一种多靶点抗肿瘤中药活性组分的筛选方法及应用.pdf

一种用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分的筛选方法，具体为从人乳腺癌MCF-7细胞株中提取出含EGFR、TNFR、Fas的受体富集区，连接在硅胶固定相上，构成分离硅胶柱或色谱柱，实现了多靶点抗肿瘤中药活性组分高效筛选，改变了中药活性组分单一靶点筛选的现状，不仅为高效筛选EGFR、TNFR、FAS抑制剂提供了范例，其设计思路对其他抗肿瘤药物活性组分的筛选提供了借鉴和参考价值，而且也证实了在中药活性组分的筛选中具有广泛的应用空间。本发明公开了其制法。

1.  一种用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的分离硅胶柱或色谱柱的制法，其特征是它包括如下步骤：
(1)MCF-7细胞的培养及扩增：
用含10％小牛血清(NBS)的DMEM培养基培养和扩增MCF-7细胞，调整细胞数浓度为1×10⁷～10×10⁷个/ml，备用；
(2)多靶点受体富集区的提取：
收集(1)的MCF-7细胞中加入含有去垢剂的裂解液，抽提多靶点受体富集区；再用蔗糖密度梯度离心法将受体富集区分离出来，将含有蔗糖的受体富集区混悬液置4℃，pH7.2-7.5的80-120mM Tris-HCL溶液中，透析20-26h，将含有多靶点受体富集区的溶液置于-80℃冰箱备用。
(3)多靶点受体修饰的分离硅胶柱或色谱柱的制备
取所述的9ml含有多靶点受体富集区的Tris-HCL溶液加入3-5g活化处理后的硅胶中，置2-6℃，恒温振摇20-26h；22-28℃静置1-3h；加入pH 7.2-7.5的100mMTris-HCL 15-25ml，混匀后静置3-8min；2-6℃500rpm离心8-12min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置3-8min；重复三次；得到表面修饰有多靶点受体修饰的硅胶的混悬液，装柱，制得用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的常压硅胶柱或色谱柱。

2.  一种权利要求1所述的色谱柱的制法制得的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的常压硅胶柱或色谱柱。

3.  权利要求2所述的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的常压硅胶柱或色谱柱在筛选中药中抗肿瘤活性组分中的应用。

一种多靶点抗肿瘤中药活性组分的筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及用于多靶点抗肿瘤中药活性组分筛选的常压分离柱或色谱柱。
背景技术
单成分、单靶点药物的研发模式已经受到了越来越多的挑战，创新药物研发成本不断上升，而研发效率却逐渐降低的反常现象引发了学者们深刻的思考，“单靶点、高亲和力、高选择性”的药物研发理念受到了越来越多的质疑[参见：Darras FH,Pockes S,Huang G,Wehle S,Strasser A,Wittmann HJ,et al.Synthesis,biological evaluation,and computational studies of Tri-and tetracyclic nitrogen-bridgehead compounds as potent dual-acting AChE inhibitors and hH3receptor antagonists.ACS ChemNeurosci.2014；5:225-42；Darras FH,Pockes S,Huang G,Wehle S,Strasser A,Wittmann HJ,et al.Synthesis,biological evaluation,and computational studies of Tri-and tetracyclic nitrogen-bridgehead compounds as potent dual-acting AChE inhibitors and hH3 receptor antagonists.ACS ChemNeurosci.2014；5:225-42.]。取而代之的“多靶点、低亲和力、低选择性”的药物研发模式将可能成为未来全球创新药物研发的重点[参见：Wells GJ.Editorial:allosteric modulators of g protein-coupled receptors.Curr Top Med Chem.2014；14:1735-7；Wells GJ.Editorial:allosteric modulators of g protein-coupled receptors.Curr Top Med Chem.2014；14:1735-7.]。因而，充分汲取中医药的理论精髓及几千年的临床用药经验，运用现代科学技术手段，加强对多组分、多靶点中药的研究与开发将成为我国药物研发的主流模式之一。然而，如何建立符合多组分、多靶点中药自身特点的中药活性组分的筛选体系，目前尚没有明确、公认的研究思路和技术方案。
细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，CMC)是将细胞膜结合到硅胶表面制成细胞膜固定相，利用色谱学分析技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。此法被广泛应用于从中药复杂体系中筛选活性部位、受体亚型药物的筛选和药物与受体的亲和作用等[参见：Dostalova Z,Zhou X,Liu A,Zhang X,Zhang Y,Desai R,et al.Human alpha1beta3gamma2L gamma-aminobutyric acid type A receptors:High-level production and purification in a functional state.Protein Sci.2014；23:157-66.]。由于细胞膜上的受体与药物有效成分的结合具有特异性、可逆性、饱和性、竞争性等特点， 因此，CMC测定过程特异性高、重复性高、稳定性高，容易实现自动化操作及管理，是高通量筛选中草药中有效活性部位和活性部位的新型技术。但CMC也存在某些不足之处，细胞膜容易失活，无法长期保存，色谱柱使用寿命很短。细胞膜上受体众多，目前基于细胞膜色谱法的研究主要集中在单一靶位的研究，研究思路及途径较为局限。
肿瘤细胞的发生发展由众多信号通路共同调控。抗肿瘤机制的研究一直是热点和难点，通常只能从某一蛋白或某一生物大分子入手，犹如大海捞针，耗时长、效率低且结果往往并不理想。EGFR、TNFR、Fas多靶点的共同筛选，提示了中药活性组分潜在的抗癌机制，即分别以EGFR介导的MAPK增殖信号通路和TNFR、Fas介导的Bcl 2家族凋亡信号通路。而药物活性组分通常是多靶点多途径的发挥生物作用，基于此，构建多受体多靶点的富集区模型成为亟待解决的难题。构建多靶点受体的新型药物筛选，可以实现中药活性组分多靶点高效筛选，改变了中药活性组分单一靶点筛选的现状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱及其制备方法和在筛选中药内抗肿瘤活性成分中的应用。
为实施上述目的，本发明的技术方案如下
一种用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱的制法，它包括如下步骤：
(1)MCF-7细胞的培养及扩增：
用含10％小牛血清(NBS)的DMEM培养基培养和扩增MCF-7细胞，调整细胞数浓度为1×10⁷～10×10⁷个/ml，备用；
(2)多靶点受体富集区的提取：
收集(1)的MCF-7细胞中加入含有去垢剂的裂解液，抽提多靶点受体富集区；再用蔗糖密度梯度离心法将受体富集区分离出来，将含有蔗糖的受体富集区混悬液置4℃，pH7.2-7.5的80-120mM Tris-HCL溶液中，透析20-26h，将含有多靶点受体富集区的溶液置于-80℃冰箱备用。
(3)多靶点受体修饰的硅胶柱的制备
取所述的9ml含有多靶点受体富集区的Tris-HCL溶液加入3-5g活化处理后的硅胶中，置2-6℃，恒温振摇20-26h；22-28℃静置1-3h；加入pH 7.2-7.5的100mM Tris-HCL15-25ml，混匀后静置3-8min；2-6℃500rpm离心8-12min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置3-8min；重复三次；得到表面修饰有多靶点受体修饰的硅胶的混悬液，装柱， 制得用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱或色谱柱。
一种上述的色谱柱的制法制得的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱或色谱柱。
上述的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱在筛选中药中抗肿瘤活性组分中的应用。
多靶点受体修饰的硅胶的鉴定
取上述制备的多靶点受体修饰的硅胶固定相的混悬液，分别加入的EGFR、TNFR和Fas的一抗稀释液(1∶100)200μL及不同荧光的二抗稀释液(1:500)200μL，于倒置荧光显微镜下观察结果。荧光显微镜下观察，结果见图2，所有经多靶点受体修饰的硅胶固定相微球表面特异性的荧光均一，鲜亮。
筛选天然中药活性组分的方法
对北葶苈子的不同提取组分用多靶点受体修饰的硅胶柱分离，根据40μM卵磷脂+100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH 7.4洗脱后，紫外检测样品在硅胶柱上的保留行为，确定有无活性部分，筛选出具有抗肿瘤活性的有效组分。实验结果提示北葶苈子的提取物在多靶点受体修饰的硅胶柱上有保留行为，因此推断该保留组分具有抑瘤活性。
体外抗肿瘤活性评价
将提取的北葶苈子活性组分以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分别作用于人乳腺癌细胞株MCF-7，72h后MTT法检测其对肿瘤细胞生长的作用。
4：体外抗肿瘤信号通路研究
Western t检测多靶点的蛋白表达的作用
将北葶苈子的活性组分及5-Fu分别以0.07μg/mL、0.77μg/mL、7.7μg/mL作用于MCF-7细胞株24h后，Western blot检测两种药物对erk磷酸化、Bcl2及Bax蛋白表达的作用。实验结果表明活性组分的中、高浓度组及5-Fu高浓度组，使erk的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。北葶苈子活性组分与同浓度5-Fu相比，可以显著降低erk的磷酸化水平。北葶苈子活性组分和5-Fu的低、中、高三个浓度均使Bcl2蛋白的表达水平明显降低，Bax蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。北葶苈子活性组分的中、高浓度组与5-Fu中、高浓度组相比，能显著增加Bax蛋白的表达水平(P<0.05)。北葶苈子活性组分三个浓度组之间，对Bcl2和Bax蛋白的作用表现出浓度依赖关系(图3)。
免疫荧光染色检测
MCF-7细胞以密度为30％接种于24孔培养板，细胞培养24h，分别加入北葶苈子活性组分或5-Fu 0.77μg/m L，再培养36h。弃上清，4％多聚甲醛4℃固定，过夜，PBS洗涤三次后加入0.3％的TritonX-100反应30min。PBS洗涤三次后分别加入鼠抗p-Erk抗体(1:1000)、兔抗Bcl2抗体(1:500)、兔抗Bax抗体(1:500)、鼠抗PCNA抗体(1:1000)4℃，孵育过夜。PBS洗涤三次后，分别加入羊抗鼠Cy3、羊抗兔Cy3荧光二抗室温孵育4h。最后用0.2μmol/L DAPI蓝色荧光染料染细胞核10min。甘油封片后在荧光倒置显微镜下观察结果。实验结果表明：MCF-7分别用北葶苈子活性组分或5-Fu 0.77μg/mL作用36h，荧光显微镜观察细胞P-erk、Bcl2和Bax的荧光表达。与空白对照相比，P-erk和Bcl2的表达被抑制，红色荧光减弱；而Bax的表达增加，红色荧光增强(图4)。
有益效果
本发明的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱或色谱柱可以构建富含EGFR、TNFR、Fas多靶点抗肿瘤中药活性组分筛选方法，提示了北葶苈子活性组分潜在的抗癌机制，即分别以EGFR、TNFR、Fas为起点所介导的不同信号通路实现的。由此证实了多靶点抗肿瘤中药天然活性组分的筛选方法筛选出的中药活性组分，其抑瘤机理为富含的受体分子所介导的信号通路。多靶点的受体富集区模型为阐明药物抗肿瘤机理提供了新的手段和思路。
附图说明
图1构建的富含EGFR、TNFR、Fas多靶点抗肿瘤中药活性组分筛选方法实验流程图
图2多靶点受体修饰的硅胶固定相的免疫荧光图
图3北葶苈子活性组分体外抗肿瘤活性效果评价
图4北葶苈子活性组分及5-Fu不同浓度对MCF-7细胞株蛋白表达的影响
图5北葶苈子活性组分和5-Fu对通路影响的免疫荧光图
具体实施方式
实施例1：用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱的制备
(1)MCF-7细胞的培养及扩增：
用含10％小牛血清(NBS)的DMEM培养基培养和扩增MCF-7细胞，调整细胞数浓度为1×10⁷个/ml，备用；
(2)多靶点受体富集区的提取：
收集(1)的MCF-7细胞中加入含有去垢剂的裂解液，抽提多靶点受体富集区；再用蔗糖密度梯度离心法将受体富集区分离出来，将含有蔗糖的受体富集区混悬液置4℃，pH7.2的80mM Tris-HCL溶液中，透析24h，将含有多靶点受体富集区的溶液置于-80℃冰箱备用。
(3)用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶柱的制备
取所述的9ml含有多靶点受体富集区的Tris-HCL溶液加入3g活化处理后的硅胶中，置4℃，恒温振摇24h；25℃静置1h；加入pH 7.2的100mM Tris-HCL 25ml，混匀后静置5min；4℃500rpm离心10min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置5min；重复三次；得到多靶点受体修饰的硅胶柱的混悬液，装柱，制得用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的常压硅胶柱。
实施例2：用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的色谱柱的制备
(1)MCF-7细胞的培养及扩增：
用含10％小牛血清(NBS)的DMEM培养基培养和扩增MCF-7细胞，调整细胞数浓度为10×10⁷个/ml，备用；
(2)多靶点受体富集区的提取：
收集(1)的MCF-7细胞中加入含有去垢剂的裂解液，抽提多靶点受体富集区；再用蔗糖密度梯度离心法将受体富集区分离出来，将含有蔗糖的受体富集区混悬液置4℃，pH 7.5的120mM Tris-HCL溶液中，透析20h，将含有多靶点受体富集区的溶液置于-80℃冰箱备用。
(3)用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的色谱柱的制备
取所述的1ml含有多靶点受体富集区的Tris-HCL溶液加入5g活化处理后的硅胶中，置4℃，恒温振摇24h；25℃静置3h；加入pH 7.5的120mM Tris-HCL 15ml，混匀后静置5min；4℃500rpm离心15min，弃去上清，加入PBS，混匀后放置5min；重复三次；得到表面修饰有多靶点受体修饰的硅胶柱的混悬液，装柱，制得用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的色谱柱。
实施例3：多靶点受体修饰的硅胶固定相的鉴定
取上述制备的用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的硅胶固定相的混悬液，分别加入的EGFR、TNFR和Fas的一抗稀释液(1∶100)200μL及不同荧光的二抗稀释液(1:500)，于倒置荧光显微镜下观察结果。荧光显微镜下观察结果见图2，所有经多靶点受体修饰的硅胶固定相微球表面特异性的荧光均一，鲜亮。实验结果表明EGFR、Fas和TNFR成功连接在硅胶固定相上。
实施例4：天然中药活性组分的筛选
对北葶苈子的不同提取组分用多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的色谱柱进行分离，根据40μM卵磷脂+100μM胆固醇+2％胆酸钠+10mM乙酸铵，pH 7.4洗脱后，紫外检测样品在柱上的保留行为，确定有无活性组分，筛选出具有抗肿瘤活性的有效组分。实验结果提示北葶苈子的提取物在用于多靶点抗肿瘤中药天然活性组分筛选的色谱柱上有保留行为，因此推断其萃取物具有抑瘤活性。
实施例5：体外抗肿瘤活性评价
将提取的北葶苈子活性组分以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分别作用于人乳腺癌细胞株MCF-7、，72h后MTT法检测其对肿瘤细胞生长的作用。MTT实验结果表明：所提取的活性组分可以促进MCF-7细胞株死亡(见图3)。
实施例6：活性组分体外抗肿瘤信号通路研究
将北葶苈子的活性组分及5-Fu分别以0.07μg/mL、0.77μg/mL、7.7μg/mL作用于MCF-7细胞株24h后，Western blot检测两种药物对erk磷酸化、Bcl2及Bax蛋白表达的作用。实验结果表明有保留组分的中、高浓度组及5-Fu高浓度组，使erk的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。北葶苈子有保留的组分组与同浓度5-Fu相比，可以显著降低erk的磷酸化水平。北葶苈子有保留的组分和5-Fu的低、中、高三个浓度均使Bcl2蛋白的表达水平明显降低，Bax蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。北葶苈子活性组分的中、高浓度组与5-Fu中、高浓度组相比，能显著增加Bax蛋白的表达水平(P<0.05)。北葶苈子活性组分三个浓度组之间，对Bcl2和Bax蛋白的作用表现出浓度依赖关系(见图4)。
MCF-7细胞以密度为30％接种于24孔培养板，细胞培养24h，分别加入北葶苈子活性组分或5-Fu 0.77μg/m L，作用细胞36h后，荧光显微镜观察细胞P-erk、Bcl2和Bax 的荧光表达。与空白对照相比，P-erk和Bcl2的表达被抑制，红色荧光减弱；而Bax的表达增加，红色荧光增强(见图5)。