一种可注射型的自体骨修复材料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种可注射型的自体骨修复材料及其制备方法，属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域。本发明所述的可注射型自体骨修复材料包括支架材料与种子细胞，种子细胞与支架材料复合，形成具有立体结构与生理活性的复合体，以可注射型纤维蛋白胶为支架材料，浓缩自体骨髓获得种子细胞。所述种子细胞为浓缩骨髓获得的骨髓有核细胞。本发明还提供了一种可注射型组织工程骨修复材料的构建方法。该方法中，浓缩骨髓可获得即刻使用、治疗剂量的骨髓有核细胞，与纤维蛋白胶相容性良好，可成功修复骨不连及骨缺损。本发明综合了细胞治疗、支架材料的优点，无需细胞体外培养的不足之处，具有广阔的临床应用前景。

1.  一种可注射型的自体骨修复材料，其特征在于，所述材料包括支架材料和负载在支架材料上的种子细胞，所述支架材料为纤维蛋白胶，所述的种子细胞为骨髓有核细胞。

2.  一种权利要求1所述的材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）配制骨髓有核细胞悬液，骨髓有核细胞浓度为26.7~31.3×10⁶/ml，细胞集落形成单位为279~569 /ml；
（2）将步骤1配置的骨髓有核细胞悬液在无菌条件下与催化液混匀，得到含有骨髓有核细胞的催化液，骨髓有核细胞的终浓度为5×10⁶/ml；所述催化液为冻干人凝血酶1000IU溶于2ml溶媒所得的溶液；
（3）使用时，将主体胶溶液与含有骨髓有核细胞的催化液按体积比1:1混匀，即获得自体骨修复材料；所述主体胶溶液为冻干人纤维蛋白原160mg溶于2ml溶媒所得的溶液。

一种可注射型的自体骨修复材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体涉及一种可注射型的自体骨修复材料及其制备方法。
背景技术
作为21世纪生命科学领域的重大前沿课题，骨组织工程学通过使用支架材料与种子细胞复合构建生物活性骨组织的方法，突破了以往的治疗模式，提供了全新的思路和方法，是目前公认的最有可能在临床应用和产业化开发取得实际效益的前沿研究领域。目前，临床上应用较多的各种固体骨修复材料如羟基磷灰石、β磷酸三钙等虽然有较好的骨修复效果，但必须预先成形，且材料要么太脆、要么太硬，术中难以塑形成所需形状。临床中各种原因所致骨缺损往往形态各异，如骨囊肿或骨肿瘤刮除术后的骨缺损及复杂外伤所致骨缺损常常是不规则形的。常用的固体骨修复材料难以塑形成合适的形状，不适用于不规则形骨缺损的治疗。为了适应临床的需要，可溶性或可注射型骨修复材料正逐渐引起了骨科学者的注意。开发可注射型骨修复材料,，使用方便，可塑性好，可适用于各种不规则骨缺损，且可在局部注射应用，也可用于非手术方法治疗骨折，具有广阔的临床应用前景。以往直接注射骨髓疗法，其内所含成骨细胞浓度较少，而培养的骨髓基质细胞，存在所需时间长，难以及时使用，过程复杂等缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可注射型的自体骨修复材料及其制备方法。该生物活性骨修复材料通过使用浓缩骨髓有核细胞复合纤维蛋白胶构建，植入体内后可任意塑形，方法简单、可靠，不存在免疫排斥问题，可以及时获得治疗浓度的细胞，一次操作解决问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种可注射型的自体骨修复材料，所述材料包括支架材料和负载在支架材料上的种子细胞，所述支架材料为纤维蛋白胶，所述的种子细胞为骨髓有核细胞。
可注射型的自体骨修复材料的制备方法包括以下步骤：
(1)配制骨髓有核细胞悬液，细胞浓度为26.7～31.3×10⁶/ml，细胞集落形成单位为279～569/ml；
(2)将步骤1配置的骨髓有核细胞悬液在无菌条件下与催化液混匀，使骨髓有核细胞的终浓度为5×10⁶/ml；所述催化液为冻干人凝血酶1000IU溶于2ml 溶媒所得之溶液；
(3)使用时，将主体胶溶液与含有骨髓有核细胞的催化液按体积比1:1混匀，即获得自体骨修复材料；所述主体胶溶液为冻干人纤维蛋白原160mg溶于2ml溶媒所得的溶液。
本发明的有益效果在于：本发明通过浓缩骨髓有核细胞，以及时获得治疗浓度的细胞，一次操作解决问题，为临床常见的骨缺损修复提供一种可即刻使用的种子细胞；复合临床广泛使用的纤维蛋白胶支架材料，可有效解决细胞的流失问题，构建的组织工程骨是一种简单、经济、微创的修复骨缺损的方法，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为浓缩后的骨髓有核细胞的碱性磷酸酶染色图
图2为单纯纤维蛋白胶固化后的SEM图；
图3为有核细胞与胶混合较均匀后的光学显微镜图；
图4为细胞粘附于纤维蛋白胶4小时后的SEM图；
图5为兔桡骨术后的X光片；
图6为B和C组在4周时的照片(HE，×200)；
图7为B和C组在8周时的硬组织切片图(苦味酸－品红染色×1)；
图8为B和C组在12周时的硬组织切片图(苦味酸－品红染色×1)。
具体实施方式
本发明所述的可注射型组织工程骨修复材料，所述材料包括支架材料和负载在支架材料上的种子细胞，所述支架材料为纤维蛋白胶，所述的种子细胞为骨髓有核细胞。在制备过程中，先浓缩骨髓，以及时获得治疗浓度的骨髓有核细胞，一次操作解决问题，为临床常见的骨缺损修复提供一种可即刻使用的种子细胞；将浓缩后的骨髓有核细胞与催化液进行混合，然后再将混有骨髓有核细胞的催化液与主体胶溶液进一步混合，使得主体胶溶液形成可注射的凝胶(纤维蛋白胶)，纤维蛋白胶为细胞附着及生长提供了所必需的支架，从而避免了单纯骨髓注射时有核细胞浓度下降的问题。这种材料不仅保持了纤维蛋白胶的降解作用，有利于组织的愈合，复合的细胞逐步释放；而且细胞负载率高，从而与成骨同步起来，可有效解决细胞的流失问题，具有广阔的临床应用前景。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
步骤一：种子细胞的获取
自髂骨抽取骨髓，采集的骨髓经过滤，去除脂肪、骨屑等。用Ficoll密度梯度离心法，应用血液成份分离机(EPPENDORF CENTRIFUGE 5417R)，4℃下3500r/min×8min密度梯度离心，去除红细胞、多核细胞、血清和细胞碎片，收集到骨髓有核细胞悬液备用。
取浓缩骨髓行血细胞计数，评价浓缩前后的有核细胞数量变化。另外取浓缩骨髓与未浓缩骨髓做体外培养，完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)，置于CO²孵箱(美国Harris公司)隔日换液去除不贴壁细胞，9天后对细胞集落形成单位计数，并行碱性磷酸酶染色评价其活性。浓缩后，骨髓中有核细胞数量由(4.5±1.0)×10⁶/ml提高至(29.0±2.3)×10⁶/ml，细胞集落形成单位由(178±98)/ml浓缩至(424±145)/ml，碱性磷酸酶染色显示为强阳性，如图1所示。
步骤二：复合构建
将浓缩骨髓无菌条件下与催化液(冻干人凝血酶1000IU溶于2ml溶媒所得之溶液)混匀，使细胞终浓度为5×10⁶/ml。
分别将等量的主体胶溶液与含有浓缩骨髓的催化剂溶液加入双腔注射器针管中。混合即得到生物活性骨。行骨髓注射前取少许浓缩骨髓纤维蛋白胶混合物行电镜观察，并行细菌学培养及长期培养细胞检验有无致瘤性。
所用冻干人纤维蛋白胶由华兰生物工程股份有限公司生产(国药准字S20020086)，所述主体胶溶液是冻干人纤维蛋白原160mg溶于2ml溶媒所得之溶液。催化剂溶液为冻干人凝血酶1000IU溶于2ml溶媒所得之溶液。二者混合即得凝胶状的纤维蛋白胶支架材料。
所有混合物细菌学培养均为阴性。长期培养，传5代后均未见细胞形态、生物学性状改变。单纯纤维蛋白胶固化后在电镜下观察见孔隙均匀，孔孔相通，有利于细胞的营养交换(图2)。浓缩骨髓与纤维蛋白胶混合后，光镜下见有核细胞与胶混合较均匀(图3)；电镜下见复合物表面布满小孔，细胞粘附于其上。4小时后电镜观察见细胞伸出伪足，与胶相容性良好(图4)。
步骤三：动物骨不连修复实验
新西兰大白兔36只(购自上海第九人民医院实验动物中心)，体重(2100±300)g，6个月龄，雌雄不限。无菌条件下构建左桡骨长1.5cm的陈旧性骨缺损模型。术后1月拍X光片检查构建效果并进行手术修复。实验动物随机分为3组：A组：纤维蛋白胶组；B组，纤维蛋白胶复合自体骨髓组；C组，纤维蛋白胶复合浓缩骨髓组(分别将等量的主体胶溶液与含有浓缩骨髓的催化剂溶液加入双腔注射器针管中，注入到需要修复处)。
各组分别于术后4W、8W、12W摄X片观察骨缺损区新骨形成情况。(投照 距离1m，投照条件46kV,50mA，曝光时间0.14s)，观察骨缺损愈合情况。所有照片依据Yang等的评分标准进行放射学评分。
严密观察新西兰大白兔的一般情况。术后8、12周处死动物取标本行硬组织切片，苦味酸－品红染色观察成骨情况，有无异物排斥反应。
结果如图5所示：本发明前期的研究表明兔桡骨1.5cm骨缺损不能自行愈合，是理想的骨缺损动物模型。X线观察在术后4周均未见骨缺损的修复，术后8周在C组见缺损区内少许高密度影，两断端稍模糊，桡骨外部骨痂较多，缺损处内侧尺骨皮质密度增高，而B组见两断段有新生骨向骨缺损区生长，缺损区内侧尺骨皮质旁密度稍增高。术后12周在C组骨缺损处呈均匀一致高密度影，有9只兔桡骨双侧骨皮质连续，与断端分界不清，骨缺损已塑型改造，髓腔贯通；而B组亦见骨缺损的修复，骨痂较成熟，髓腔贯通不明显。A组在观察时间点内均未见骨缺损的修复。
对骨缺损区的Yang氏评分行统计学分析表明，随着时间的延长，新生骨组织均有不同程度的增多，各组之间的差别有统计学意义(F＝45.841，P＝0.000)。各组间的新生骨组织量有显著性差异(F＝135.311，P＝0.000)，从各时间点看，每一时间点各组的新生骨组织量均有显著性差异，F值分别为40.167，20.364均为P＜0.05。时间点与是否浓缩骨髓之间存在的交互效应有统计学意义(F＝1.978，P＝0.185)。
表1、B、C两组在8、12周的X线评分表

说明：＊主效应的F统计量和P值；#交互效应的F统计量和P值。
硬组织切片观察：如图6所示，因4周时取标本均见无肉眼可见成骨，标本被软组织及纤维蛋白胶包裹，故未行硬组织切片。如图7所示，8周时在C组见桡骨断端有部分成骨，为较幼稚的骨组织；B组亦见少量较幼稚的成骨。如图8所示，12周时见C组成骨较成熟，骨细胞排列较整齐，髓腔及新骨中仍有少许未降解的纤维蛋白胶参杂于其中，新骨在塑型中，而B组见成骨中仍有较 多未降解纤维蛋白胶，成骨多为黄绿色的未矿化的类骨质。A组未见明显成骨。