水晶骨骼标本的制作方法.pdf

本发明公开了一种水晶骨骼标本的制作方法。所述方法包括如下步骤：获取动物标本后采用50％乙醇、100％甲醇、100％丙酮和100％乙醇固定动物标本；然后采用0.5～3％过氧化氢溶液和100％丙酮脱脂和脱色；再采用Alizerin red和/或Alcian blue进行骨骼染色处理；去除特异性着色，采用100％乙醇和/或1.5％氢氧化钾处理；之后采用50％丙三醇、75％丙三醇和100％丙三醇进行梯度透明化处理；最后在显微镜下，除去相应部位的软组织，得到所述水晶骨骼标本。本发明制作方法的制作周期缩短为15～30天，制作出的水晶骨骼在质量上优越，且制作种类较多，具有商业化大规模生产的潜力。

1.  水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取材：获取动物标本；
(2)固定：采用50％乙醇、100％甲醇、100％丙酮和100％乙醇固定步骤(1)获得的动物标本；
(3)染色：采用Alizerin red染色液和/或Alcian blue染色液对步骤(2)固定的动物标本进行骨骼染色处理；
(4)透明：采用50％丙三醇、75％丙三醇和100％丙三醇对步骤(3)染色后的动物标本进行梯度透明化处理；
(5)显微处理：在显微镜下，对步骤(4)透明化处理后的动物标本除去相应部位的软组织，得到所述水晶骨骼标本。

2.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，染色前用30％过氧化氢进行标本处理。

3.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，染色前对动物标本外表皮肤行显微镜下剥离术。

4.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，染色前用质量百分数为0.5～3％的氢氧化钾溶液进行动物标本脱脂处理。

5.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体步骤为：
(a)配制冰醋酸和乙醇的混合液，其体积比例为(1～2):(4～6)，然后按照(100～500)μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中，得到Alcian blue染色液；所述Alcian blue储存液是用70％酒精配制的Alcian blue饱和液；
(b)配制质量百分数为0.5～3％的氢氧化钾溶液，按照100μL/100mL的比例加入Alizerin red，得到Alizerin red染色液；
(c)采用步骤(a)和/或(b)配制的染色液对步骤(2)固定的动物标本 进行骨骼染色处理。

6.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)染色过程中使用冰醋酸和/或氢氧化钾对染液pH进行调节，使染色剂和骨骼快速特异性结合。

7.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，所述步骤(3)染色过程中，采用少量、多次染色法。

8.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用Alcian blue染色液染色后用100％乙醇洗净浮色；采用Alizerin red染色液染色后用质量百分数为1.5％的氢氧化钾溶液洗净浮色。

9.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，染色后采用质量百分数为5％的氢氧化钾溶液处理，或是重复交叉采用质量百分数为1.5％的氢氧化钾溶液和30％过氧化氢处理。

10.  根据权利要求1所述的水晶骨骼标本的制作方法，其特征在于，在步骤(3)中，染色后用甲醛溶液对标本进行定型。

水晶骨骼标本的制作方法
技术领域
本发明属于医学或生物科学领域，涉及一种动物标本的制作方法，具体涉及一种水晶骨骼标本的制作方法。
背景技术
目前国内市场上制作出来的动物标本大多数是采用福尔马林固定的普通标本。其外观美观度差，且无法清晰的观察到骨骼发育的情况，不易于对于各种骨骼发育畸形进行研究和教学，目前国内还未形成水晶骨骼艺术的潮流，同样也缺少规模制作水晶骨骼标本的厂家。并且国内相关技术有限，在制作难度较大的骨骼标本的技术尚有待提高。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种水晶骨骼标本的制作方法。该制作方法中采用一种全新的染色方法，制作周期缩短为15～30天，制作出的水晶骨骼在质量上优越，且制作种类较多，具有商业化大规模生产的潜力。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
水晶骨骼标本的制作方法，包括如下步骤：
(1)取材：获取动物标本；
(2)固定：采用50％乙醇、100％甲醇、100％丙酮和100％乙醇固定步骤(1)获得的动物标本；
(3)染色：采用Alizerin red(中文名称茜素红)染色液和/或Alcian blue (中文名称阿利新蓝)染色液对步骤(2)固定的动物标本进行骨骼染色处理；
(4)透明：采用50％丙三醇、75％丙三醇和100％丙三醇对步骤(3)染色后的动物标本进行梯度透明化处理；
(5)显微处理：在显微镜下，对步骤(4)透明化处理后的动物标本除去相应部位的软组织，得到所述水晶骨骼标本。
在优选方案中，在步骤(3)中，染色前用30％过氧化氢进行标本处理；
在优选方案中，在步骤(3)中，染色前对动物标本外表皮肤行显微镜下剥离术；
在优选方案中，在步骤(3)中，染色前用质量百分数为0.5～3％的氢氧化钾溶液进行动物标本脱脂处理；
在优选方案中，所述步骤(3)的具体步骤为：
(a)配制冰醋酸和乙醇的混合液，其体积比例为(1～2):(4～6)，然后按照(100～500)μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中，得到Alcian blue染色液，所述储存液是用70％酒精配制的Alcian blue饱和液；
(b)配制质量百分数为0.5～3％的氢氧化钾溶液，按照100μL/100mL的比例加入Alizerin red，得到Alizerin red染色液；
(c)采用步骤(a)和/或(b)配制的染色液对步骤(2)固定的动物标本进行骨骼染色处理。
根据材料的不同所需要的染色液的酸碱程度而有所差异，Alizerin red染色液的pH值一般为8～10，Alcian blue染色液的pH值一般为2～4。
在优选方案中，在步骤(3)染色过程中使用冰醋酸和/或氢氧化钾对染液pH进行调节，使染色剂和骨骼快速特异性结合；
在优选方案中，所述步骤(3)染色过程中，采用少量、多次染色法。
在优选方案中，在步骤(3)中，采用Alcian blue染色液染色后用100％乙醇洗净浮色；采用Alizerin red染色液染色后用质量百分数为1.5％的氢氧化钾溶液洗净浮色。
在优选方案中，在步骤(3)中，染色后采用质量百分数为5％的氢氧化钾溶液处理，或是重复交叉采用质量百分数为1.5％的氢氧化钾溶液和30％过氧化氢处理。
在优选方案中，在步骤(3)中，染色后用甲醛溶液对标本进行定型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明公开了“水晶骨骼标本”的制作方法，且是第一次命名“水晶骨骼标本”；固定，采用50％乙醇、100％甲醇、100％丙酮和100％乙醇固定动物标本，对环境不会带来污染；在Alizerin red和/或Alcian blue进行骨骼染色的染色液进行了化繁为简的处理，易于操作；本发明制作方法的制作周期缩短为15～30天，制作出的水晶骨骼在质量上优越，且制作种类较多，具有商业化大规模生产的潜力；本发明制作方法所得水晶骨骼，具有骨骼精细、美观、透明度高、制作周期短、可量产等特点。
水晶骨骼是一种能够快速使动物骨骼以类似“4D X-ray”的效果展现出来的方法，使得平时无法观察到微细的骨骼系统能够清晰地、丝发未损且原生态地呈现出来。与传统的骨骼标本不同，水晶骨骼艺术品色彩斑斓，呈现水晶般的奇幻效果，不用传统福尔马林浸泡，而采用环保无毒的溶液进行保存，不仅可以用于骨骼系统发育领域的科学研究，还具有广泛的艺术欣赏和教学运用等价值。
水晶骨骼艺术品的制作过程是根据骨骼不同位置组织的化学性质分步进行的，软骨组织必须在酸性的环境中才可以染色(Alcian Blue)，而硬骨组织则需要在碱性条件下着色(Alizarin Red)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明中所述的50％乙醇、100％甲醇、100％丙酮、100％乙醇、50％丙三醇、75％丙三醇、100％丙三醇和30％过氧化氢中的百分数是指体积百分比浓度。
实施例1
制作鸡胚水晶骨骼标本的方法，具体步骤如下：
取孵化12天鸡胚，放入50％乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将鸡胚放入100％乙醇中固定12小时；
配制Alcian blue染色液，将鸡胚行去皮术后放入染色液中约14小时；之后放入100％乙醇中洗去浮色，将鸡胚放入5％氢氧化钾溶液中约24～28小时；配制Alizerin red染色液，将鸡胚放入染色液中染色3～10天(根据胚胎的大小)；再将鸡胚放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色约12小时；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约2天直至胚胎沉到底部；对染色后的鸡胚进行显微处理完成制作。
实施例2
制作乌龟水晶骨骼标本的方法，具体步骤如下：
取巴西龟一只或数只，放入50％乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将巴西龟放入100％乙醇中固定12小时；
将250微升30％过氧化氢加入到1000mL纯水中，放入巴西龟，漂洗5天；
配制Alizerin red染色液，将巴西龟放入染色液中染色15～20天；再将巴西龟放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色约24小时；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约2天直至乌龟沉到容器底部；对染色后的巴西龟进行显微处理完成制作。
实施例3
制作鱼类水晶骨骼标本的方法，具体步骤如下：
取鱼类一条或数条，放入50％乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将小鱼放入100％乙醇中固定12小时；
将250微升30％过氧化氢加入到1000mL纯水中，放入小鱼，漂洗24小时，漂洗24小时；
配制Alizerin red染色液，将小鱼放入染色液中染色5天，再将小鱼放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色及对周围组织进行脱脂处理3天；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约2天直至鱼体沉到容器底部；对染色后的小鱼进行显微处理完成制作。
实施例4
制作蛇水晶骨骼标本的方法，具体步骤如下：
取蛇一条，放入50％乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将蛇放入100％乙醇中固定12小时；
将1.25毫升30％过氧化氢加入到5000mL纯水中，放入蛇，漂洗24小时，
配制Alizerin red染色液，将蛇放入染色液中染色10天，再将蛇放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色及对周围组织进行脱脂处理10天；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约6天直至蛇沉到容器底部；对染色后的蛇进行显微处理；将蛇放入甲醛溶液中定型2小时完成制作。
实施例5
制作人类胚胎水晶骨骼方法，具体步骤如下：
取人类胚胎放入50％乙醇中固定，放摇床12小时，然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时(小于12周人胚可以省略)；最后将人类胚胎放入100％乙醇中固定12小时；
配制Alcian blue染色液(按照冰醋酸100％酒精体积比例为(1～2):(4～6)，然后按照(100～500)μL/100mL的比例加入Alcian blue储存液)后，再根据胚胎大小增加冰醋酸浓度至最适pH至2；将人类胚胎行去皮术后放入染色液中约14小时；之后放入100％乙醇中洗去浮色，将人类胚胎放入5％氢氧化钾溶液中约24～28小时；配制Alizerin red染色液，增加氢氧化钾浓度至最适pH，将人类胚胎放入染色液中染色2～6天；再将人类胚胎放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色约12小时，脱脂处理；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约6天直至胚胎沉到容器底部；对染色后的人类胚胎进行显微处理完成制作。
实施例6
制作鼠水晶骨骼方法，具体步骤如下：
取鼠放入50％乙醇中固定，放摇床12小时，然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将鼠放入100％乙醇中固定12小时；
将250微升30％过氧化氢加入到1000mL纯水中，放入鼠，漂洗24小时；
配制Alizerin red染色液，将鼠放入染色液中染色8～14天，再将鼠放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色及对周围组织进行脱脂处理10天；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约6天直至沉到容器底部；对染色后的鼠进行显微处理完成制作。
实施例7
制作动物眼球水晶骨骼的方法，具体步骤如下：
对鸟类、爬行类动物的眼球放入50％乙醇中固定，放摇床12小时，然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将眼球放入100％乙醇中固定12小时；
配制Alcian blue染色液(按照冰醋酸100％酒精体积比例为(1～2):(4～6)，然后按照(100～500)μL/100mL的比例加入Alcian blue储存液)后，再根据眼球大小增加冰醋酸浓度至最适pH＝2；染色10小时，再将眼球放入1.5％氧化钾溶液中漂洗非特异性着色及对周围组织进行脱脂处理1天；
放入50％丙三醇中约48小时，后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约1.5天直至沉到容器底部；显微操作对视网膜色素层进行去色处理完成。
实施例8
蝙蝠水晶骨骼的制作方法，具体步骤如下：
取蝙蝠一只，行去皮术，放入50％乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100％甲醇中固定12小时；再放入100％丙酮中固定12小时；最后将蝙蝠放入100％乙醇中固定12小时；
将250微升30％过氧化氢加入到1000mL纯水中，放入蝙蝠，漂洗24小时，
配制Alizerin red染色液，染色15天，再将蝙蝠放入1.5％氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色及对周围组织进行脱脂处理10天；
放入50％丙三醇中约48小时；后提前进行显微处理，去除多余软组织后依次进入75％丙三醇、100％丙三醇进行梯度透明化处理大约3天直至沉到容器底部；对染色后的蝙蝠进行显微处理完成制作。
本发明所得的水晶骨骼，具有骨骼精细、美观、透明度高、制作周期短、 可量产等特点，为充分证明，有关调查资料如下。
1.1水晶骨骼制作：共设4组，分别为实施例8方案组、实施例5方案组、实施例2方案组和对照组，对照组为传统标本；
1.2比较方法：从人群中，随机选100人，调查其对两种不同的标本的喜爱程度；
1.3统计学分析用SPSS 13.0进行统计分析，P<0.05表示有显著性意义。
2结果，经统计学处理，本发明各实施例组与对照组比较具有明显差异，结果表明，本发明较传统的标本更易为人群所接受。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。