一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂.pdf

一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，属于兽用生物制品技术领域。该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、法氏囊素2～16mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：垂盆草、金果榄、鸡矢藤、水牛角、蝼蛄、香薷、防己、半边莲和路路通。采用本发明冻干保护剂制备的疫苗免疫机体后，能促进机体B淋巴细胞前体的分化、增殖，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强，从而可提高机体免疫力。

1.  一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、法氏囊素2～16mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：垂盆草、金果榄、鸡矢藤、水牛角、蝼蛄、香薷、防己、半边莲和路路通。

2.  如权利要求1所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖50～80g、中药黄酮30～50g、法氏囊素4～12mg。

3.  如权利要求1所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按垂盆草10～30份、金果榄20～40份、鸡矢藤10～20份、水牛角10～30份、蝼蛄10～30份、香薷10～20份、防己10～30份、半边莲10～30份和路路通10～20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液；
e、将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白；
f、将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得中药多糖；
g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后经冷冻真空干燥制成中药黄酮。

4.  如权利要求1所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素。

一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。
背景技术
猪瘟（CSF）是国际动物卫生组织（OIE）和中国的A类法定传染病，是我国强制性免疫的重大动物疫病之一，是危害我国养猪业的“第一杀手”。猪瘟是由猪瘟病毒引起的，无法用药物进行控制，疫苗免疫是最有效的办法。
目前国内外市售的猪瘟疫苗主要有猪瘟脾淋苗、猪瘟细胞苗以及猪瘟亚单位疫苗，但市场上猪瘟疫苗的主流产品仍然是猪瘟脾淋苗和猪瘟细胞苗。作为疫苗中的经典-精制猪瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。
猪瘟脾淋源活疫苗选用中国猪瘟兔化弱毒株（C株），该疫苗株能激发机体快速产生免疫力、遗传稳定、毒力不返强，是国际上公认的目前世界上最为安全有效的弱毒疫苗株。采用该毒株接种优良家兔，收获感染家兔的脾脏制成乳剂，与冻干保护剂混匀后经过冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源活疫苗。
目前市场认为猪瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，对猪瘟脾淋活疫苗的认识仍存在误区，这主要和目前国内猪瘟脾淋源活疫苗使用方法不当、混合感染猪只免疫后应激过大，以及质量参差不齐等情况有关。
近年来，人们针对活疫苗冻干保护剂进行了大量研究，多为耐热保护剂，解决了疫苗在运输使用过程中的耐热问题，但对于提高活疫苗效果方面几乎没有提升。
多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力，同时多糖也具有很好的耐热效果，多种实验表明中药多糖可作为耐热保护剂添加于活疫苗冻干保护剂中。
黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
法氏囊素(bursin，BS) 是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius) 中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。
基于上述背景技术，本发明提出一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。该保护剂主要由中药多糖、中药黄酮、法氏囊素等组成。本发明所制备的冻干保护剂一方面可以提供给活疫苗耐热保护，另一方面在疫苗使用过程中大大提高了疫苗的使用效果，同时还兼具了提高机体免疫力的功效。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂的技术方案，该冻干保护剂能够大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。
所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、法氏囊素2～16mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：垂盆草、金果榄、鸡矢藤、水牛角、蝼蛄、香薷、防己、半边莲和路路通。
所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖50～80g、中药黄酮30～50g、法氏囊素4～12mg。
所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：
a、按垂盆草10～30份、金果榄20～40份、鸡矢藤10～20份、水牛角10～30份、蝼蛄10～30份、香薷10～20份、防己10～30份、半边莲10～30份和路路通10～20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液；
e、将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白；
f、将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得中药多糖；
g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后经冷冻真空干燥制成中药黄酮。
所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素。
上述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂，设计合理，与传统的冻干保护剂相比其具有以下优点：
1.本发明所制备的冻干保护剂，具有耐热效果，可提高疫苗运输、储藏等便利性。
2.采用本发明冻干保护剂所制备的疫苗在免疫注射时可以减少猪只疼痛感，降低猪只的应激反应。
3. 采用本发明冻干保护剂制备疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的产生中和抗体，减少免疫空档期，降低猪只发病几率，提高机体抵御疾病的能力。
4.采用本发明冻干保护剂制备的疫苗免疫机体后，能促进机体B淋巴细胞前体的分化、增殖，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强，从而可提高机体免疫力。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：中药多糖和中药黄酮的制备
a、按垂盆草30份、金果榄20份、鸡矢藤20份、水牛角30份、蝼蛄30份、香薷10份、防己10份、半边莲10份和路路通10份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；
g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。
该实施例中步骤a中可以称取垂盆草10份、金果榄30份、鸡矢藤15份、水牛角20份、蝼蛄20份、香薷20份、防己20份、半边莲20份和路路通20份进行加工，也可以称取按垂盆草15份、金果榄40份、鸡矢藤15份、水牛角15份、蝼蛄25份、香薷15份、防己15份、半边莲25份和路路通15份进行加工。
实施例2：法氏囊素的制备
a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， PH7.2灭菌冷PBS洗净。
b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入PH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。
c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。
d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。
e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥制成法氏囊素冻干粉。
实施例3：一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂的制备
在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖60g、中药黄酮40g、法氏囊素12mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。
实施例4：一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂的制备
在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖40g、中药黄酮50g、法氏囊素15mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。
实施例5：一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂的制备
在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖100g、中药黄酮20g、法氏囊素10mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。
实施例6：冻干保护剂的使用方法
1.猪瘟脾淋源病毒悬液制备
（1）接种家兔的选择
选择生长状况良好、体重1.5-3kg的家兔100只。
（2）接种
取生产用毒种，用上述病毒稀释液作适当稀释（如10^-1.5或10^-2），每只家兔耳静脉接种1ml。接种后家兔正常饲养。
（3）测温观察
家兔接种后，上、下午各测体温一次，24小时后，每隔6小时测体温一次。测温至72小时。
（4）收获
选择定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾脏。
（5）病毒悬液制备及检验
在无菌操作下剔除脂肪组织。将脾脏组织称重、剪碎，于同一容器内混合研磨，然后滤过，测定病毒含量，脾毒对家兔的最小感染量应≤10^-5/ml。
2.疫苗制备
将无菌检验和病毒含量检测合格的病毒悬液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入实施例3、4或5中制备的冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源冻干活疫苗（实验）。
同时将将无菌检验和病毒含量检测合格的细胞毒液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入蔗糖牛奶保护剂，充分混匀后定量分装，经冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源冻干活疫苗（对照）。
3.疫苗检验
（1）随保存时间，各项指标检验结果
将上述制备的两批疫苗放置常温（25℃）进行保存，并每隔一个月进行病毒含量检测，检测结果见表1：
表1 保存期检测结果（37℃）

（2）疫苗免疫效果
取20头猪瘟抗体阴性健康仔猪，分为两组，实验组和对照组。实验组免疫含本发明冻干保护剂疫苗，对照组免疫含蔗糖牛奶冻干保护剂疫苗，免疫后3天起采血检测其中和抗体效价，结果见表2。
表2 免疫比较结果