生孢子。菌丝无色，无可溶性色素分泌。菌丝有横膈，为多细胞的菌丝体。分生孢子梗的顶端膨大成半球形的顶囊，在顶囊表面以辐射方式长出一层或双层小梗，在小梗顶端形成一串分生孢子。这些都是典型的曲霉属Aspergillus的形态特征，在电子显微镜下观察其孢子表面光滑近球形。由于孢子呈黄绿色，故其种应命名为黄曲霉菌株T-419。
二、转化产品的鉴别
喜树碱通过黄曲霉菌株T-419转化后的培养液，菌丝用乙脂提取，滤液用乙酸乙脂提取，分别浓缩后合并，再甲醇迥流，上硅胶柱层析，用氯仿冲洗，除去喜树碱成分，然后收集2-4%甲醇的氯仿的冲洗液，浓缩后得到固体粉末，再在氯仿∶甲醇（1∶1）混合溶剂中结晶数次，即能得到纯的黄色柱状结晶的转化产物。其熔点旋光、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱等的理化性质数据都与天然分离得到的10-羟基喜树碱完全一致（表1）。采用隋性大孔树脂分离获得10-羟基喜树碱经质谱、红外、紫外、核磁光谱分析也与天然的10-羟基喜树碱完全一致。
三、200公升罐内的生物转化工艺实例
1.生物转化的工艺流程：
孢子→30公升罐内种子菌丝培养→200公升罐内转化菌丝培养 (过滤)/() (洗涤)/() (菌丝悬浮于磷酸缓冲液中)/() 菌丝悬浮液 (加入喜树碱转化)/() 含10-羟基喜树碱的转化液。
2.孢子培养：
黄曲霉菌株T-419在Czapek′s斜面培养基上，于27℃生长7天，待表面长出一层黄绿色孢子后，贮于冰箱内备用。Czapek′s斜面培养基成分：葡萄糖5%;氯化铵0.1%;硫酸镁0.05%;磷酸二氢钾0.1%;琼脂2%，消毒前PH调至6.0-6.5。
3.种子菌丝培养：
在30公升罐内装有15公升种子菌丝培养基，消毒冷却后，以一个孢瓶的孢子接种于罐内，在温度27±1℃，通气量1∶1V/Vm搅拌深层培养48小时。种子菌丝培养基成分为葡萄糖2.5%;黄豆并粉2.5%;淀粉1%;氯化钠0.1%;硫酸镁0.05%;磷酸氢二钾0.38%;磷酸二氢钾0.04%，消毒前自然PH。
4.转化菌丝培养：
于200公升罐内装有120公升培养基，消毒冷却后，以10%左右接种量的种子种入罐内，在温度27±1℃，通气量在培养周期24小时前1∶0.3-0.5V/Vm。24小时后，1∶1V/Vm，搅拌深层培养44小时，转化菌丝培养的培养基与种子菌丝培养的培养基相同。
5.生物转化：
在200公升罐内培养好的菌丝，经过滤，水冲洗和空气吹干后，取出称量，再悬浮于包含磷酸氢二钾0.36%，磷酸二氢钾0.04%，PH7.2磷酸盐缓冲液中，同时加入预先溶解的喜树碱使浓度为50-150微克/毫升（PH9-10），在27±1℃通气量1∶1V/Vm和搅拌条件下转化40小时左右。
6.菌丝培养和转化过程中各参数的变化：
在菌丝培养的开始阶段，T-419菌株的菌丝生长很快，伴随着培养基内的糖和氮源消耗加快。待24小时后，菌体生长渐趋迟缓和停顿，此时糖和氮源的利用几乎很低。在整个菌丝生长阶段，PH一直很平稳地维持在5.5左右。在转化阶段，开始的24小时内，喜树碱和10-羟基喜树碱的消长很快，伴随着PH有一定上升，由PH7.0上升到PH7.8，待转化24小时以后，喜树碱和10-羟基喜树碱的消长趋缓慢，此时的PH变化也不大。
用紫外双波长薄层扫描方法，测定三批在200公升罐内10-羟基喜树碱的转化率为63，68和74%。
四、200公升规模用隋性大孔树脂提取分离10-羟基喜树碱的工艺实例。
由于喜树碱等是一类较毒的物质，老的提取和纯化方法不仅要用大量有毒的氯仿和甲醇，而且上硅胶柱层析时，有大量有毒喜树碱类粉子飞扬，这对操作人员的健康有严重危害。我们采用隋性大孔树脂分离提纯10-羟基喜树碱，这不仅能解决劳动保护的问题，还能简化操作步骤，节省大量溶剂。
隋性大孔树脂分离提纯10-羟基喜树碱的工艺流程如下：
转化滤液 (加NaCl至0.2%浓度)/(调PH至6.8-7.0) 隋性大孔树脂吸附 (用0.5%NaCl蒸馏水溶液冲洗)/() (用PH9.5-10蒸馏水洗脱)/() 10-羟基喜树碱洗脱液 (加NaCl至0.2%浓度)/(调PH至6.8-7.0) 第二次隋性大孔树脂吸附 (用0.5%NaCl蒸馏水溶液冲洗)/() (用蒸馏水稍洗工业乙醇洗脱)/() 乙醇洗脱液 (浓缩至干)/() (乙酸乙酯∶甲醇（1∶0.2-1）)/(迥流) (浓缩至小体积)/() (过滤)/() (少量甲醇洗)/() (石油醚)/() (干燥)/() 10-羟基喜树碱粗品 (氯仿∶甲醇（1∶1）)/(重结晶) 10-羟基喜树碱精制品。
200公升罐内所得到的三批转化产品，进行了水份，喜树碱和10-羟基喜树碱的含量测定，得到结果与1977年鉴定会上所规定的天然10-羟基喜树碱的质量标准进行比较。
从表3中看出，通过隋性大孔树脂分离纯化工艺所得到的转化的10-羟基喜树碱产品质量能达到规定的标准。
实施例
黄曲霉菌株T-419在Czapek′s斜面培养基上，于27℃培养7天后，以一个孢瓶的孢子接种到灭过菌的15公升种子菌丝培养基内，在温度27±1℃通气量1∶1V/Vm搅拌深层培养48小时。种子菌丝培养基成份：葡萄糖2.5%;黄豆并粉2.5%;淀粉1%;氯化钠0.1%;硫酸镁0.05%;磷酸氢二钾0.38%;磷酸二氢钾0.04%，消前自然PH。
培养好的种子菌丝再接种到灭过菌的含有与种子菌丝培养基同样成分的120公升培养基内，在温度27±1℃通气量在培养周期24小时前1∶0.3-0.5V/Vm，24小时后1∶1V/Vm，搅拌深层培养44小时。然后培养液经过滤，菌丝用水冲洗，空气吹干取出菌丝17公斤，再悬浮于100公升磷酸盐缓冲液中（磷酸氢二钾0.36%;磷酸二氢钾0.04%，PH7.2），同时加入预先溶解的喜树碱浓溶液10克/100公升（PH9.5），在27±1℃，通气量1∶1V/Vm，和搅拌条件下转化40小时。用双波长紫外薄层扫描法测得转化液中每毫升含65微克的10-羟基喜树碱。
转化液再经过滤，菌丝用少量PH9.5的蒸馏水淋洗，合并后共得滤液130公升，内含10-羟基喜树碱总量5.2克，滤液内加入氯化钠260克，用6NHCl调PH至6.8-7.0，通过内含5公斤的隋性大孔树脂吸附柱吸附后，用15公升0.5%氯化钠溶液淋洗，然后用PH9.5蒸馏水洗脱，得洗脱液30公升，内含10-羟基喜树碱4.9克。洗脱液中加入氯化钠60克，並用6NHCl调PH至6.8-7.0，再通过内含2.5公升的隋性大孔树脂吸附柱吸附，用10公升0.5%氯化钠溶液淋洗，再用少量蒸馏水淋洗后，然后用工业乙醇洗脱，得乙醇洗脱液15公升，内含10-羟基喜树碱4.6克。乙醇洗脱液经减压浓缩至干后，加乙酸乙脂∶甲醇＝1∶1混合溶剂2公升迥流，迥流液浓缩至小体积，过滤，固体用少量甲醇和石油醚洗过后干燥，得粗品4克。粗品用1.5公升氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶剂溶解后过滤，滤液经减压浓缩至有少量结晶析出，放入冰箱，隔天取出过滤，用少量氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶剂淋洗晶体，真空干燥，得纯结晶2.5克，含10-羟基喜树碱99.53%，质量符合药检规格。
《表1》转化后获得产物和天然的10-羟基喜树碱的理化性质测定数据的比较
测定项目 转化后获得产物 天然的10-羟基喜树碱
熔点（分解） 266.5-268℃ 266-267℃
旋光〔α〕20D-140°（C.0.4吡啶） -147°（C0.0674吡啶）
质谱M/e 364（M+） 364（M+）
元素分析 C，62.44 H，4.54 N，7.21 C，62.97 H，4.41 N，7.17
红外光谱厘米-13180，1760，1655，1590 3180，1760，1655，1590
紫外光谱 225（4.70），267（4.45） 225（4.75），267（4.50）
λ甲醇max（logE） 332（4.09），384（4.47） 332（4.16），384（(4.53)
核磁共振谱 0.84（三，3H，J＝7） 0.88（三，3H，J＝7）
溶剂DMSO 1.82（四，2H，J＝7） 1.86（四，2H，J＝7）
5.14（单，2H） 5.18（单，2H）
5.38（单，2H） 5.41（单，2H）
6.40（单，1H，重水交换） 6.44（单，1H，重水交换）
7.26（单，1H） 7.26（单，1H）
7.16-7.48（多，2H） 7.20-7.52（多，2H）
7.95（双，1H，J＝8） 8.04（双，1H，J＝8）
8.30（单，1H） 8.42（单，1H）
10.20（宽，1H，重水交换） 10.30（宽，1H，重水交换）
表2三批10-羟基喜树碱的提取数据
《表3》三批转化的10-羟基喜树碱的质量数据
测定项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 标准
含水量 ＜1 ＜1 ＜1 ＜3
喜树碱含量（%） ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
10-羟基喜树碱含量（%） 97.61 99.53 97.11 ＞93
荧光杂质斑点 ＜3 ＜3 ＜3 ＜3