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本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说是涉及一株可代谢己烯雌酚的黑曲霉。可代谢己烯雌酚的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株号为YAT，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）登记保藏；保藏号为CGMCC No.10568，保藏日期为2015年2月11日。本发明提供的黑曲霉能有效降解20mg/L的己烯雌酚，用本菌株可开发相应的环保生物制剂，为降解或清除环境和食品中的己烯雌酚残留提供了重要资源，具有良好的应用前景。

1.  一株黑曲霉（Aspergillus niger）YAT，其特征在于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 10568，保藏日期为2015年2月11日。

2.  权利要求1所述黑曲霉（Aspergillus niger）YAT，其特征在于：可有效降解己烯雌酚，为环境或食品中己烯雌酚的残留降解或消除提供良好菌源。

一株有效降解己烯雌酚的黑曲霉
技术领域
本发明涉及利用微生物进行环境治理的领域，具体涉及一株可降解己烯雌酚的黑曲霉。
背景技术
己烯雌酚是一种人工合成的非甾体雌激素类药物，曾被用作提高动物的繁殖性能和生产性能的药物。己烯雌酚作为一种内分泌干扰物，能够引起肝脏损伤，基因突变以及人体内激素失调，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。己烯雌酚作为一种内分泌干扰物，受到科学界和公众的广泛关注。由于其对激素系统有影响，对机体具有慢性毒性，1970年被美国FDA禁止使用。中华人民共和国农业部发布的《2003年度动物性产品中兽药残留监控计划》中要求己烯雌酚不得在动物性食品中检出。
目前己烯雌酚的残留问题仍然很严重，加泰罗尼亚地区的污水处理厂排出的废水中己烯雌酚的含量为34 ng/L，高舒榭等对南阳市市售鸡肉随机抽取检测的40份样品中均检出了己烯雌酚，残留量最高的样品达10 mg/kg。动物养殖户违规使用，化学排放，污水处理厂和垃圾填埋场等都可能导致己烯雌酚残留于动物性食品、水体和土壤环境中。近年来，降解或消除己烯雌酚的方法已受到广泛关注。
微生物降解法被认为是消除有害化合物污染的佳选方法之一。徐冉芳等筛选的一株己烯雌酚降解菌沙雷氏菌S可在7 d内降解68.3%的基础盐培养基中的50 mg/L的己烯雌酚；张卫卫等筛选的假单胞菌能有效降解80 mg/L的己烯雌酚，Zhang等筛选了一株对己烯雌酚具有降解作用的假单胞菌。目前关于具有己烯雌酚降解能力的真菌尤其是黑曲霉还未见报道。1989年，美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料工业协会（AAFCO）公布的42种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物（GRAS）”可作为微生态制剂的菌种中包括黑曲霉；2008年，我国农业部公告（第1126号）公布的饲料添加剂的菌种中也包括了黑曲霉。本发明提供了一株来源于市售砖茶的具有己烯雌酚降解能力的黑曲霉为环境中己烯雌酚的有效去除提供了良好的菌种资源，同时其来源和菌种保证其应用的安全性，可为环境和食品中己烯雌酚的残留降解或消除提供良好菌源。
发明内容
本发明的目的是提供一株可有效降解己烯雌酚的菌株—黑曲霉（Aspergillus niger）YAT。
本发明所提供的降解菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）YAT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 10568，保藏日期为2015年2月11日。
所述黑曲霉降解己烯雌酚的步骤为：(1) 菌株YAT活化：挑取黑曲霉YAT于PDA培养基上划线，28 ℃培养72 h。
(2) 菌株YAT降解己烯雌酚：用无菌生理盐水将PDA培养基上的孢子洗脱并混匀制备孢子悬液。移取1 mL孢子悬液接种于装有29 mL MM培养基（含0.2%吐温80）的250 mL三角瓶中，加入己烯雌酚至一定浓度，以1 mL生理盐水代替菌悬液为空白对照。28 ℃、180 r/min振荡培养，定时取样，提取己烯雌酚，采用HPLC测定己烯雌酚降解率。
所述微生物降解己烯雌酚体系中己烯雌酚的提取方法为：采用全量（整瓶培养液）取样方式，加入30 mL 的甲醇，于超声波清洗器（AS10200A）中超声提取30 min；取2.0 mL超声提取液于刻度试管中，用甲醇定容至10 mL，混匀，取1.5 mL 样品12 000 r/min离心15 min，上清液用0.45 μm有机相滤膜过滤，弃去约0.5 mL初滤液，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，仪器为LC-10A2010C HT型液相色谱仪。
所述微生物降解体系中己烯雌酚的HPLC检测方法为：LC-10A2010C HT型液相色谱系统，Sepax GP-C18柱（150 mm×4.60 mm，5.0 μm）为色谱柱，甲醇:水（7:3 v/v）为流动相，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，用紫外检测器在242 nm处检测。
本发明所用培养基为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：新鲜土豆去皮切块，称取200 g，加入500 mL蒸馏水煮沸20 min，过滤，加葡萄糖 20 g，琼脂20 g，再加蒸馏水至1000 mL，121 °C灭菌15 min；基础盐培养基（MM）：硫酸铵1.5 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121 °C灭菌15 min。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：该黑曲霉降解环境和食品中的己烯雌酚，具有菌源安全，降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境和食品中的己烯雌酚残留提供了较好的资源。
附图说明
图1为降解菌株YAT处理前后己烯雌酚的HPLC谱图，图中0 h为含接种YAT的20 mg/L己烯雌酚的MM培养基中0 h取样处理，HPLC检测的色谱图，4 d为培养4 d后取样进行HPLC检测得到的的色谱图。
图2为降解菌株YAT对20 mg/L己烯雌酚的降解曲线。图中，横坐标为培养时间（d），纵坐标为己烯雌酚降解率（%）。
具体实施方式
实例1：不同培养时间菌株YAT降解己烯雌酚的情况。
种子液制备：挑取YAT菌种于PDA平板上划线，于28 °C恒温培养箱中培养72 h后挑取单菌落在PDA斜面培养基上划线，28 °C恒温培养箱中培养72 h；用无菌生理盐水将斜面培养基上的YAT菌苔洗脱并混匀制成种子液（孢子浓度约为10⁸ CFU/mL）。
取1 mL种子液接种于29 mL（250 mL三角瓶）己烯雌酚浓度为20 mg/L的含0.2%吐温80的MM培养基中，以1 mL 生理盐水代替种子液为空白对照，28 °C、180 r/min 振荡培养4 d，每24 h取样，甲醇超声提取，HPLC检测己烯雌酚浓度。降解菌株YAT处理前后己烯雌酚的HPLC谱图见图1；降解菌株YAT作用于20 mg/L己烯雌酚的降解曲线见图2。菌株YAT对20 mg/L己烯雌酚具有明显的降解作用，4 d内可降解75.32 %己烯雌酚。
所述己烯雌酚提取方法为：采用整瓶培养液的取样方式，加入30 mL甲醇，于超声波AS10200A清洗器中超声提取30 min；取2.0 mL超声提取液于刻度试管中，用甲醇定容至10 mL，混匀，取1.5 mL 样品12 000 r/min离心15 min，上清液用0.45 μm有机相滤膜过滤，弃去约0.5 mL初滤液，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，仪器为LC-10A2010C HT型液相色谱仪。
所述HPLC检测方法为：LC-10A2010C HT型液相色谱系统，Sepax GP-C18柱（150 mm×4.60 mm，5.0 μm）为色谱柱，甲醇:水（7:3 v/v）为流动相，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，用紫外检测器在242 nm处检测。
己烯雌酚降解率的计算公式为：

式中：C₀为空白对照中己烯雌酚浓度（mg/L）；C为培养液中己烯雌酚残留浓度（mg/L）。
所述培养基为：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：新鲜土豆去皮切块，称取200 g，加入500 mL蒸馏水煮沸20 min，过滤，加葡萄糖 20 g，琼脂20 g，再加蒸馏水至1000 mL，121 °C灭菌15 min；基础盐培养基（MM）：硫酸铵1.5 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121 °C灭菌15 min。
以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。