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本发明提供一种生物医学领域的一种HLA-A33限制性eEF2表位多肽及其应用。本发明的HLA-A33限制性eEF2表位多肽与HLA-A33具有强亲合力，其可以在HLA-A33阳性结肠癌患者或其他HLA-A33阳性和eEF2阳性的肿瘤患者外周血中诱导出抗原特异性的、HLA-A33限制性的具有高杀伤活性和高IFN-γ分泌能力细胞毒T淋巴细胞。所以本发明的HLA-A33限制性eEF2表位多肽可以在制备治疗或预防肿瘤药物中应用。

1.  一种eEF2表位多肽，其特征在于，所述eEF2表位多肽为HLA-A33限制性eEF2表位多肽，所述多肽具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性，其氨基酸序列选自下述(a)-(b)：
(a)DLYLKPIQR，即SEQ ID NO.1；
(b)在(a)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1-4个氨基酸而得到的，且具有诱导细毒T细胞氨基酸序列。

2.  编码权利要求1所述eEF2表位多肽的多核苷酸。

3.  含有权利要求2所述多核苷酸的表达载体。

4.  一种重组蛋白，其特征在于，含有权利要求1所述的eEF2表位多肽。

5.  一种抗原递呈细胞，其特征在于，所述抗原递呈细胞是被权利要求1所述的eEF2表位多肽致敏的。

6.  一种针对权利要求1所述的eEF2表位多肽的特异性免疫效应细胞。

7.  一种药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A33阳性对象的肿瘤，其特征在于，包含权利要求1所述eEF2表位多肽或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求5所述的抗原递呈细胞或权利要求6所述的特异性免疫效应细胞。

8.  根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

9.  权利要求1所述的eEF2表位多肽、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求5所述的抗原递呈细胞或权利要求6所述的特异性免疫效应细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。

一种HLA-A33限制性eEF2表位多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种HLA-A33限制性eEF2表位多肽及其应用。
技术背景
eEF2即真核细胞延长子2，有6个结构域，是一个位于胞浆内的分子量95.2kDa的单体蛋白，有857个氨基酸残基。eEF2基因位于人19号染色体，有9407个碱基。eEF2分子含3个结构区(即I－II结构域，III结构域和IV－V结构域)，它们相互之间相对移动。GTP结合基序朝向eEF2区的氨基端，可能参与与核糖体的结合。这个区域在eEF2的56位苏氨酸处含有主要的生理性磷酸化位点。eEF2的氨基酸序列高度保守，在哺乳动物中显示了非常高的一致性(>99％)。eEF2含有独特的把组氨酸转录后修饰成白喉酰胺的功能。根据从酵母细胞中获得的遗传证据，合成白喉酰胺至少需要5个不同的步骤。然而这种修饰似乎是正常细胞生长所不需要的。在真核细胞蛋白合成调节中，翻译水平的延长调节可能是重要的步骤之一。这一步主要通过eEF2的活化和失活来调节，同时eEF2的活化和失活也介导蛋白翻译后转位。最近的研究成果显示eEF2特异性酶(eEF2酶)通过磷酸化eEF2而调节它。真核细胞内，eEF2酶通过各种刺激进行自身调节，从而在每次需要的时候最终控制蛋白合成。
在多种生物学状态下如细胞周期进程、遗传毒性压力或内源性一氧化碳应答(有抗增殖效应)，细胞通过调节eEF2活性在多肽链延长过程中控制翻译水平。eEF2在人胃癌、结肠癌、肺癌、食管癌、头颈部鳞癌胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤等多种肿瘤中过表达。eEF2的过表达促进细胞周期G2/M进程，进而在体内外促进肿瘤细胞的生长。
因此，如果以eEF2为靶标，对机体进行免疫，将会使机体产生针对eEF2蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地抑制、清除肿瘤细胞，为相关肿瘤的预防及治疗提供措施。
合成肽疫苗是近年来随着分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，而且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于抗肿瘤及抗病毒免疫治疗。为了提高肿瘤疫苗临床应用的效果，人们一直在筛选以MHC-I类分子限制的方式、由CD8+T细胞特异性识别的抗原。细胞免疫在抗肿瘤和抗病毒免疫中起关键作用。T细胞识别的抗原为与细胞表面的MHC-I类或II类分子结合的肽，其长度约为8-12个氨基酸。而作为杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞细胞毒T淋巴细胞(CTLs)则识别与MHC-I类分子结合的内源性肽。己有证据表明，合成肽能直接与MHC-I类分子结合，而不需要APC的加工、处理，它和天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有同等的效力。多肽疫苗己成为目前抗恶性肿瘤的一项新策略，也是目前研究最多的肿瘤治疗性疫苗。研究较多的有：(1)gp 100,来源于gp 100的肽G9154(KTWGQYWQV)、G9209(ITDQVPPFSV)均能诱导抗原特异性的CTLs。用之致敏来自HLA-A2⁺的黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)，能明显增强其诱导特异性CTLs的能力：诱导的CTLs即能识别未修饰的Gg100；(2)CEA,采用与上述相似的方法，Zaremba等建立81对CEA的肽CAP-1-6D不仅能在体外致敏CEA特异的CTLs，其效力为CAPI的100-1000倍，在体内也能诱导CEA特异的CTLs(而CAP-1却不能)；而且所致敏的CTLs同样能识别CAP-1。更为重要的是，这些CTLs能溶解同源的表达CEA的人类肿瘤；(3)MAGE-2,MAGE-2广泛存在于黑色素瘤、喉癌、肺癌、肉瘤等多种肿瘤(除睾丸外)，不存在于正常组织；(4)P21^WAFI,将P21^WAFI的肽与内源化肽融合能抑制肿瘤的生长；(5)HER2/neu,来源于HER2/neu的肽在体外能致敏特异性的CTLs，在小鼠体内也能诱导特异的CTLs，且能抑制肿瘤的生长。
人们发现许多不同等位基因甚至不同血清型的HLA-I类分子所结合的抗原肽具有相同或相似的锚着残基，这些HLA分子总称为超型；而相应的与HLA超型结合的抗原肽所共同具有的氨基酸序列称为超基序。目前经实验证实或经理论推测的HLA的超型有A2、A3、A33、B7、B44、B27、B58、B62、DR等。
中国专利文献(CN102348769A)中公开了HLA-A*2402限制性eEF2肽和HLA-A*0201限制性eEF2肽、以及包含这些肽的癌症的治疗/预防用药物组合物， 可以在具有HLA-A*2402或HLA-A*0201的对象中诱导体内和体外的eEF2特异性CTLs。尽管在研究肿瘤特异性肽疫苗方面已取得了重大的进步，但由于目前已鉴定出来的T细胞表位十分局限，主要集中在HLA-A2，缺少A33、A24、A11限制性表位。而随着人种的不同，其HLA-I类分子呈现多态性，除A2外，A33、A24、A11也占据了很大的比重。HLA-A33是一种在我国人群中具有较高分布的一种MHC-I类分子，阳性率在10-20％之间。因此，鉴定新的HLA限制性的肿瘤抗原显得极为必要和重要。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有技术中缺少HLA-A33限制性表位。
一种eEF2表位多肽，所述eEF2表位多肽为HLA-A33限制性eEF2表位多肽，所述多肽具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性，其氨基酸序列选自下述(a)-(b)：
(a)DLYLKPIQR，即SEQ ID NO.1；
(b)在(a)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1-4个氨基酸而得到的，且具有诱导细毒T细胞氨基酸序列。
本发明的目的还在于提供编码上述eEF2表位多肽的多核苷酸以及含有所述多核苷酸的表达载体。
本发明的目的还在于提供一种重组蛋白，含有上述的eEF2表位多肽。
本发明的目的还在于提供一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞是被上述eEF2表位多肽致敏的。
较佳地，所述抗原递呈细胞经过分离和纯化。
较佳地，所述的抗原递呈细胞选自：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞或内皮细胞。
本发明的目的还在于提供一种针对上述的eEF2表位多肽的特异性免疫效应细胞。
本发明的目的还在于提供一种药物组合物。
所述药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A33阳性对象的肿瘤，包含上述eEF2表位多肽或上述多核苷酸或上述的抗原递呈细胞或上述的特异性免疫效应细胞。
所述药物组合物，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
所述药物组合物，其中上述eEF2表位多肽或上述的抗原递呈细胞或上述的特异性免疫效应细胞含量为0.001-99.99wt％，优选0.1-99.0wt％，更优选1-90wt％。
所述HLA-A33阳性对象的肿瘤可以是胃癌、结肠癌、肺癌、食管癌、头颈部鳞癌胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
本发明的目的还在于提供上述eEF2表位多肽、编码所述eEF2表位多肽的多核苷酸、上述抗原递呈细胞或上述特异性免疫效应细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
上述eEF2表位多肽、编码eEF2表位多肽的多核苷酸或含有eEF2表位多肽的重组蛋白可以通过化学合成或生物重组的方法制备。
上述eEF2表位多肽用于制备包含该eEF2表位多肽的重组蛋白或用于制备致敏的抗原递呈细胞。
本发明的有益效果：本发明的HLA-A33限制性eEF2表位多肽与HLA-A33具有强亲合力，对其免疫原性进行评价，发现其可以在HLA-A33阳性结肠癌病人外周血中诱导出eEF2特异性的、HLA-A33限制性的细胞毒T淋巴细胞，而且是一个被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。HLA-A33限制性eEF2表位多肽诱导的抗原特异的细胞毒T淋巴细胞具有高杀伤活性和高IFN-γ分泌能力。
附图说明
以下将结合附图和具体实例对本发明进行进一步的阐述。
图1为不同肽致敏的树突状细胞(DC)分别体外诱导HLA-A33阳性结肠癌病人外周血淋巴细胞所产生的抗原特异性CD8+T细胞的IFN-γ分泌的ELISPOT检测结果；(A)为用负载有P441-449肽的刺激细胞(RMA-S-P441-449)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激磁珠分选出的P441-449肽特异的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的T细胞数；(B)为用负载有P256-264肽的刺激细胞(RMA-S-P256-264)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激磁珠分选出的P256-264肽特异的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的T细胞数；(C)为用负载有P731-739肽的刺激细胞(RMA-S-P731-739)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激磁珠分选出的P731-739肽特异的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的T细胞数。
图2为P441-449肽致敏的树突状细胞(DC)体外诱导HLA-A33阳性结肠癌病人外周血淋巴细胞所产生的抗原特异性CTLs细胞的IFN-γ分泌的流式细胞仪检测结果；其中A图的效应细胞来自无抗原肽负载的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；B图的效应细胞来自P441-449肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；C图的效应细胞来自P256-264肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；D图的效应细胞来自P731-739肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞。
具体实施方式
本发明人在对eEF2进行计算机模拟分析的基础上，选择性地合成了多条有可能与HLA-A33结合并诱导机体产生CTLs的eEF2特异的抗原肽(如表1)，通过稳定表达HLA-A33分子的RMA-S细胞(TAP缺陷型)的肽结合实验，筛选出与HLA-A33具有强亲合力的表位肽。对其免疫原性进行评价，发现其不仅可以在HLA-A33阳性结肠癌病人外周血中诱导出eEF2特异性的、HLA-A33限制性的细胞毒T淋巴细胞，而且是一个能被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。在此基础上完成了本发明。
此外本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的HLA-A33限制性eEF2表位多肽、编码上述eEF2表位多肽的多核苷酸或被所述的eEF2表位多肽致敏的抗原递呈细胞、或针对所述的eEF2表位多肽的特异性免疫效应细胞。本发明的eEF2表位多肽的数量一般为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
本发明中所用“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克的本发明的eEF2表位多肽。
上述药物组合物还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。所述“药学上可接受的载体”是指用于治疗剂给药的载体，是指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体时本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack  Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
药物组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的药物组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
本发明的含本发明eEF2表位多肽的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、HLA-A33高亲和力肽的筛选
应用肽结合实验筛选与HLA-A33高亲和力的表位肽具体如下：
首先收集稳定表达HLA-A33分子的RMA-S细胞(购买于ATCC)，用冰PBS洗三次后，调细胞浓度至1×10⁶/ml，铺于96孔板中，100μl/孔。再与50μM的候选多肽，2.5μg/ml的β2微球蛋白(购自R&D公司)于37℃，5％CO₂孵箱中共孵育18h。之后，收集孵育好的细胞，用冰PBS洗(pH 7.2，PBS为缓冲液)三遍，加入2μl FITC标记的HLA-A33特异性的单克隆抗体(Sterotec Ltd，Oxford，UK)，放置4℃冰箱,孵育30min，之后PBS(pH 7.2，PBS为缓冲液)洗三遍， 接着用流式细胞仪(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)检测平均荧光强度。
检测方法：免疫荧光法检测肽与HLA-A33分子的结合情况，是基于外源性多肽与RMA-S细胞表面MHC-I类分子的结合可使其表面的MHC-I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，则可检测到的MHC-I类分子的表达量越多，以平均荧光强度为检测指标。结果以荧光系数(FI)作为衡量指标。其中，多肽的FI>1被认为是高亲和力的表位。
荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度
实验结果：免疫荧光法测得的eEF2来源的多肽与RMA-S-HLA-A33结合的结果如表1所示。本发明人许多条eEF2来源多肽中筛选出与HLA-A33具有高亲和力的表位肽P441-449，其序列为DLYLKPIQR(SEQ ID NO.1)。
表1.eEF2来源的多肽与RMA-S-HLA-A33亲和力结果

实施例2、HLA-A33阳性结肠癌病人外周血淋巴细胞eEF2来源的HLA-A33限制性多肽抗原特异性CTLs的体外诱导
HLA-A33⁺/eEF2⁺结肠癌病人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque 1.077，购自Sigma公司)密度梯度离心(室温，400×g，30分钟)，取界面细胞，置入50ml离心管中，用无钙镁PBS(pH7.2)－EDTA(2mM)洗细胞3次，获得外周血单个核细胞(PBMC)。所获得的单个核细胞用完全培养基(含10％AB血清的RPMI1640)悬浮PBMC，按1×10⁷细胞/孔铺于6孔板，37℃、5％CO₂孵育2小时后，轻晃板子，吸出非贴壁细胞,冻存备用。
贴壁细胞用含人重组rhGM-CSF(500U/ml)和人重组rhIL-4(10ng/ml)(购 自R&D公司)的DC无血清培养基液，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。培养到第七天，收集DC，分别用肽P441-449、P256-264和P731-739致敏4小时。同时复苏冻存的非贴壁细胞(富含淋巴细胞)，悬浮于10％AB血清的RPMI1640培养基中，调整细胞浓度为4×10⁶细胞/ml，分别取0.5ml加入至上述经肽P441-449、P256-264和P731-739致敏的自体DCs中，于37℃、5％二氧化碳条件下共培养(T：DCs＝10:1)，此为第一轮的刺激。之后于共培养的第五天加入20U/ml rhIL-2，培养7天后收集上述淋巴细胞，同样以10：1的比例再与新鲜制备的2×10⁵/ml肽致敏的同体DCs用10％AB血清RPMI1640培养液共培养进行第二轮的刺激。同样的刺激每周一次共刺激三次。培养过程中每隔3天加入一次20U/ml rhIL-2，2-3天半量更换新鲜培养基，并依据需要进行细胞的分孔扩增，末次刺激后的7天收集细胞，使用免疫磁珠阳性选择分选CD8+T细胞，方法严格依照厂商(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach,Germany)提供的说明书进行。
分选出的CD8+T效应细胞：
(1)ELISPOT检测(结果如图1所示)。
经免疫磁珠分选出的CD8⁺T细胞悬浮于10％AB血清的RPMI1640培养基中作为反应细胞，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，细胞悬液直接转入包被有抗IFN-γ抗体的ELISPOT检测板，100μl/孔。RMA-S细胞用4000rad钴⁶⁰照射去增殖后作为刺激细胞，结合eEF2抗原肽，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，然后将细胞悬液分别加入已含有刺激细胞的检测孔中，100μl/孔。参照IFN-γELISPOT检测试剂盒说明书的方法检测分泌IFN-γ的T细胞数。图1(A)是磁珠分选出的P441-449肽特异的CD8⁺T细胞，用负载有P441-449肽的刺激细胞(RMA-S-P441-449)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激后，检测到的分泌IFN-γ的T细胞数。*表示P＜0.01；图1(B)是磁珠分选出的P256-264肽特异的CD8⁺T细胞，用负载有P256-264肽的刺激细胞(RMA-S-P256-264)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激后，检测到的分泌IFN-γ的T细胞数；图1(C)是磁珠分选出的P731-739肽特异的CD8⁺T细胞，用负载有P731-739肽的刺激细胞(RMA-S-P731-739)及对照刺激细胞(RMA-S-PBS)刺激后，检测到的分泌IFN-γ的T细胞数。
(2)肽特异性CTL胞内IFN-γ染色。
在上述所诱导的效应细胞中加入20μM相应的肽，48小时后，常规胞内染色(结果如图2所示)。其中A图的效应细胞来自无抗原肽负载的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；B图的效应细胞来自P441-449肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；C图的效应细胞来自P256-264肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞；D图的效应细胞来自P731-739肽致敏的DC体外诱导的细胞毒T淋巴细胞。在此可以看出肿瘤相关抗原eEF2的HLA-A33限制性的高免疫原性的表位肽P441-449(其序列为DLYLKPIQR)诱导的抗原特异的细胞毒细胞具有高杀伤活性和高IFN-γ分泌能力。