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本发明提供了一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用，该组合物能够提高卵母细胞的体外成熟率，并提高卵子的分裂率、胚胎发育到桑椹和囊胚的比率，进而大幅促进体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，该组合物能够有效抑制皮肤成体干细胞向成纤维细胞分化，或维持皮肤成体干细胞的自我更新与再生。该组合物包括半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632。

1.  一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物，其包括半胱胺。

2.  根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括白血病抑制因子。

3.  根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632。

4.  根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述组合物中半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632配比为（1mmol-100mmol）：（10IU-10³ IU）：（0.1m mol -10mmol）。

5.  一种用于卵母细胞、IVF受精卵、IVF胚胎、皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养液或培养基，其特征在于：包含权利要求1至4中任一所述的组合物。

6.  根据权利要求5所述的培养液或培养基，其用于皮肤组织或皮肤成体干细胞的培养，其特征在于：所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为5mM -500 mM，白血病抑制因子浓度为50 IU/mL -5×10³ IU/mL，Rho激酶抑制剂Y27632浓度为0.5mM -50 mM。

7.  根据权利要求5所述的培养液或培养基，其用于卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养，其特征在于：所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10mM -200mM，白血病抑制因子浓度为10² IU/mL -2×10³ IU/mL；
所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10mM -200mM，白血病抑制因子浓度为10² IU/mL -2×10³ IU/mL，Rho激酶抑制剂Y27632浓度为1mM-20 mM。

8.  如权利要求1至4中任一所述的组合物在卵母细胞体外成熟培养、IVF受精卵或IVF胚胎体外培养中的应用。

9.  根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述卵细胞、IVF受精卵或IVF胚胎选自人或下述任一一种动物：山羊、绵羊、奶牛、猪，家兔、小鼠、大鼠或豚鼠。

10.  如权利要求1至4中任一所述的组合物在皮肤成体干细胞、皮肤组织培养中的应用。

11.  如权利要求1至4中任一所述的组合物在制备治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药物或试剂中的应用。

12.  一种化妆品或者化妆品辅助添加剂，其特征在于：包含权利要求1至4中任一所述的组合物。

13.  如权利要求1至4中任一所述的组合物在制备化妆品或化妆品辅助添加剂中的应用。

14.  根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜，所述面膜包括用于涂抹于面部的涂抹物，所述组合物应用于所述涂抹物的制备。

15.  根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜，所述面膜包括由蚕丝或棉制成的贴敷物，以及用于浸润所述贴敷物的基液，所述组合物应用于所述基液的制备。

16.  根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述化妆品为爽肤水、面霜或洗面乳。

一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用
技术领域
本发明涉及一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用。
背景技术
卵母细胞（oocyte）在母体的卵巢上产生。卵巢上滤泡（follicle）包括卵母细胞与滤泡细胞（follicular cells）。在滤泡的生长过程中，初级卵母细胞（primary oocyte）停止在减数分裂第一次成熟分裂的前期，当青春期开始，在滤泡刺激素（FSH）的作用下，祖细胞初级卵母细胞体积增大，并在卵母细胞的外周形成透明带，滤泡细胞生长成多层细胞，包围卵母细胞，并在滤泡中形成滤泡腔，故称次级滤泡（secondary follicle）。在成熟滤泡中，初级卵母细胞在激素LH和其他因子的作用下，完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞，或成熟的卵母细胞，并排放第一极体，极体位于卵母细胞与透明带之间的卵周隙中。这是滤泡壁破裂，卵母细胞从成熟的滤泡中排出，加入输卵管。如果输卵管中存在能活的精子，就会发生受精，产生受精卵（fertilized egg），或称胚胎 （embryo）。胚胎经过分裂与发育变成囊胚，并迁移到母体的子宫着床，形成胎儿（fetus）。
初级卵母细胞属于卵母细胞的祖细胞，它会在一定因子的作用下，定向的分化成成熟的卵母细胞，并具有受精的能力。生育期的妇女，每隔28天左右排放一个卵子，偶尔排放两个或多个卵子。奶牛与人类一样，是单胎动物，每次一般排放一个卵子。其他的动物属于多胎动物，如绵羊，山羊每次会排放3~5个卵子，家猪，家兔，小鼠，大鼠会排放8~10个，或更多的卵子。不管是单胎或者多胎动物，在每个排卵周期中，有一批（20~100个）的卵母祖细胞启动定向分化为成熟卵母细胞的过程。同时原始滤泡向初级滤泡，以及次级滤泡的生长与发育。在此过程中，单胎动物的卵巢上大量卵母细胞都会出现细胞的凋亡（programmed death）,导致闭锁的滤泡（atresic follicles），只有一个卵母细胞排卵，其他的卵母细胞都会凋亡而退化，无法排卵或排卵但无法受精。多胎动物的卵巢上，同样出现卵母细胞的凋亡与退化。这样会造成大量卵母细胞的损失，也是造成人类不孕不育的原因之一。
体外受精技术（in vitro fertilization，IVF）是繁殖生物学中最有成就的技术，其中卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation， IVM）技术，就是将卵母祖细胞能够最大限度地降低其细胞凋亡的过程，并向成熟卵母细胞的方向分化，保证卵子的正常受精，发育成胚胎，从而增加可受孕的胚胎质量与数量。
虽然体外受精技术得到了广泛地应用，但胚胎成熟比例仍然很低，主要受以下几个方面的影响：
1）       卵母细胞的体外成熟率低，即细胞核的成熟与细胞质的成熟程度较低。
2）       受精卵向胚胎发育的过程中：
卵子的分裂率低；
胚胎发育到桑椹和囊胚的比率低。
为此，我们提供了一种组合物，该组合物能够促进卵母细胞的体外成熟培养，促进体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，我们通过动物皮肤组织与细胞培养的实验，发现该组合物能够促进皮肤成体干细胞再生与增殖。
皮肤有极强的修复和再生能力，这与皮肤成体干细胞 (skin adult stem cells) 的存在具有直接的关系。目前，皮肤成体干细胞的临床应用主要表现在几个方面:
（1）在细胞治疗中的应用。当皮肤受到外伤、疾病等的损伤时，位于皮肤表皮基底层和毛囊隆突的皮肤成体干细胞就会在内外源因素的调控下，及时增殖分化生成相关细胞，以修复机体受损表皮、毛囊等结构。
（2）在组织工程中的应用。人工真皮是利用组织工程技术形成商品化用于临床的真皮替代物，它可诱发正常的皮肤愈合过程，已用于治疗大面积烧伤病人的暂时性皮肤覆盖及慢性皮肤溃疡的治疗。
（3）在基因治疗中的应用。干细胞因具有高度自我更新和多向分化潜能，因此一直为基因治疗首选的靶细胞。将表皮干细胞作为皮肤遗传性疾病等基因治疗的靶细胞已成为可能。将外源基因通过逆转录病毒导入表皮成体干细胞并植入体内后，机体可长期维持转导基因的表达，这就为表皮成体干细胞应用于基因治疗提供了可靠的依据。
上述应用均涉及皮肤成体干细胞的体外扩增、培养，然而皮肤成体干细胞体外培养中易分化为成纤维细胞，使得自体皮肤成体干细胞和由自体皮肤成体干细胞构造的人造皮肤的应用在临床上较难实现，上述组合物的应用能够有效解决这一问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用，该组合物能够提高卵母细胞的体外成熟率，并提高卵子的分裂率、胚胎发育到桑椹和囊胚的比率，进而大幅促进体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，该组合物能够有效抑制皮肤成体干细胞向成纤维细胞分化，或维持皮肤成体干细胞的自我更新与再生。
半胱胺（cysteamine），又称2-巯基乙胺或巯基乙胺。分子式：C2H7NS，分子量：77.14，属于一种渗透性强的小分子，还原剂，具有抗氧化的作用。尤其是当机体皮肤受到紫外光或×线照射时，细胞产生大量的游离羟基（OH），半胱胺与游离羟基作用，从而产生极强的抗氧化作用，达到保护皮肤的机能以及维护机体的生理平衡。
Rho激酶抑制剂Y27632，分子量320.26，是一个Rho相关激酶ROCK的抑制剂。Y27632具有防止细胞凋亡，并提高分离的人类胚胎干细胞存活率和克隆效率的功能，并可提高胚胎干细胞源性神经前体移植的存活率。
白血病抑制因子（Leukemia Inhibitor Factor, LIF）是一种可以通过抑制自身分化来促进胚胎干细胞长期维持的淋巴因子，主要应用于胚胎干细胞的体外培养和研究。LIF可与胚胎干细胞表面的LIFR/gp130受体结合，通过几个重要的信号通路起作用：LIF激活JAK/STAT通路抑制ES细胞分化；LIF激活PI3K通路维持ES细胞的自我更新；LIF激活MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase，分裂原激活蛋白激酶) 级联通路。
本发明提供了一种用于卵母细胞以及皮肤成体干细胞培养的组合物，其包括半胱胺。
进一步地，所述组合物还包括LIF。
进一步地，所述组合物还包括LIF和Y27632。
更进一步地，所述组合物中半胱胺、LIF和Y27632配比为（1mmol-100mmol）：（10IU-10³ IU）：（0.1m mol -10mmol）。
本发明提供了一种用于卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液或培养基，其特征在于：包含上述技术方案中任一所述的组合物。
进一步地，所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10-200 mM，白血病抑制因子浓度为10²-2×10³ IU/mL；
所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10-200 mM，白血病抑制因子浓度为10²-2×10³ IU/mL，Rho激酶抑制剂Y27632浓度为1-20 mM。
本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在卵母细胞体外成熟培养、IVF受精卵或IVF胚胎体外培养中的应用。
进一步地，所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10-200 mM，白血病抑制因子浓度为10²-2×10³ IU/mL；
所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为10-200 mM，白血病抑制因子浓度为10²-2×10³ IU/mL，Rho激酶抑制剂Y27632浓度为1-20 mM。
进一步地，所述卵细胞、IVF受精卵或IVF胚胎选自人或下述任何一种动物：山羊、绵羊、奶牛、猪，家兔、小鼠、大鼠或豚鼠。
本发明提供了一种用于皮肤成体干细胞培养的培养液，包含上述技术方案中任一所述的组合物。
进一步地，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为5-500 mM，LIF浓度为50-5×10³ IU/mL，Y27632浓度为0.5-50 mM。
本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在皮肤成体干细胞、皮肤组织培养中的应用。
进一步地，培养液或培养基中半胱胺浓度为5-500 mM，LIF浓度为50-5×10³ IU/mL，Y27632浓度为0.5-50 mM。
本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在制备治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药物或试剂中的应用。
进一步地，所述药物或试剂中半胱胺浓度为5-500 mM，LIF浓度为50-5×10³ IU/mL，Y27632浓度为0.5-50 mM。
更进一步地，所述药物或试剂中半胱胺浓度为10-200 mM，LIF浓度为10²-2×10³ IU/mL，Y27632浓度为1-20 mM。
所述创伤性皮肤缺损包括由烧伤、刀伤、枪伤或其他原因等造成的皮肤缺损；所述皮肤溃疡包括病理性溃疡和生理性溃疡。
本发明提供了一种化妆品或者化妆品辅助添加剂，包含上述技术方案中任一所述的组合物。
进一步地，化妆品或者化妆品辅助添加剂中半胱胺浓度为50-500 mM，LIF浓度为50-5×10³ IU/mL，Y27632浓度为0.5-50 mM。
进一步地，所述化妆品为面膜，所述面膜包括用于涂抹于面部的涂抹物，所述组合物应用于所述涂抹物的制备。
进一步地，所述化妆品为面膜，所述面膜包括由蚕丝或棉制成的贴敷物，以及用于浸润所述贴敷物的基液，所述组合物应用于所述基液的制备。
进一步地，所述化妆品为爽肤水、面霜或洗面乳。
本发明提供的组合物对初级卵母细胞祖细胞进行了体外成熟的处理，高效地诱导了处于GV期的祖细胞定向地完成减数分裂的过程，促使减数分裂中期II，即成熟的次级卵母细胞比例的显著增加。山羊为多胎动物，其初级卵母细胞是目前最难进行体外成熟的一群祖细胞，其体外成熟的效率极低，由此导致体外受精胚胎的发育比例极低，经试验证明，我们采用半胱胺和LIF两个因子的组合处理，获得了49.4%的卵子体外成熟率，相较于对照组的卵母细胞成熟率31.2%提升了58%；采用三个因子的组合处理，获得了高达63.2%的卵子体外成熟率，相较于对照组的卵母细胞成熟率提升了102.6%。山羊的IVF受精卵向胚胎发育的过程中，采用单一的半胱胺处理，极体的排放率为71.3%，卵子分裂率为44.6%，相对于对照组分别提升了28.7%，52.7%；采用半胱胺和LIF两个因子的组合处理，极体的排放率为82.5%，卵子的分裂率为53.3%，胚胎发育到桑椹和囊胚的比率为8.1%，相对于对照组分别提升了48.9%，82.5%，58.8%；采用三个因子组合处理，极体的排放率为84.9%，卵子的分裂率为69.8%，胚胎发育到桑椹和囊胚的比率为14.5%，相对于对照组分别提升了53.2%，139.0%，184.3%。奶牛为单胎动物，经试验证明，在其IVM和IVF的实验中，半胱胺+LIF和半胱胺+LIF+ Y27632同样协同性的促进体外成熟的卵母细胞经过IVF后发育成囊胚比例大幅增加，从9.6% 显著的提高到36.0~39.1%。这些实验结果表明本发明提供的组合物能够提高卵母细胞的体外成熟率，并提高受精卵向胚胎发育过程中卵子的分裂率、胚胎发育到桑椹和囊胚的比率，进而大幅提升胚胎发育的比例。同时，经试验证明，三个因子改变皮肤细胞在体外培养条件下的生长模式，能够有效抑制皮肤成体干细胞向成纤维细胞分化，保证皮肤成体干细胞的自我更新与生长；在体内的条件下，可促进皮肤干细胞的增殖与再生，而皮肤成体干细胞的再生保证了其向皮肤基底膜细胞与其他皮肤部位细胞类型的分化。这种成体干细胞再生的特性可以促进自体皮肤成体干细胞和由自体皮肤成体干细胞所构造的人造皮肤在临床方面的应用。这对烧伤、创伤性皮肤的缺损，以及皮肤溃疡的病人的康复具有重要的意义。此外，经试验证明，添加本发明上述组合物的化妆品能够起到延迟皮肤衰老、消除皱纹以及恢复皮肤的光亮与紧致的作用。
附图说明
图1A为在含有半胱胺、小分子Y27632和LIF培养液中生长的山羊卵母细胞的显微图像。
图1B为图1A中山羊卵母细胞经透明质酸酶处理后变为光亮卵子的显微图像，在透明带与卵子的卵周隙之间排放第一极体。
图1C为图1B中卵子经体外受精，卵子出现雌雄两个原核的显微图像。
图1D为图1C中卵子在体外培养下分裂成8细胞的显微图像。
图1E为图1D中分裂细胞经过7.5天培养发育成囊胚的显微图像。
图1F为图1E中囊胚在荧光染色的条件下，显为305正常的细胞核的显微图像。
图1A、图1B、图1D、图1E和图1F Bar=150mm；图1C Bar=70mm。
图2A为在含有半胱胺、小分子Y27632和LIF培养液中生长的牛卵母细胞的显微图像。
图2B为图2A中牛卵母细胞培养22-24小时出现卵丘细胞的膨大的显微图像。
图2C为图2B中牛卵母细胞经过体外受精，卵子在体外培养条件下44小时，分裂成8细胞的显微图像。
图2D为图2C中卵子在体外培养第七天发育成大量的囊胚的显微图像。
图2A、2B、2C和2D Bar=160mm。
图3为山羊卵母细胞在不同浓度的三个细胞因子作用下，见极体或成熟的次级卵母细胞的比率分布图。
图4为奶牛卵母细胞在不同浓度的三个细胞因子作用下，经IVF后，胚胎的囊胚发育比率分布图。
图5为在添加半胱胺、小分子Y27632和LIF的培养液中生长的兔皮肤组织的显微图像。
图6为在添加半胱胺，小分子Y27632和LIF培养液中皮肤细胞的生长曲线图。
图7A为在未添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的对照组中皮肤成体干细胞的免疫荧光检测图。
图7B为在添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的处理组中皮肤成体干细胞的免疫荧光检测图。
图8A为添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的处理组中胚胎干细胞特定标记物Nanog的免疫荧光检测图。
图8B为添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的处理组中胚胎干细胞特定标记物Oct-4的免疫荧光检测图。
图8C为添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的处理组中胚胎干细胞特定标记物Klf-4的免疫荧光检测图。
图8D为添加半胱胺，小分子Y27632和LIF的处理组中胚胎干细胞特定标记物So×2的免疫荧光检测图。
图9A为兔面膜贴敷实验中含有半胱胺，小分子Y27632和LIF的PBS处理组的皮肤组织切片图。
图9B为兔面膜贴敷实验中未含有半胱胺，小分子Y27632和LIF的PBS对照组的皮肤组织切片图。
图10A为兔面膜贴敷实验中未含有半胱胺，小分子Y27632和LIF的PBS对照组的皮肤组织切片中皮肤成体干细胞特定标记物的免疫荧光检测结果图。
图10B为兔面膜贴敷实验中含有半胱胺，小分子Y27632和LIF的PBS处理组的皮肤组织切片中皮肤成体干细胞特定标记物的免疫荧光检测结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN01，其由半胱胺和LIF构成，半胱胺与LIF的配比为100mmol：10³ IU。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN011，其由半胱胺和LIF构成，半胱胺与LIF的配比为1mmol：1000IU。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN012，其由半胱胺和LIF构成，半胱胺与LIF的配比为50.5mmol：505IU。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN014，其由半胱胺和LIF构成，半胱胺与LIF的配比为100mmol：10IU。
实施例2
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN02，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为100mmol： 10³ IU：10mmol。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN021，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为1mmol： 10IU：10mmol。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN022，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为50.5mmol： 100 IU：0.1mmol。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN023，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为100mmol： 505IU：5mmol。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN024，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为1mmol： 1000IU：10mmol。
本实施例提供了一种用于卵母细胞以及皮肤干细胞培养的组合物，标号为LN025，其由半胱胺、LIF和Y27632构成，半胱胺、LIF和Y27632配比为100mmol： 10IU：0.1mmol。
实施例3
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG01，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为50mM，LIF浓度为500 IU/mL， Y27632浓度为5mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG02，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为100mM，LIF浓度为10³ IU/mL， Y27632浓度为10mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG03，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为200mM，LIF浓度为2×10³IU/mL， Y27632浓度为20mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG04，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为50mM，LIF浓度为1250IU/mL， Y27632浓度为20mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG05，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为125mM，LIF浓度为5×10²IU/mL， Y27632浓度为5mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG06，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，培养液中半胱胺浓度为200mM，LIF浓度为2×10³IU/mL， Y27632浓度为12.5mM。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG07，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，培养液中半胱胺浓度为100mM，LIF浓度为10³ IU/mL。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG08，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，培养液中半胱胺浓度为50mM，LIF浓度为1250IU/mL。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG09，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，培养液中半胱胺浓度为125mM，LIF浓度为500IU/mL。
本实施例提供了用于山羊卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSG10，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，培养液中半胱胺浓度为200mM，LIF浓度为2000IU/mL。
同时，该培养液也可以制成培养基。
实施例4
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC01，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为10 mM，LIF浓度为100IU/mL， Y27632浓度为1 mM。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC02，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为2×10³IU/mL， Y27632浓度为10.5 mM。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC03，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为105mM，LIF浓度为1050IU/mL， Y27632浓度为1 mM。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC04，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为200 mM，LIF浓度为100IU/mL，Y27632浓度为20mM。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC05，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，其中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为2000IU/mL。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC06，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，其中半胱胺浓度为105mM，LIF浓度为1050IU/mL。
本实施例提供用于奶牛卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液，标号为LNCSC07，添加有由半胱胺和白血病抑制因子构成组合物，其中半胱胺浓度为200mM，LIF浓度为100IU/mL。
同时，该培养液也可以制成培养基。
实施例5
本实施例提供了用于皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养液，标号为LNCSS01，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为50 IU/mL， Y27632浓度为0.5 mM。
本实施例提供了用于皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养液，标号为LNCSS02，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了用于皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养液，标号为LNCSS03，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了用于皮肤组织或皮肤成体干细胞培养的培养液，标号为LNCSS04，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
同时，该培养液也可以制成培养基。
实施例6
本实施例提供了治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药物，标号为LNM01，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药物，标号为LNM02，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了治疗创伤性皮肤缺损、皮肤溃疡的药物，标号为LNM03，添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
药物LNM01、LNM02、LNM03均能有效治疗因烧伤、刀伤造成的皮肤组织受损，同时，上述药物还能有效治疗溃疡部位。组合物LN02中的半胱胺、LIF和Y27632能够协同促进皮肤干细胞增殖，并在内外源因素的调控下，分化为相关细胞，以修复机体受损部位。
同时，该包含三个因子组合物的药物为皮肤给药剂型，包括：溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等。
实施例7
本实施例提供了一种面膜，标号为LNM01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了一种面膜，标号为LNM02，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了一种面膜，标号为LNM03，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
本实施例提供了一种面膜，标号为LNM04，其基液中添加有组合物LN02，面膜基液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为10³U/mL， Y27632浓度为10mM。
实施例8
本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN02，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN03，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
本实施例提供了一种爽肤水，标号为LNN04，其基液中添加有组合物LN02，面膜基液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为10³U/mL， Y27632浓度为10mM。
实施例9
本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC02，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC03，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
本实施例提供了一种面霜，标号为LNFC03，其基液中添加有组合物LN02，面膜基液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为10³U/mL， Y27632浓度为10mM。
实施例10
本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF01，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为5mM，LIF浓度为2525IU/mL， Y27632浓度为50mM。
本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF02，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为250mM，LIF浓度为50IU/mL， Y27632浓度为0.5mM。
本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF03，其基液中添加有由半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂构成组合物，其中半胱胺浓度为500mM，LIF浓度为5×10³IU/mL， Y27632浓度为25mM。
本实施例提供了一种洗面乳，标号为LNCF04，其基液中添加有组合物LN02，面膜基液中半胱胺浓度为10mM，LIF浓度为10³U/mL， Y27632浓度为10mM。
实施例11
（1）山羊卵母细胞体外成熟（IVM）培养
山羊的卵巢取自屠宰场。在实验室中，卵巢的滤泡用刀片划破后，用磷酸缓冲液（D-PBS）漂洗卵巢的表面，山羊卵母细胞从培养液中收集，并在D-PBS中漂洗3次，放入卵母细胞成熟液中。卵母细胞成熟液的组成是M199（Invitrogen）含有L~谷氨酰氨，2.2 g/L 碳酸氢钠，25 mM HEPES（sigma，USA），并添加10% （V/V）胎奶牛血清（Fisher，USA）， 0.5 mg/mL 羊FSH （Siou×， USA），5.0 mg/mL 羊LH（Siou×， USA），1.0 mg/mL 17-b 雌二醇（sigma，USA）。20~25个山羊卵母细胞移至在75 mL成熟液滴中，放置于38.5度，5% CO₂培养箱中，培养22-24小时，如图1A所示；山羊卵母细胞在三个细胞因子的作用下，恢复减数分裂到MII期，山羊卵母细胞外周的卵丘细胞用透明质酸酶处理3分钟后去除，变成光亮的卵子，在透明带与卵子的卵周隙之间排放第一极体，如图1B中箭头所示；经过体外受精，卵子出现雌雄两个原核，如图1C中箭头所示；受精卵在体外培养下，分裂成8细胞，如图1D所示；和经过7.5天的培养发育成囊胚，如图1E所示；在荧光染色的条件下，山羊的囊胚显示305正常的细胞核，如图1F所示。
我们进行了3 × 3的排列组合实验，在卵母细胞成熟培养液添加单一因子、两个因子和三因子组合的成分，检查经过IVM后山羊卵母细胞进入MII成熟卵母细胞的比例，其结果如表1所示。在单因子与组合因子的添加中，半胱胺的浓度为100 mM (Sigma，USA)，LIF 浓度为10³IU/mL (InVitrogen，USA)，Y27632的浓度为10 mM (Renova Life Inc.，USA)，这三个因子在单因子处理组、双因子处理组或三因子的处理组中添加浓度保持不变。
表1. 半胱胺，LIF, 小分子Y27632协同促进山羊卵母细胞的体外成熟

备注：LIF，白血病抑制因子；Y27632，Rho激酶抑制剂Y27632。在竖栏中a，b，c数值显示山羊卵母细胞成熟率存在显著差异（P<0.05），含相同字母表示差异不明显。
如表1所示，单一因子半胱胺，LIF，Y27632添加到培养液中并没有增加山羊卵母细胞的成熟率，成熟比率32.8-39.3%与对照组（31.2%）没有显著差异（P>0.05）。半胱胺+Y27632的组合也未提高成熟率（20%）。但是，LIF和Y27632（43.4%），半胱胺和LIF（49.4%）的组合能够显著促进山羊卵母细胞的成熟（P<0.05）。最重要的是，半胱胺、LIF和Y27632的三因子组合获得了最高的成熟比率（63.2%），超过任何一种组合（P<0.05）。
我们进一步检查在不同组合浓度下，三个因子对山羊卵母细胞体外成熟的影响。根据上述的实验，使用的浓度为半胱胺100 mM，LIF 10³IU/mL，Y27632 10 mM。我们进行下列处理（A）未添加；（B）1/2浓度，即半胱胺50 mM，LIF 0.5 × 10³IU/mL，Y27632 5 mM；（C）使用浓度，即半胱胺100 mM，LIF 10³IU/mL，Y27632 10 mM；（D）200% 浓度，即半胱胺200 mM，LIF 2×10³IU/mL，Y27632 20 mM。实验结果如图3所示，处理组A-D中见极体或成熟的次级卵母细胞的比率分别为31.5%， 63.1%， 65.3% 、67.5%，可知山羊卵母细胞在添加三个因子后，其成熟的比率显著增加（B-D，63.1-67.5% vs. A. 31.5%, P<0.05），当三个因子添加到成熟液中后，卵母细胞成熟的比率从使用浓度的50%（B, 63.1%）到150% 的浓度（D， 67.5%），与正常的使用浓度（C，65.3%）的相比没有差异（P>0.05）。
（2）山羊卵子体外受精（IVF）与胚胎发育
山羊卵母细胞经过22-24小时的体外成熟处理以后，将20-25个山羊卵母细胞放置在50 mL TALP（Renova Life Inc.， USA）的体外受精培养液中。新鲜获取的山羊精液在10 mL的精子清洗液中经过400g的情况下，离心10分钟，去除上清液，然后再在10 mL的精子清洗液中混合均匀，再离心10分钟，去除上清液。加入2 mL洗液，混匀，计数并稀释到 2×10⁶个/mL的精子浓度，将50 mL TALP精子受精液加入到含有卵子的液滴中，精子的最终浓度为1×10⁶/mL。将IVF受精培养皿放入CO₂培养箱中，在38.5度，5% CO₂的条件下，孵育18小时。受精后的卵子去除颗粒细胞，经过5-6次的漂洗后，放入50 mL的SOF（Renova Life Inc.，USA）胚胎培养液滴中，在5% CO₂，90% N₂中，在38.5度的条件下，培养7.5天。在体外培养后的44-48小时检查受精卵分裂到2-8细胞的比率，在7.5天的时候，检查胚胎发育到桑椹和囊胚的情况。
我们进行了的排列组合实验，检查经过上述IVF后的山羊卵母细胞向胚胎发育过程中的极体排放的比率、受精卵分裂到2-8细胞的比率以及胚胎发育到桑椹和囊胚的比率，其结果如表2所示。在卵母细胞成熟液中添加半胱胺的浓度为100 mM，LIF 浓度为10³IU/mL，Y27632的浓度为10 mM，这三个因子在单因子处理组、双因子处理组或三因子的处理组中添加浓度保持不变。
表2. 半胱胺，LIF，小分子Y27632协同促进山羊IVF胚胎的发育

备注：LIF，白血病抑制因子；Y27632，Rho激酶抑制剂Y27632。在竖栏中a，b，c数值显示山羊卵母细胞成熟率存在显著差异（P<0.05），含相同字母表示差异不明显。
如表2所示，添加单一LIF，单一Y27632的试验组，其极体的排放比率与对照组的没有差异，46.8-55.4% （P>0.05）。但在添加单一半胱胺的试验组中，显示极体的比率显著地增加到71.3%（P<0.05）。添加两个因子半胱胺和LIF，三个因子半胱胺、LIF和Y27632的试验组，极体排放的比率为82.5-84.9%，显著的高于其他的处理组与对照组（P<0.05）。受精卵分裂比率与极体的排放呈现相似的趋势，添加半胱胺或者添加半胱胺和LIF的实验组较其他添加单一因子的处理组和对照组显著地产生较高的分裂率（44.6-53.3% vs. 25.1-29.2%，P<0.05）；而添加三个因子半胱胺、LIF和Y27632的实验组获得了高达69.8%的分裂率，超过任何的实验组（P<0.05）。最重要的是，胚胎发育到桑椹和囊胚的比率在添加这些细胞因子的情况下，呈现出很好的协调效应。添加两个因子半胱胺和LIF的实验组、添加三个因子半胱胺、LIF和Y27632的实验组中，胚胎发育到桑椹和囊胚的比率显著性的高于添加单一因子的实验组与对照组 （8.1-14.5% vs. 1.8-5.2%，P<0.05）。
实施例12
本发明的组合物对牛体外受精与胚胎发育的影响
根据山羊的试验，我们对奶牛卵巢采取了同样的IVM和IVF的处理，奶牛卵巢取自屠宰场。由于单一因子的添加没有促进山羊IVF后的胚胎分裂与发育的比率，在奶牛卵母细胞IVM时，我们添加了两个因子半胱胺和LIF，三个因子半胱胺、LIF和Y27632的实验，然后进行了IVF。
我们进行了的组合实验，检查经过上述IVF后的奶牛卵母细胞向胚胎发育过程中的极体排放的比率、受精卵分裂到2-8细胞的比率以及胚胎发育到囊胚的比率，其结果如表3所示。在卵母细胞成熟液中添加半胱胺的浓度为100 mM，LIF 浓度为10³IU/mL，Y27632的浓度为10 mM，，这三个因子在双因子处理组、三因子的处理组中添加浓度保持不变。
奶牛卵母细胞经过三个因子半胱胺、LIF和Y27632 IVM以及IVF后向胚胎发育的过程如图2所示：奶牛卵母细胞，如图2A所示；在含有三个细胞因子的体外成熟培养液中，培养22-24小时出现卵丘细胞的膨大，如图2B所示；经过体外受精，卵子在体外培养条件下44小时，分裂成8细胞，如图2C所示；并在第七天发育成大量的囊胚，如图2D所示。
表3. 半胱胺，LIF，小分子Y27632促进奶牛IVF胚胎的体外发育

备注：LIF，白血病抑制因子；Y27632，Rho激酶抑制剂Y27632。在竖栏中a、b、c数值显示山羊卵母细胞成熟率存在显著差异（P<0.05），含相同字母表示差异不明显。
如表3所示，经过细胞因子的处理后，受精卵的分裂和发育也产生协同的促进作用。添加半胱胺和LIF的实验组中，受精卵分裂成2-8细胞的比率较对照组的39.7%显著地增加到53.3%（P<0.05），在添加三个因子半胱胺、LIF和Y27632的实验组中，卵子的分裂比率最高为69.8%（P<0.05）。同样的，在添加两个和三个细胞因子的实验组中，7天后囊胚的发育比率（36.0-37.1%）也高于对照组（9.6%）（P<0.05）。
我们进一步检查在不同组合浓度下，三个因子对奶牛卵母细胞体外成熟与IVF后胚胎发育的影响。根据上述的实验，正常使用浓度为半胱胺100 mM，LIF 10³IU/mL，Y27632 10 mM。我们进行下列处理（A）未添加；（B）1/10浓度，即半胱胺10 mM，LIF 10²IU/mL，Y27632 1 mM；（C）使用浓度，即半胱胺100 mM，LIF 10³IU/mL，Y27632 10 mM；（D）200%的使用浓度，即半胱胺200 mM，LIF 2 × 10³IU/mL，Y27632 20 mM。实验结果如图4所示，奶牛卵母细胞在添加三个因子后，经过IVF后，胚胎的囊胚发育比率分别为23.1%， 46.2%，43.1%，和42.1%，胚胎发育到囊胚比率显著增加（B-D，42.1-46.2% vs. A. 23.1%， P<0.05）。当三个因子添加到成熟液中后，卵母细胞成熟的比率从使用浓度的1/10（B，46.2 %）到200% 的浓度（D，42.1 %），与正常的使用浓度（C，43.1%）的相比没有差异（P>0.05）。
上述实施例的实验结果充分证明了，三个因子，即半胱胺，LIF和Y27632在山羊和奶牛的体外成熟，体外受精与培养过程中，对卵母细胞的成熟，受精与胚胎的发育有着明显的协调与促进作用。其主要的原因是这些细胞因子能够增进初级卵母细胞，即卵子祖细胞，向次级卵母细胞的定向成熟与分化。这种定向的卵母细胞成熟，进一步增加了体外受精的效率，从而提高IVF胚胎发育致桑椹和囊胚的效率。这三种因子的效应在卵母细胞成熟过程中起到了关键的协调作用：在高氧条件下，如正常的空气中20% O₂会在培养液中产生自由基，由此对卵母细胞本身的产生伤害作用，半胱胺在卵母细胞成熟过程中，降低了环境中O₂对卵子的氧化作用与进一步的伤害；Y27632则在信号通路中抑制Rho相关激酶，尤其是抑制了与细胞凋亡有关的信号通路的作用，降低了卵母细胞凋亡的过程，从而有效地促进初级卵母细胞向次级卵母细胞的成熟；而LIF激活MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase，分裂原激活蛋白激酶) 级联通路，增加了卵子减数分裂过程中所需的分子/蛋白质的表达水平以及有关的级联反应。 这三个细胞因子的协调机制，从根本上增进了卵母细胞的定向成熟，导致卵母细胞受精后，提高了胚胎的分裂与发育成囊胚的比率。
实施例13
皮肤组织以及皮肤细胞的培养
直径为约0.5 cm的家兔皮肤组织，在抗生素的D-PBS中漂洗3次，然后切碎成0.05的小组织块放置在含10% FBS DMEM培养液的培养皿中，并加盖玻片，固定组织块，保证细胞的培养效果。组织与细胞在37度，5% CO₂培养箱中培养与生长。
(1) 原代细胞培养：细胞从皮肤组织中爬匍生长
培养液为添加100 mM半胱胺，10³/mL LIF，10 mM Y27632和10% FBS 的DMEM。经过10天的培养后，原代细胞如图5中箭头所示，从组织块上爬匍出来，贴壁生长在组织块的周缘。原代细胞在密集生长以后，经过胰蛋白酶的消化，进行传代至2-3代，然后再冷冻在10% DMSO的冷冻液中。
(2)皮肤细胞的传代培养与细胞生长曲线
将冷冻家兔B439皮肤组织原代培养细胞复苏，并稀释成1×10⁵/ml，接种细胞在24孔板中，细胞总数为1×10⁴/孔。培养液分成两组处理，（1）10% FBS DMEM培养液中添加100 mM半胱胺 (Sigma， USA)，10³ IU/mL LIF (InVitrogen，USA)，10 mM Y27632 (Renova Life Inc. USA)；（2）10% FBS DMEM基础培养液作为对照组。细胞在相应培养液在5% CO₂，37℃培养箱中培养。细胞每天（24h）计数一次，未计数细胞每两天换一次相应的新鲜培养液。细胞统计数据以培养时间横轴、细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。实验结果如图6所示，在培养液中添加了三个因子后，细胞的生长速度比未添加的对照组相比，呈现缓慢的趋势，24h，48h，72h的细胞总数为1.1×10⁴，2.8×10⁴，3.5×10⁴显著低于对照组（P<0.05）；相比之下，对照组细胞在培养72h后达到生长的饱和状态，而添加三个因子的实验组，细胞生长在96h后才达到生长的饱和。
(3)三种因子作用下皮肤成体干细胞的生长与分布
家兔原代细胞以1×10⁴/mL的浓度接种到24孔细胞培养板中，培养在（1）10% FBS DMEM培养液中添加100 mM半胱胺，10³ IU/mL LIF，10 mM Y27632；（2）10% FBS DMEM基础培养液作为对照组。两天换一次新的培养液，细胞汇合度达80%左右时进行免疫荧光染色。免疫荧光的抗体为，一抗小鼠抗人Integrinβ I单克隆抗（ITGB1），二抗FITC标记山羊抗鼠IgG。
两种处理的细胞汇合度达到80%左右，用4%多聚甲醛室温孵育10min固定细胞，弃多聚甲醛并用DPBS洗细胞3min×3次，每个培养孔加0.2%Triton×-100 200ul室温孵育5min裂解细胞，DPBS洗涤细胞3次。每个培养孔中加200ul DPBS+10% FBS 4℃过夜孵育封闭非特异性抗原，第二天用小鼠抗人Integrinβ I单克隆抗体（1：350稀释）4℃孵育过夜，用DPBS洗涤细胞3min×3次。FITC标记山羊抗鼠IgG二抗（1：350稀释）室温避光孵育两小时。每孔加入浓度为0.1 mg/ml DAPI (DPBS稀释) 200 mL对细胞核进行染色10min。在倒置显微镜观察细胞荧光并拍照。结果显示，家兔原代细胞在添加三种细胞因子的培养液中，含有皮肤成体干细胞特有的标记物Integrinβ I的细胞约占细胞总数的8%，如图7B所示，而未添加三个因子的对照组，所有的细胞都向成纤维细胞分化，未见成体干细胞标记物的染色，如图7A所示。我们进一步用胚胎干细胞特定的细胞标记物，Nanog，Oct-4，Klf-4和SoX2对添加三个因子培养处理的细胞染色，未见任何的染色，如图8所示。实验证明，这些处理的细胞没有向胚胎干细胞的特性转化，而是保持了皮肤成体干细胞的特性（如图7，图8所示）。
(4)三种因子作用下皮肤成体干细胞的分布模式
家兔原代细胞以1×10⁴/mL的浓度接种到24孔细胞培养板中，原始的细胞接种数为10⁴/孔。实验设计按照表4所示，将细胞接种在含有单一因子，两个因子的组合，与三个因子组合的培养液中。在10% FBS DMEM基础培养液中，添加的细胞因子浓度为100 mM半胱胺，10³ IU/mL LIF，10 mM Y27632。细胞在10% FBS DMEM基础培养液作为对照组。细胞在相应培养液在5% CO₂，37℃培养箱中培养72h，然后进行细胞计数与Integrinβ I皮肤成体干细胞标记物的染色，并统计成体干细胞在培养细胞总数中的比例。
表4. 半胱胺，LIF，小分子Y27632对原代皮肤细胞生长与成体干细胞分布的影响

如表4所示，在添加单一细胞因子（半胱胺，LIF和Y27632）的培养液中，与对照组相比（4.0×10⁴/孔），培养72h后的细胞生长趋于饱和状态（3.95-4.1×10⁴/孔）。在添加两个因子的培养液中（半胱胺+Y27632和半胱胺+LIF）细胞数与对照组的相近（4.1-4.2×10⁴/孔），只有LIF+Y27632组合中细胞总数为3.8×10⁴/孔，低于对照组。添加三个因子的培养液中，72h培养后的细胞总数最低，为3.5 ×10⁴/孔，出现生长缓和的现象，与实验（2）的结果一致（如图6所示）。在单一因子添加的培养液和半胱胺+Y27632和半胱胺+LIF两个因子添加的培养液中，成体干细胞的比例几乎没有增加，只有0-0.02%。LIF+Y27632的组合中，成体干细胞的比例增加到1.0%。只有三个因子同时添加时，即在含有半胱胺+LIF+Y27632的培养液中，皮肤成体干细胞的比例增加到8.9%，结果与实验（3）一致。
在皮肤细胞培养生长与成体干细胞培养的分布模式的实施例中证明了，三个因子，即半胱胺，LIF和Y27632，在家兔皮肤细胞的培养中，对皮肤细胞生长起着缓和的作用，其表现为明显地延缓细胞的生长速度，抑制成体干细胞向成纤维细胞的分化与生长；同时维持了皮肤成体干细胞的形态与特性，保证成体干细胞在培养细胞中比例与分布的模式。三种因子能够维持皮肤成体干细胞形态与特性，并抑制成体干细胞向成纤维细胞的分化。半胱胺在细胞培养中降低了环境中O₂对细胞的氧化作用。Y27632则在信号通路中抑制Rho相关激酶，尤其是抑制了与细胞凋亡有关的信号通路的作用，提高了成体干细胞存活率。LIF对皮肤成体干细胞的作用机制与其对卵母细胞的作用有所不同。LIF主要是激活JAK/STAT通路抑制干细胞的细胞分化；LIF激活PI3K通路维持干细胞细胞的自我更新，其结果是维持了皮肤成体干细胞在细胞培养中的细胞类群与分布的模式。
在上个实验的基础上，我们研究不同浓度组合对细胞生长与成体干细胞分布模式。家兔原代细胞以1×10⁴/mL的浓度接种到24孔细胞培养板中，原始的细胞接种数为10⁴/孔。实验设计按照表5所示，将细胞接种在含有三个因子不同组合浓度的培养液中。细胞在10% FBS DMEM基础培养液作为对照组。在10% FBS DMEM基础培养液中，上述实验得出的细胞因子使用浓度为100 mM半胱胺，10³ IU/mL LIF，10 mM Y27632，我们安排了其他的组合为其使用浓度的1/20，1/10，1/4，1/2，2倍和5倍。细胞在相应培养液在5% CO₂，37℃培养箱中培养72h，然后进行细胞计数与Integrinβ I皮肤成体干细胞标记物的染色，并统计成体干细胞在培养细胞总数中的比例。
表5. 不同浓度组合的半胱胺、LIF和小分子Y27632对原代皮肤细胞生长与成体干细胞分布的影响

*1表示三个因子的组合浓度是100 mM半胱胺，10³ IU/mL LIF，10 mM Y27632，其他的浓度组合在此基础上进行稀释或加倍。
如表5所示，在添加三个细胞因子（半胱胺，LIF和Y27632）的培养液中培养72h后，细胞生长速度（3.4-3.61×10⁴/孔）都明显低于对照组（4.2×10⁴/孔）（表5）。在使用浓度，即100 mM半胱胺，10³ IU/mL LIF，10 mM Y27632的基础上，从稀释20倍（1/20，即5 mM半胱胺，50 IU/mL LIF，0.5 mM）到增加到使用浓度的5倍（5，即500 mM半胱胺，5×10³ IU/mL LIF，50 mM Y27632），细胞的总数基本未见明显的改变（3.4-3.61 × 10⁴/孔）。在未添加三个因子的培养液中（对照组），细胞出现明显的分化，全部为成纤维细胞的类型，没有检测到成体干细胞。然而，添加三个因子后，成体干细胞的比例明显的提高到7.8-8.8% （表5）。干细胞的比例在1/20到5倍于使用浓度的范围内则保持在相似的水平（表5）。
实施例14
面膜贴敷实验
 (1)家兔皮肤贴敷与组织学研究
市场销售面膜的基液（广州大澳化妆品有限公司出品）含有水、丁二醇、甜菜碱、甘油、羟乙基脲、泛醇、乳酸杆菌/北美圣草（ERIODICTYON CALIFORNICUM）发酵产物提取物、1,2-己二醇、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物、叶酸、透明质酸钠、卡波姆、精氨酸、黑灵芝（GANODERMA ATRUM）提取物、甘草（GLYCYRRHIZA URALENSIS）根提取物、三七（PANA× NOTOGINSENG）根提取物、石竹（DIANTHUS CHINENSIS）提取物、1,2-戊二醇、羟苯基丙酰胺苯甲酸、水解小核菌（SCLEROTIUM ROLFSSII）胶、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、聚山梨醇酯-20、棕榈酰寡肽、棕榈酰四肽-7、PEG-40 氢化蓖麻油、香精、甲基异噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、羟苯甲酯。在面膜溶液中添加100 mM半胱胺 (Sigma, USA)，10³ IU/mL LIF (InVitrogen, USA)，10 mM Y27632 (Renova Life Inc. USA)。将型号352蚕丝面膜浸泡在基液中60分钟后，剪成3 × 3 cm做成贴敷面膜。处理组家兔的年龄为1.5岁（相当于30-35岁的妇女）。在不同的皮肤位置进行如下的处理，（1）贴敷添加三个细胞因子的面膜，20分钟，（2）贴敷未添加细胞因子的对照组，20分钟。每周贴敷3次，贴敷周期为8周。
经贴敷实验后，取皮肤组织，切割成合适的大小并置PBS充分漂洗残余血液。组织经过冰冻处理后，进行新鲜组织的切片。或者将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜。将组织脱水，即组织块分别经系列浓度的乙醇逐级脱水。经二甲苯透明浸蜡，包埋，切片（5-7um），摊片（40-45℃）和烘片（62℃）。切片经过苏木精-伊红HE染色后，在光学显微镜下观察表皮，真皮和皮下组织的形态结构，以及细胞的分布与数量的变化。
如图9A和9B所示，皮肤组织被覆2层复层鳞状上皮，表面轻度角化，真皮可见皮肤附件。上皮下为致密的纤维结缔组织。3片皮肤组织形态结构相似，表皮细胞无变性、坏死。真皮或皮下组织无充血、水肿及炎细胞浸润，胶原组织无增生或退行性变，染色未增强或减弱。如图9A所示，半胱胺、小分子Y27632和LIF三个因子，在体内的条件下，其原因是增加了皮肤成体干细胞的再生，然后再促进皮肤基底膜细胞的生长，并促使皮肤细胞的再生。添加三因子的PBS处理组（9A）较PBS对照组（9B）显示出表皮基底层细胞的再生，其细胞群体出现2.5倍的增加。
(2) 家兔皮肤贴敷后皮肤组织冰冻切片与皮肤成体干细胞特定标记物的免疫荧光染色
我们进一步检测皮肤成体干细胞经过三个因子处理后的再生。按照上述的贴敷方法，在贴敷8周后取材。新鲜兔皮肤组织进行冰冻切片。免疫染色的抗体为，一抗小鼠抗人IntegrinβI单克隆抗（ITGB1），二抗FITC标记山羊抗鼠IgG。皮肤组织切片先后经3%H ₂O₂室温孵育5-10min去除内源性酶，0.3%Triton ×100室温孵育20min增加细胞膜的通透性。切片于室温湿盒内非特异血清10%胎牛血清封闭1h，孵育一抗鼠抗人ITGB1，4℃过夜或37℃1h（1:200稀释），空白对照（用PBS+10%血清孵育）。用PBS漂洗3次，每次5min。滴加荧光二抗（羊抗鼠IgG-FITC，1:200稀释）室温置湿盒中避光孵育2小时或37℃ 30min，PBS洗涤3min×3次，用滤纸拭去标本外的PBS。滴加10 mg/mL的DNA染色液DAPI 避光孵育2分钟（染色细胞核）。用含10%甘油PBS封片，在荧光显微镜下观察细胞荧光染色的状态。实验结果如图10所示，在贴敷销售面膜8周后，见少量的皮肤成体干细胞的染色，如图10A所示；在相同的面膜基液中添加三个因子（半胱胺，小分子Y27632和LIF）的试验组中，带有IntegrinβI特异性染色皮肤成体干细胞的数量显著增加，如图10B所示，约提高3.5倍。
 (3)人面部贴敷的效果体验
我们将广州大澳化妆品有限公司市场销售的活性肽全能面膜作为对照组进行贴敷的效果对比。该对照组的面膜基液含有水、丁二醇、甜菜碱、甘油、羟乙基脲、泛醇、乳酸杆菌/北美圣草（ERIODICTYON CALIFORNICUM）发酵产物提取物、1,2-己二醇、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物、叶酸、透明质酸钠、卡波姆、精氨酸、黑灵芝（GANODERMA ATRUM）提取物、甘草（GLYCYRRHIZA URALENSIS）根提取物、三七（PANA× NOTOGINSENG）根提取物、石竹（DIANTHUS CHINENSIS）提取物、1,2-戊二醇、羟苯基丙酰胺苯甲酸、水解小核菌（SCLEROTIUM ROLFSSII）胶、二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐、聚山梨醇酯-20、棕榈酰寡肽、棕榈酰四肽-7、PEG-40 氢化蓖麻油、香精、甲基异噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、羟苯甲酯。我们在此面膜基液的基础上，添加了 10 mM的半胱胺(Sigma, USA)，10³ IU/mL LIF (InVitrogen, USA)，10 m M Y27632 (Renova Life Inc. USA)，研发出活性肽多重修护科技面膜，产品批号为L2015031323，作为处理组。我们在人脸部贴敷实验，每周3次，每次20分钟，共贴敷8周。面膜的敷贴效果见表6。我们从多个方面的比对发现，处理组在渗透性，光亮性，美白效果，细纹除皱效果，紧致性方面较市销的活性肽全能面膜都有明显的提升效果。
表6. 面膜试贴效果评判与对比试验

评定标准：0 - 5   0 最差，5 最好。
根据上述皮肤成体干细胞的免疫荧光染色的结果与本实施例的结果看出，添加这三个因子对增加光亮性、美白、细纹除皱、紧致性具有促进作用，是因为三个因子首先促进皮肤成体干细胞的再生，然后由成体干细胞向基底细胞的增殖与分化，并定向分化为更特殊的终端细胞类型，比如细胞本身能够分泌透明质酸，可以达到皮肤的自我保湿的功能，导致皮肤本身的紧致、光亮与细纹去除。
我们在对爽肤水、面霜、洗面乳做人面部使用效果体验实验时，发现了与面膜的人面部贴敷试验相似的结果，含有三个因子组合物的处理组在渗透性、光亮性、美白效果、细纹除皱效果和紧致性方面较市销产品都有明显的提升效果。