造影剂 本发明涉及诊断用成像造影剂，尤其涉及血池剂，即在血管系统中滞留时间长的造影剂。
在诊断和治疗疾病中，医学成像方法，如MR成像、X-线、PET、SPECT、磁X线断层照像术、EIT、δ-闪烁照像术和CT扫描，现在正变成越来越重要的工具。某些成像技术完全依赖肌体各组成部分(如骨骼和软组织)本身固有的属性来获得这些组成部分之间图像的区别。而其它有些成像技术则要求使用药物(造影剂)来达到这种区别或改善不同组分部分之间或者正常组织与受伤组织之间的图像对比性。
在大多数成像形式中都已使用了造影剂。
然而，造影剂的功效不仅依赖于其本身固有的改善上述成像方式中图像对比的能力，而且也依赖于其药物动力学，即给药后，其空间和时间的分布方式。
通常，当造影剂进入身体血管系统中后，低分子量亲水分子(例如分子量低于50000)分布到细胞外液(ECF)中并且通过肾小球过滤作用，很快从肾脏中排泄，而微粒、脂质体或亲脂分子则在肝脏中较快地蓄积。
几种ECF和肝脏的造影剂已投放市场或在临床中已得到应用。而各种血池剂(即不分布到ECF中而能在血池中的滞留较长时间的试剂)目前虽已出现，但对这些试剂的开发尚未取得太大的进展。
因此，在MR成像领域中，早期提出的血池剂包括顺磁螯合物-大分子的共轭物，例如，该大分子为水溶性生物耐受物质如分子量超过肾阈的葡聚糖以及该螯合物为GdDTPA的情况。后来提出建议使用的聚螯合剂是几种能够螯合很多(例如20-100个)顺磁金属离子的高分子量水溶性螯合剂。
所提出的这些物质具有很多问题，例如，缺少对其特征的鉴定；不能预测生物分布；血池滞留时间不令人满意；肝脏蓄积以及不能通过肾小球充分地进行生物清除。
因此，对那些有效的并可耐受的血池剂的需求目前仍然存在。
现在，我们提出一类新颖的血池造影剂，它具有调理控制部分，这些部分与携带螯合有顺磁或重金属离子的一个大结构相结合。
因此，本发明一方面提供一种血池造影剂，其总分子量至少为10KD(优选至少为15KD，尤其为大约20KD或更大)，该造影剂包含一个大结构，它结合了大量地调理抑制部分并携带螯合离子的顺磁或重金属部分，所述螯合部分的螯合剂基团为一种大环基。所述大结构为脂质体。
调整作用是这样的一个过程，通过该过程，使血管中血蛋白附着在外来物质上，促进网状内皮系统(RBS)，主要为肝脏、脾和骨髓，快速摄取该物质。
按照本发明，各种调理抑制剂均可以使用，但通常它们是连接在所说大结构上的、末端修饰或未修饰的两亲聚合物。两亲聚合物是指其重复单元具有亲脂和亲水片段的一种聚合物。该聚合物的优选实施例为具有[CH2CH2O]重复单元的聚乙二醇，其中亚烷基链提供亲脂片段，而醚氧提供亲水片段。
因此，本发明所使用的调理抑制剂部分通常为式I
-A-(R1R2)n-B (I)
其中A为可与大结构结合的键或官能团，例如它们某种基团的残留基，这种基团具有不稳定氢或其它可取代原子或基团，例如羧基、羟基、胺、琥珀酰基、氨基甲酸硝苯酯或硫酸基，或者磷、硫或硼的含氧酸基，通过键或连接基部分，例如C1-8亚烷基链，连接到(R1R2)n上；R1和R2中的一个为亲脂性部分，例如，不饱和或饱和的由芳基或环烷基(例如苯基或环乙基)取代或未取代的或者间断的C1-8亚烷基链，而R1和R2中的另一个是亲水性部分，例如氧杂、硫杂或氮杂基，或者是由氧杂、氮杂、硫杂、胺、硫醇、羟基、氧代、硫代、亚氨基、亚磺酰基、磺酰基和膦酰基间断或取代的C1-8亚烷基链；n为整数，其值为3-200，尤其为5-100，更尤其为10-80；B是末端基，例如氢原子或亲水或疏水基，或者是顺磁或重金属螯合物部分。
如上可知，本发明诊断剂中螯合的顺磁或重金属部分可直接或通过中间基团结合到大结构上，并且这些中间基可简单地作为连接体，同时也可以作为调理抑制剂。
尤其优选作为调理抑制剂的是重复单元R1R2含亚烷氧基、亚烷硫基和亚烷亚氨基的这些部分，尤其是亚烷基部分为亚乙基或亚丙基的这些基团。最优选的是以聚乙二醇(PEG)为基础的调理抑制剂。
在Crit.Rev.in Therapeutic Drug Design 9：249(1992)和Rev.Maeromol.Chem Phys.C25：325(1985)中讨论了结合PEG及PEG衍生物的方法。
抑制剂链的长度影响其抑制调理作用的能力，并且就PEG类似的抑制剂来说，最适宜的分子量似乎为1-10KD。
作为两亲聚合物如PEG的选择，氨基葡聚糖(glycosaminoglycan)部分可选择来用作调理抑制剂。在这方面，特别可提到的是肝素、乙酰肝素、皮肤素、角质素和软骨素，尤其是软骨素-4-硫酸盐。当然，这些可以被衍生用来结合到大结构上，或者可应用于螯合物结构上。通常，所用氨基葡聚糖的链长度大约为10-100，尤其为20-60个二糖单元。该类物质通常在市场上可买到，例如在Sigma。
其它聚合物如多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和在GB9407812.8(其副本与此一道提出申请)中所描述的其它抑制剂及其衍生物可用作调理抑制剂。通常，由聚合物实现该功能时所要求的是：水溶性；与大结构(例如与聚集体大结构核心)的相互作用小；毒性低；与血浆蛋白质的相互作用小；以及能形成“刷子”或“环状”结构，该结构从阻止蛋白质结合的大结构向外延伸。
在本发明造影剂中大结构可以是单一结构，例如微粒、聚螯合剂或分枝状聚合体的(dendrimeric)聚合物，或者，它可以包含大量由理化作用连接在一起的组分，例如脂质体或分子聚集体。
在本发明造影剂中至少对于金属螯合物部分来说，其主要的生物消除途径优选为肾脏，因此，当大结构最终通过RES吸收时，优选通过可生物降解的键来结合螯合物，该键断裂时释放可通过肾脏排泄的片段，例如，分子量少于20KD，优选少于10KD，尤其200-5000D的片段。当大结构为颗粒或脂质体时，这一点尤其重要。
本发明造影剂中的的大结构通常选择下列四种类型的一种：颗粒；脂质体；分子聚集体；或高分子量分子(例如聚螯合剂，如在wo-90/12050中所述的那些)。
其中，优选后三种并且尤其优选后两种，因为它们促进肾脏排泄螯合物部分的倾向比促进RES摄入螯合物部分的倾向大。
考虑到分子聚集体能延长血池滞留时间及进行肾排泄(由于聚集体的消耗引起聚集体组分的逐渐损失而低于肾的过滤阈值)，因此它们尤其令人感兴趣。通常，用式II两亲分子组分可产生该结构。
C-D-E (II)
其中C为亲水的、含金属螯合物的部分，D为调理抑制剂连接体，E为疏水性部分。
如在本发明其它物质中一样，在式II中，金属螯合部分优选含巨大环状螯合剂，如WO-93/06868中所述。当然，也可以使用其它螯合剂部分，并且尤其在与MR造影剂有关的科学和专利文献中，描述了很多这样的部分。读者尤其可参改Schering，Nycomed Salutar，Nycomed Imaging，Bracco，Mallinckrodt，Guerbet和Squibb公开的专利申请。如GB9407812.8中特别优选的巨大环状的和无环的螯合剂部分。
聚集体组分中的调理抑制的连接体优选为上述物质，例如聚亚烷基醇，尤其为PEG，或氨基葡聚糖。疏水部分优选包含一种烷基或芳基基团或者一种类固醇、维生素、卟啉或酞菁。
一种特别优选的分子聚集体是以酞菁和轭合在其上的调理抑制剂基团为基础的，并且视情况例如可通过这些抑制剂基团、顺磁或重金属螯合物基团而聚集。其中，酞菁部分既可作为疏水部分又可作为金属螯合部分。
然而，其它两亲分子也可用于形成该聚集体并且通常具有式C-D-E或C1-E-D-B，其中C1是直接或通过连接体部分结合到疏水基E上的金属螯合物基团，C，B，D和E如上所述。C1可以为亲水性或疏水性的并且可以是如式II中关于C所讨论的一般的螯合剂部分。在这两种结构中，前者将螯合物部分放在聚集体的周围，它是T1 MR造影剂优选的结构。
通常，该抑制剂将构成聚集体组分重量的15-85％尤其为30-80％，并且本发明分子聚集体中各个分子组分的总分子量要小于15KD，尤其是200-10000D，更尤其为500-5000D。使用该种聚集体保证聚集体在血管系统中消耗，而失掉容易通过肾脏排泄的碎片，尽管该聚集体作为一个整体在血池中的滞留时间长。对于大多数普通的ECF剂来说，优选肾排泄作为最快的生物消除途径，因为它与体内滞留的重金属有关的毒性问题最小。
在本发明脂质体造影剂中，金属螯合物可游离在脂质体中间的腔中或者它可以通过脂质体膜携带，而在后一情况下，它可以沉积在脂质体内或外膜。就T1 MR造影剂而言，为了使顺磁中心与周围体液的相互作用最大，优选将螯合物沉积在脂质体的外膜上。然而，对于脂质体造影剂来说，优选的是螯合物在脂质体外膜。并通过可生物降解的键连接到脂质体上。
通过在脂质体表面上携带螯合物，使用特别小的例如直径为50-100nm的脂质体也是可能的，并因此延缓RES的摄取。
就脂质体巨大结构而言，当然，调理抑制剂应该连接到脂质体外部。
脂质体造影剂的制备已是公知的技术和常规的方法，并且常规的脂质体膜形成的物质可用于制备本发明造影剂。因此，例如，形成两亲性脂质体膜的物质如脂类，尤其是磷脂可用于形成基本的脂质体结构，该结构的作用是作为螯合物和调理抑制部分的载体。
通常，脂质体制剂除包括携带的螯合物分子和形成脂质膜的化合物外，通常在每种情况下还包括在水性介质中的、构成脂质体核心的物质。
脂质体本身为球形小泡，在中心空间周围具有双层脂质体。本发明尤其涉及单层或多层脂质体，它们在含水核心周围分别具有单脂质双层和多脂质双层。
脂质体在脂类，尤其是磷脂在水性介质中分散时自发地形成并且可通过常规技术生产本发明造影剂的脂质体结构。这种常规技术参见WO92/21017(Unger)and by Papahadjopolous in Ann.Rep.Med.Chem.14：250-260(1979)，它包括反向蒸发、冰冻-解冻、去污剂透析(detergent dialysis)、均化作用、声处理、微乳化作用和无水脂质水合时的自发成膜等技术。按照本发明，可使用多层脂质体或者通过已知的方法，可将多层脂质体转化为层数少的脂质体或单层脂质体。也可以直接制备单层脂质体。
脂质体制剂的大小一般是不均匀的，可通过已知的技术，例如挤压、冰冻-解冻、机械破碎、均化和声处理作用，将本发明所使用的脂质体大小控制到需要的直径。本发明所使用的脂质体是有效直径为20-400nm的单层或多层脂质体。
可以将脂质体冻干以便延长适用期，并且通过在使用前与水性缓冲剂一起剧烈振摇。可重构冻干的脂质体。制剂中可包括在冷冻干燥方法中用来使脂质体物质稳定的试剂。
小于200nm的脂质体可在配制后，通过0.2μm的滤器过滤来灭菌而除掉致热原。
用作形成脂质体膜分子的脂质一般为磷脂如天然或合成的磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酯甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酸(PA)、脂肪酸、神经节苷脂、葡糖脂、糖脂、甘油一、二或三酯、神经酰胺或脑苷脂。例如在WO92/21017中所描述的形成脂质体的化合物。
形成膜的脂质也可以包括可聚合的脂质，例如异丁烯酸脂质、硫醇和二硫化物脂质，二烯酸脂质，苯乙烯基脂质和二乙酰鞣酸脂质(diacetylamic lipids)如Johnston在Liposome Technology Vol.I，Gregoriades Ecl，Page 123-129(1983)和Singh在Phospholipid Handbook，Cevc Ed，Dekker，Pages 233-291(1993)及其参考文献中所述。在配制脂质体中使用可聚合的脂质提供了一条增加脂质体稳定性的途径。
例如，脂质体膜中也可以混入类固醇或其它化合物来影响脂质体的生物分布。适宜的类固醇包括胆固醇、胆固醇衍生物、胆甾烷，胆酸和胆汁酸，但优选胆固醇。
含类固醇可以改变脂质体膜的流动性，并且影响生物分布。因此，转变温度高的脂类使血中半衰期更长，并且含有胆固醇能产生更坚韧和渗透性小的双层。加入胆固醇，还可使RES摄取减少。
调理抑制剂的并入方法可通过使用一种具有调理抑制功能侧基的磷脂衍生物，或通过使用一种具有与脂质体膜相连的疏水性“锚定”(“anchor”)部分的抑制剂，或通过将调理抑制剂偶联到脂质体膜中所含的“锚定”分子，例如形成脂质体膜的分子上。
尤其优选的调理抑制剂包括这样的一些化合物(特别是两亲聚合物)，即它们能减少体内蛋白质与脂质体的结合并因此延长脂质体在血中的半衰期。聚亚烷基氧基聚合物，如聚乙二醇(PEG)和神经节苷脂(如Gm)对此有效。
混合1-10％相对于形成脂质体膜物质重量的PEG-PE衍生物会明显延长血中半衰期。
由全氟化磷脂质制备的脂质体(见Santaella，FEBS Letters 336：481-484(1993)和Angew.Chem.Int.Ed.Eng.30：576-568(1991))也可以延长血中半衰期。
通过将脂类与由抗原、凝集素或肽引起的肿瘤具有特异性的单克隆抗体或抗体片段结合，可以获得对特定器官或组织的靶向性。
脂质体的生物分布也明显依赖于表面电荷，因此本发明脂质体按要求可包括1-10％相对于脂质体膜形成物质重量的负电荷磷脂质，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和磷脂酰肌醇。
可用几种方法将螯合的金属结合到脂质体上，例如：
(i)将已结合到预先制备的脂质体表面上的螯合剂基团进行金属取代的方法；
(ii)将螯合物部分偶联到预先制备的脂质体中锚分子上的方法。
(iii)使用包括螯合物-锚分子的脂质混合物来形成脂质体的方法。
三种方法都代表本发明的几个方面，但第二种是最优选的。这种方法由于省去了疏水性螯合物的合成和纯化(方法(iii)隐含的)以及由于避免了方法(i)中金属与脂质体的较弱结合(在体内容易逆转)，从而简化了制备膜结合剂的过程。
本发明脂质体的制备方法优选的是将金属螯合物分子偶联到预先制备的脂质体中的锚分子上。按照该方法，螯合物只结合到脂质体膜的外部。用衍生的螯合物制备的脂质体具有附着到膜内和膜外两种脂质体的混合物。膜的水渗透性或大量水通过膜的扩散速率将决定内部顺磁离子的松驰性(relaxivity)。牢固、稳定的脂质体，其中钆的松驰性很低。因此，对于只结合到脂质体外部的螯合物基团，金属的使用效率是最佳的，即脂质体的每个金属离子都具有高度松驰性。
含有只结合到脂质体外部的螯合物对于结合放射性核素，尤其是α-发射体，是有利的，因为脂质体膜不会被α射线穿透。
因此，脂质体可按照常规方法由磷脂混合物来制备，所述磷脂混合物包含锚化合物，即含有结合到反应官能团上的疏水锚部分的化合物，所述官能团提供螯合物部分的结合点。然后可通过已知方法，将脂质体大小控制到需要的直径。将反应官能团偶联到螯合物上可配位的官能团上并且通过凝胶渗透色谱法、透析法或超声滤过法等，可以很容易地除掉未反应的低分子量螯合物。
按常规，锚化合物含量相当于形成脂质膜化合物总重量的10-80％，优选10-50％，尤其优选25-50％。事实上，螯合物直接偶联到向外的反应基团上的偶联效率可以相当高，例如大约90％。
在锚化合物上的反应基可简单地为脂质体膜脂类上的伯胺，它可以与螯合物分子上非配位的羧基反应。通常，将螯合物偶联到大分子如蛋白质上的最熟悉方法可用于螯合物与脂质体的结合。然而，脂质体的稳定性限制表面化学反应，因此，需要监测反应混合物的PH和渗透性。下面用图解说明偶联方法的几个实施例：
将螯合物偶联到脂质体中锚基团上的另一方式，可以在脂质体形成前，将锚基团偶联到螯合物上。在水溶液中，将螯合剂用金属处理，然后通过常规方法，用混合溶剂将螯合物偶联到锚分子上。再用包含螯合物：锚分子的脂类混合物来制备脂质体。该方法避免了当螯合物就在脂质体表面金属化时会出现金属离子与脂质体的非特异性结合的困难，也避免了在脂质体制备前将水不溶性螯合物进行金属取代与此有关的溶解性问题。该金属离子也可以在脂质体制备期间。作为保护基来保护有活性的螯合剂基团。
在已制成的脂质体中的螯合物，通过亲脂部分(锚)例如长的烷基链或芳基，结合到膜表面上，优选通过可生物降解键，例如酯、氨基甲酸酯、双酯、二硫键或亚磷酸酯结合。
因此，对于膜限制的螯合物部分，可使用式III化合物
G-C″ III
(其中G为亲脂基，例如，长链如(C10-20)的烷基或芳基(例如苯基或5-7元杂芳基)，C″为金属化的环状螯合剂基团(例如携带羧基的环状的聚氮杂链烷基或其衍生物)，并且G-C″链优选为生物降解键如酯、氨基甲酸酯、双酯或二硫键)。通常，G代表一个磷脂基通过可以或不可以生物降解的连接体连接到C″上。
双酯键，即式-O-CO-O-CH2-O-CO-O-键特别适宜作为生物降解键，其中可省略一个或两个终端氧并且亚甲基可被取代。
每个脂质体优选携带10-50摩尔％螯合的金属离子(相对于形成脂质体膜的分子)并且该携带的量可通过适当地选择螯合物和膜形成物质的相对浓度以及脂质体的大小来选择。
上述讨论集中在脂质体上，其中螯合物结合到该脂质体表面。如果需要，在脂质体内部可以携带另外的螯合物部分，如常见的水溶性的低分子量螯合物(例如GdDTPA和GdDTPA-BMA)。
通常，调理抑制剂可以为以上讨论的任何一种，并且可以是亲脂部分，通常为上述疏水末端基团，这样使得它能够限定到膜表面上。每个脂质体优选有这样限定的携带1-10摩尔％(相当于脂质体膜形成分子)的调理抑制剂，通常相当于膜形成物质的3-30重量％。
上述第三种形式的大结构包括作为骨架结构的巨大分子如低聚的、多聚的或分枝状聚合的聚螯合剂，如WO-91/05792、WO-90/12050、WO-93/06868和GB9407812.8中所述，这些公开的内容引入本文供参考。在该实施方案中，巨分子骨架既携带了大量螯合物部分，又携带大量调理抑制剂部分。
WO-93/06868中所描述的分枝状聚合的聚螯合剂作为骨架结构是特别优选的，尤其是总分子量为2,000-20,000D的那些。在制备该聚螯合剂中，将螯合剂部分装载到聚合物骨架的许多结合位点上。然而，用于本发明的至少3个这样的结合位点，优选该位点的2-50％通常都载有调理抑制剂部分。
可以使用上述讨论的螯合物和调理抑制剂，前者优选通过生物降解键结合。该生物降解键可以在螯合剂-大结构的界面，或者也可以在聚合物结构内，以便释放带有分子量低于肾阈的片段的螯合物。为了产生大分子-螯合剂和大分子-抑制剂的轭合，大分子、螯合剂和抑制剂需要衍生适宜的结合位点，这可以通过常规方法进行，例如通过用氨基甲酸酯激活单甲氧基-PEG得到硝苯基-氨基甲酸酯-PEG甲氧基，或通过在MR领域中关于聚螯合剂制剂例如WO-90/12050或GB9407812.8所描述的任一方法。
本发明最后一类试剂叫做微粒。这类粒子包括沸石，如WO-93/08846中所述，它是一种化学的/物理的笼形结构，携带着螯合的诊断用金属物质，然而由于通常该结构最后由RES系统摄入，所以血管系统给药效果较差，结果可能使螯合金属的生物滞留时间更长。尽管如此，这些微粒螯合物载体仍然可共轭到调理抑制剂上，如上所述而成为本发明造影剂。此情况下其中微粒大小(直径)优选为20-1000nm，尤其50-500nm，装载量优选为顺磁金属重量的2-20％。
通常，在本发明造影剂每个大结构上至少应该结合3个调理抑制剂部分，有一最佳装载量，超过它，调理抑制作用减小，通常抑制剂部分总计不超过该结构总量的50％。
另一方面，本发明也提供制备本发明造影剂的方法，所述方法包括：(i)将结合有大量调理抑制剂部分和螯合剂基团的一种大结构进行金属取代；或(ii)将大量调理抑制剂部分结合到携带有螯合离子的顺磁或重金属部分的大结构上；或(iii)由包含调理抑制剂部分和螯合离子的顺磁或金属部分的大量分子组分产生一种大结构。
通常，如果本发明造影剂包含聚螯合剂分子，那么可以通过在骨架聚合物与任一调理抑制剂如PEG共轭之前，将螯合剂部分与骨架聚合物分子共轭来合成这些造影剂。在将聚螯合剂与抑制剂共轭前或后，可以加入金属离子，形成聚螯合剂的金属复合物。优选的是在聚螯合剂与抑制剂共轭之前加该金属离子。然而，对于某些金属离子来说，如放射核素，由于半衰期短，优选在共轭后，刚要使用前进行金属取代。
通常，可使用已知的方法将螯合剂与骨架分子连接。见WO-90/12050。该方法包括如Krejcarek等的混合酸酐方法(Biochemical andBiophysical Research Communications 77：581(1977))，Hnatowich等的环状酸酐法(见Science 220：613(1983)and else where)，Meares等的骨架衍生方法(见Anal.Biochem 142：68(1984))和由Manabe等在Biochemica et Biophysica Acta883：460-467(1986)中所描述的对环状酸酐法的修改，利用该方法将DTPA基结合到聚-L-赖氨酸骨架上的方法。而对于优选的大环状螯合剂(如DOTA)而言，Krejcarek和Nnatowich所描述的常规混合酸酐和环状酸酐共轭技术是无效的，现已发现，通过在无水溶媒中，让聚羧酸大环状螯合剂与强度足以吸收全部羧基质子(即Pka足够高)的胺碱反应来改变混合酸酐法，产生的胺盐能与卤代甲酸烷基酸反应来制备一种活性酸酐，它能与骨架聚胺共轭而不引起与现有技术中双官能聚螯合剂有关的无用交联。就大多数大环状螯合剂而言，四甲基胍碱基，或类似强度的胺碱基将是优选的碱基。
当然，可以使用更复杂的共轭技术，例如包括在与Meares等(上述)方法类似的方法中，使用大环状螯合剂骨架，但成本增加和整个生产的复杂性使这方法并不吸引人。类似地，根据螯合剂上的有效反应基，可通过卤代乙酰卤、光气或硫光气，将螯合剂结合到骨架聚合物上。
因为螯合剂(例如大环状螯合剂)带有羧化物，包括但不限于DOTA，TETA，TRITA(1.4，7，10-四氮杂环十三碳烷四乙酸)和NOTA，其中一种羧化物可形成能够与骨架聚合物中伯胺基反应的实体。由羧化物基团形成反应实体的方法包括改进的混合酸酐法，例如用氯甲酸异丁基酯(IBCF)进行改进的方法，或用碳化二亚胺(DCC或EDAC，cf.Pierce Catalog(1988)，Pages252和253)形成“活性酯”的方法。两种方法结果都产生一种由螯合剂部分通过稳定的酰胺键多取代的骨架聚合物。但是，改进的混合酸酐法是优选方法，用于将有大环螯合剂的羧化物连接到骨架聚合物。
改进的混合酸酐反应是在无水溶剂中进行，该溶剂优选其熔点低于5℃，反应冷却至不低于5℃或在其冰点之上不超过55℃。该螯合剂在相应溶剂中的溶解性一般受用胺碱制备该螯合剂胺盐的影响。
由相关羧化物的Pka来决定碱的选择。就大多数螯合剂而言，四甲基胍(TMG)是特别优选的碱。通常，碱容易从那些Pka值超过螯合剂最高Pka值至少0.5，优选0.8，尤其优选至少1.0的碱中来选择。Pka至少为11，尤其至少为11.3，特别至少为12的胺碱是特别优选的并且除TMG外，特别提到还有呱啶、奎宁环和N-乙基呱啶，尤其是DBU(1，8-二氮杂二环[5、4、0]十-碳-7-烯和DBN(1.5-二氮杂二环[4、3、0]）壬-5-烯)。Martell和Smith在“Critical Stabilitg Constants”Vol.5第一次补编，PlenumPress，NY1982中列出了其它一些碱。
在搅拌下，加入适量纯(冷的)卤代甲酸烷基酯并且通过冷却，例如如果需要加入冷却剂，来保持溶剂最初的温度。加氯甲酸异丁酯是特别优选的。所产生的螯合活性酸酐可与含胺的分枝状聚合体反应形成增大的聚螯合剂。就大多数应用而言，此时将增大的聚螯剂金属化并且通过色谱法或结晶法纯化，除掉过量的金属离子和低分子量的金属复合物。如果与靶特异性分子一起使用，将增大的螯合剂，或者至少是其部分金属化的并至少仍含有一个游离胺的形式结合到靶分子上，例如通过与很多公知的杂双官能偶联剂中的一种进行反应。通常，就在该步骤，可载上调理抑制剂。如果前面的金属化法不适宜，例如半衰期短的放射核素，可使用不含金属的聚螯合剂和上述偶联剂制备抑制剂-聚螯合剂轭合物，然后金属化(参见下文)并最后通过色谱法或过滤快速简单地纯化。
也可以通过未与金属配位的非配位伯胺基或远端羧基，将螯合剂连接到骨架聚合物上。具有非配位伯胺基的大环螯合剂包括伯胺侧链衍生的DOTA大环、伯胺衍生的DO3A、和伯胺衍生的六氮杂的冢状化合物(Sepulchrates)和棺状化合物(Sarcophagines)，及多种衍生的冠醚穴状化合物。如果用螯合剂上(或者事实上，在任何其它活性部分上)的羧基来键合，那么可使用常规的羧基活化化学方法来结合到例如骨架上的胺官能团，或共轭到骨架上的连接基上。
在这些螯合剂上的非配位伯胺基可以与卤代乙酰卤在已知条件下反应形成卤代乙酰胺。该卤代乙酰胺可与骨架聚合物上的伯胺反应，形成螯合剂和聚合物之间稳定的酰胺键。De Riemer等在J.Labelled Compd.Radiopham18：1517(1981)中所描述的卤代乙酰卤方法可用于将含胺的螯合剂连接到骨架聚合物上。
螯合剂上的胺基也可以与光气或硫光气反应，产生活性异氰酸酯基，或与硫光气反应产生活性异硫氰酸酯基。这些基团可以与骨架聚合物上的伯胺反应，在配位体和骨架聚合物之间分别形成稳定的脲或更稳定的硫脲键。Gansow在Inorg.Chimica Acta 91：213(1984)和Moi等在J.AmerChem.Soc.110：6266(1988)中描述了通过分别用光气或硫光气形成异氰酯或异硫氰酯部分由此而将螯合剂连接到具有胺基的蛋白质上的方法。也见Desreux，Inorg.Chem.19：1319(1980)；Bryden等，Anal Chem53：1418(1981)；Delgardo等，Talanta29：815(1982)；Cacheris等，Inorg.Chem26：958(1987)；Moi等，Inorg.Chem26：3458(1987)和Meares等，Acc.Chem.Res17：202(1984)。
通过下列反应流程式说明将螯合剂部分偶联到骨架聚合物上的其它方法。
对于以胺为末端的分枝状聚合体聚合物，该物质NH2…聚合物代表全级(例如G2.0)的分枝状聚合体。
在聚合物与螯合剂(或抑制剂)部分的连接中，低聚氨基酸(例如低聚赖氨酸)链的介入位置，特别理想的应当是能用于控制所连接的该部分在体内水解释放(见“The Application of Drug Polmyer Conjugates in Chemotherapy”byHoes and Feijen in“Drug Carrier Systems”Roerlink et al Eds.J Wiley，1989)。
选择本发明血池剂中螯合的金属离子使它们能在诊断上起作用。这些作用包括但不限制于在MRI、δ闪烁照像、或CT扫描、或X-线中增强成像。
通过螯合作用可并入的金属离子包括镧系元素和其它金属离子，包括同位素及其放射性同位素，如Mg，Ca，Sc，Ti，B，In，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，Sr，Y，Sr，Tc，Ru，In，Hf，W，Re，Os，Rb和Bi。上述中一些特别优选的放射性同位素包括153Sm，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，89S，88Y，90Y，99mTc，97Ru，103Ru，111In，186Re，188Re，203Pb，211Bi，212Bi，213Bi，和214Bi。根据所需要的诊断应用来选择螯合的金属离子。
如上所述，本发明造影剂的螯合复合物中所含金属离子的选择，依赖于应用该造影剂的诊断技术。就MRI和MRS而言，金属离子应该为顺磁的，并优选非放射性的。就X-线和超声成像而言，应该使用重金属离子，例如原子序数至少为37，优选至少为50的金属离子，也优选非放射活性的这些金属离子。就闪烁照像而言，金属离子当然应该为放射性同位素。就MRD、X-线、EIT或磁成像而言，可以使用螯合基团去结合重金属族(例如多氧阴离子和全部或部分硫的类似物)或结合氧化铁或其它超顺磁多原子金属离子。
就本发明亲脂性的大结构而言，优选在脂质体形成前并入金属。
对于沸石大结构，优选在轭合调理抑制剂之前并入金属。如WO-93/08846中所述，孔口技术或表面脱铝技术(dealuminatior)也是优选的。
将金属离子与螯合剂和聚螯合剂进行配合的方法属于本领域技术水平。通过三种一般方法中的一种：直接结合，模板合成和/或金属转移作用，可以将所使用的每种金属结合至螯合剂部分。直接结合是优选的。
就直接金属化而言，将金属从亚化学计量水平滴定至完全结合，因此没有必要做渗析和昂贵的色谱法纯化，该方法避免了大量损失及稀释作用。也抑制了金属离子的非特异性结合。然而，本发明应用半衰期短的放射性核素可要求金属化作用作为最后步骤，然后通过简单快速的纯化(例如凝胶过滤)除掉过量的未结合放射性核素。
按照下列常规方法，可将金属离子Fe(III)、Cr(III)、Mn(II)、Hg(II)、Pb(II)、Bi(III)和镧系元素直接结合到聚氨基聚羧酸酯中。通常，将水溶性金属的无机酸盐溶解在适宜体积的蒸馏去离子水中。溶液的PH低于7。在室温搅拌下，将含有等摩尔量的螯合剂的水溶液加到该金属溶液中。通过加入碱，典型地为0.1mNaOH，缓慢地升高混合物的PH，直至螯合剂的供体基团达到脱质子化的程度。通常，在PH5-9范围，这依赖于这些螯合剂部分的情况。尤其注意镧系离子，要保持PH低于8以免金属氢氧化物沉淀。如下面引入的参考文献所述，通常，金属向DOTA大环螯合剂部分的结合是一个缓慢的过程。下列参考文献中包含该方法的具体例子。
Choppin等在J.Inorg.Nucl.Chem.，33：127(1971)，Margerum在Rec.Chem.PRog.24：237(1973)和Dolieslager等在J.Inorg.Nucl.Chem.，35：4255(1973)中描述了将镧系元素直接结合到聚氨基聚羧酸酯中的方法。Margerstudt在Mag.Res.Med，3：808(1986)和WO-A-87/06227中描述了将Gd(III)结合入DOTA。Kumar等在J.Chem.Soc.Chem.commun，31：145(1989)中描述了制备Bi和Pb与DOTA的复合物的方法。上述这些参考文献全部引入本文供参考。
按照公知的方法，可直接结合Hf，Zr，W，Hg和Ta。例如见美国专利号4,176,173(Winchell)。
当需要将金属离子还原到更适宜的氧化状态以便于结合螯合剂部分的供体原子时，要用金属转移的方法。例如，为了结合99mTc或186/188Re，必须通过使用还原剂如SnCl2或半胱氨酸，按照公知的方法将金属离子还原为Tc(v)或Re(v)。该方法要求形成中间体复合物。典型的实施例是在与螯合剂如DOTA配位之前，在较弱的配位体如葡庚糖酸盐存在下，用Sn还原99mTc。这些方法在放射性药学领域中是公知的。67Cu利用四胺螯合剂如tet A和tetB(见Bhardaredj等JACS，108：1351(1986))来稳定Cu(II)以便与结合更强的螯合剂反应。
本发明的造影对病人用于成像的给药量要足以在用某种具体成像技术的情况下产生理想的对比。一般来说，为了获得足够的对比增强效果，每公斤病人体重用0.001-5.0毫摩尔螯合成像金属离子的剂量。就大多数MRI应用而言，优选的成像金属离子的剂量在0.001-1.2，例如0.01-0.5毫摩尔/kg体重范围内。而就X-线应用而言，一般0.5-1.5毫摩尔/kg的剂量可以有效地获得X-线衰减。就大多数X-线应用而言，优选的剂量为0.8-1.2毫摩尔镧系元素或重金属/kg体重。
就X-线应用而言，为了扩大本发明造影剂获得最佳效果的光子能量范围，可以同时使用两种或多种不同的螯合金属。
有很多方法可用于将聚乙二醇或单甲基聚乙二醇结合到聚胺或其它大结构上。例如，可通过惰性共价键或通过可生物降解的结合方法(例如氨基甲酸酯)。在下列参考文献中可找到该种结合的方法：
Harris，Rev.Macromol.Chem.Phys.C25(3)：325(1985)，and Delgado，Critical Rev.Brug Carrier Sys.9(3，4)：249(1992)。该方法的具体流程例举如下：
构成载有调理抑制剂的化合物的一般方法：
H2N-R为大结构上的氨基(此大结构可以是一种组分或者一种基团，例如可以通过与脂质体膜结合或与颗粒的表面基团反应而轭合到该大结构上的一种基团)，它可以有或没有已连接的活性部分(例如金属螯合物)。MePEGX是分子量500-10,000的以甲氧基为终端的PEG。
用PEG连接体化学的可能途径：
应该知道，很多适用于制备本发明聚合物组分的活化PEG化合物是可以通过商业渠道购得的，例如购于Shearwater。
1、氰尿酰氯途径：偶联条件＝PH9，与硫醇反应，可与单衍生物发生二聚作用，UV发色团。
反应：
(例如见Anal Biochem.165：114(1987)和J.Biol.Chem 252：3582(1977))。
2、在PEG和放大物(magnifier)之间形成酰胺键的途径：大结构或大结构组分不与硫醇反应，可能用琥珀酸衍生物进行酯水解。
反应：
(例如见Appl.Biochem.Biotechnol 11：141(1985)和Cancer Biochem Biophys7：175(1984))。
3、在PEG和大结构或大结构组分之间的氨基甲酸酯键：反应时间长，偶联条件＝PH8.5-9.2，明显的水解，活化的PEG可贮存。
反应：
(例如见Klin Paediatr 200：184(1988)和Anul Biochem131：25(1983))。
4、与磺酰氯结合：温和条件(PH7.5，室温)，快速反应
反应：
(例如见Biotechnol Appl Biochem 12：119(1990))。
5、胺键：非常稳定的键：
反应：
(例如见J.Macromol Sci，Rev.Poly.Chem.Phys，C25：325(1985)和J.PolymerSci 22：341(1984))。
A)从PEG开始反应 B)从DO3A开始反应*
*使用少于化学计算量的螯合物(＜Y当量)留出空位点来结合几个PEG部分。
在上述流程式中，D代表第n级分枝状聚合体，已进行了反应。将螯合剂和调理抑制剂部分装载于上面。通常n较低，例如不超过5。
因此，本发明进一步的目的是提供包含本发明造影剂和至少一种生理可耐受载体或赋形剂的诊断用造影剂组合物。
可以用常规药用或兽医用佐剂，例如乳化剂，脂肪酸的酯，凝胶剂，稳定剂，抗氧剂，渗透性调节剂，缓冲剂(例如盐酸缓血酸胺)防腐剂，抗微生物剂，PH调节剂，加入(例如0.01-10摩尔％)的螯合剂(例如DTPA或DTPA双酰胺)，或钙螯合物的复合物(例如钙DTPA或CaNaDTPA-双酰胺)，或加入或不加入(例如1-50摩尔％)钙或钠盐(例如氯化钙，抗坏血酸钙，葡萄糖酸钙或乳酸钙)等，来制备本发明造影剂并且可制成适于非肠道给药，例如直接在生理可耐受载体介质中分散后注射或输注的剂量形式。因此本发明的造影剂组合物可以是传统的给药剂型，例如粉剂、溶液、混悬液、分散液等；但一般优选的是在生理上可接受的载体(如注射用水)中的溶液、混悬液和分散液。
因此，利用生理适宜的载体或赋形剂，本发明组合物可配制成以本领域技术范围内方式给药的剂型。例如，可将造影剂加或不加药用的赋形剂悬浮或溶解在水性介质中，然后将得到的溶液或悬浮液灭菌。
本发明非肠道给药组合物，例如静脉溶液，应该是灭菌的并且不含生理不耐受的试剂，并且应该具有低渗透性以便在给药时减小刺激或其它不良作用。适宜的载体包括通常在非肠道给药溶液中所使用的水性载体，其中所述非肠道给药溶液如氯化钠注射液，林格注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖氯化钠注射液，乳酸林格注射液和其它如在Remington’s Pharmacecctical Sciences，15th ed，Easton：Mack Publishing Co、PP1405-1412和1461-1487(1975)和The National Formulary XIV 14th ed Washington：American PharmaceuticalAssociation(1975)中所述的溶液。
本发明再一方面是本发明造影剂在生产诊断用组合物中的应用。
本发明另一方面提供产生人或非人动物体尤其是哺乳动物体图像的方法，该方法包括在所述动物体的全身血管系统内，给予图像增强量的本发明造影剂或其盐并随后至少在所述动物体的部分部位产生图像，例如MR，x-线，超声，EIT或闪烁照像图像。
通过下列特定但非限定实施例，进一步说明本发明。除非特别说明，温度为摄氏度，浓度为重量百分数。
实施例1
从LaJolla Blu ZZ(LJBII)中纯化的提取物
a、合成
(i)磺酰化作用：将硅酞菁(5000mg)溶解在发烟硫酸(15ml)中并加热至75℃1小时。将反应混合物倾注到冰上。收集产品，用1M HCl洗涤，并溶解在1m NaOH(20ml)中。过滤除掉未溶解的杂质并用1MHCl中和滤液。分离产品并真空干燥。
(ii)聚乙二醇化作用：通过用SOCl2(32ml，在室温下)氯化来修饰上述一种磺酸盐。在80℃，将该混合物加热3小时并冷却。将大约4ml的该混合物滴加到冰上并过滤，然后真空干燥。将PEG-乙醇胺(Avanti，averagePEG＝2000；也参见H2N-PEG-OH.Huang et al.Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，23：795(1985))溶解在10ml二氯甲烷中并加到在二异丙基乙基胺(0.5ml)中的上述固体中。搅拌20小时后，将溶液部分蒸发并加入2ml甲苯。将混合物干燥并如下所述精制。
b、粗品的精制
通过在水中的膜滤器(MWCO＝10KD)首先过滤粗品LJBII：将残液蒸发并再溶解到二氯甲烷中，然后用在二氯甲烷中2.5％-50％的甲醇梯度，从硅胶柱上洗脱。收集主峰并通过HPLC分析(95.5％纯品，PKB-100柱，MeOH/H2O，HOAC(0.48％)比率为62.5/0.5/37，PH7.1，1.2ml/min)。元素分析N/S比＝9.75-10.5，它表明为单硫酸盐，单氨基聚乙二醇化的硅酞菁。在2187.5-2980.4的质谱(M+Na)+与31-49个单位的环氧乙烷链相符，证明了预测的结构。
c、凝聚作用
在大于0.15mg/ml(在水中)的浓度下，精制的LJBII不能通过MWCO为30KD的膜滤器，但可通过0.2μm的滤器。这表明其结构恰好大于单位单位(MW＝2500)的结构。
d、生物分布
用静脉给药后的成年雄性Swiss Webster鼠来测定精制La Jolla Blue II的生物分布和排泄。将化合物以0.05mmol/kg的剂量给予3组指定的24只鼠。在给药后预先选定的时间(组1-组8分别在3，9，15，30和60分钟，4和24小时和7天)将动物处死。从组6，7和8的动物中收集尿和粪样。将样品去掉血液和腹膜液体并切掉主要器官(肝，脾，肾，心脏，肺，大脑和胆囊)，称重并在洗涤剂(0.01％ Tween20)中均化。用荧光计或通过紫外-可见吸收分分光光度计来测定等分试样的这些半溶解悬浮液中硅酚菁的含量。通过在理想状态下，由未处理动物制备的各组织标准曲线来测定化合物的浓度。
血的给药量在给药后3分钟时平均为15.7％±2.43(S.D.)，在给药后4小时平均为12.64％±3.39，在给药后24小时平均为2.79％±0.14，在给药后7天时小于1％(0.05％±0.00)。肝的给药量在给药后3分钟时平均为2.41％±0.82并且在该研究的7天期间不明显改变。肺和肾的量分别平均为1.09％±0.20(在给药后60分钟)和1.37％±0.11(在给药后3分钟)，但在给药后15分钟时减少到大约1％或更小。在尿中累计回收的La Jolla Blue II在2小时平均为45.52％±4.92(n＝8)并且在24小时时为大约为76％(n＝6)。7天后，在尿中回收到所给La Jolla Blue II的78.01％±10.10(n＝3)，少于粪便中量的1％。
精制La Jolla Blue II显示，其生物分布和排泄方式更符合血池剂而不是细胞外液剂的生物分布和排泄方式。因为这些化合物可通过荧光屏监测多到7天，这表明，化合物的环状结构在体内没有明显的代谢。
实施例2
两性Gd-DO3A复合物：
制备GdAE-DO3A为基础的两亲剂：
(1)1，4，7三-甲丁氧基羰基甲基-10-甲氧基羰基甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。
(1a)：将1，4，7-三-四丁氧基羰基甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷氢溴酸盐(25.0g，42mmol)在乙腈中混或浆并用TMG(70ML)处理。将溴乙酸甲酯(6.5g，42mmol)一次加入并将混合物回流3小时。在室温下再搅拌18小时后，通过旋转蒸发除掉溶剂和过量的TMG。将残渣溶解在CHCl3中，用水洗涤并干燥(Na2SO4)。蒸发溶剂得到标题产物的苍色油(23g，95％)。
1H NMR(CDCl3)：1.4(s，27H)，2.8(s，16H)，3.2(s，6H)，3.4(s，2H)，3.6(s，3H)
(b)1，4，7-三-四丁氧基羰基甲氧基-10-(N-(2-氨基乙基)酰胺基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷
(1b)将1a的甲酯23.0g，40mmol)溶解在甲醇(500ml)中并用乙二胺(200ml)处理。在室温下，将混合物搅拌3天。通过旋转蒸发除掉溶剂和过量的乙二胺，用水洗涤并干燥(Na2SO4)蒸发掉溶剂得到标题产物的粘性油(18g，75％)。
1H NMR(CDCl3)：1.4(s，27H)，2.5-3.0(m，20H)，3.3(m，8H)，6.0(br s，1H)。
c)1、4、7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰胺基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(1c或AE-DO3A)：通过在室温下，与纯TFA(200ml)反应3小时，将(1b)的甲酯(10.0g，16mmol)脱保护。除掉TFA后，将残渣溶解1MNaOH中并装到离子交换柱上([AG1×8(OH-)，200ml])。用水洗涤柱子并用1.5M HoAc洗脱产物。浓缩含标题化合物的馏分，得到7.0g(93％)的白色固体。
1H NMR(D2O)：2.9-3.6(br，mult)C18H34N6O7HOAc的分析计算值：C，47.14；H，8.11；N，16.49。实测值：C，47.40；H，7.98；N，16.48
d)、1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰胺基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷钆(III)(1d)：将配位体(1c或AE-DO3A)(1g)溶解在水中并用HCl调节PH至5。在搅拌下，向溶液中加入1.0当量的Gd(乙酸盐)3。几小时后，将PH调节至6并将溶液加热到45℃几小时。取出等分试样量并通过二甲酚橙检验(阴性)来测定游离Gd3+。除掉水性溶液后分离固体。用沸乙醇，将该粗品物质研制并热过滤除掉盐。产率95％。
e)GdAE-DO3A-N-十八烷基
将由(1d)得到的复合物溶解在DMF中并用十八烷基溴(Aldrich，1.0当量)处理。在室温下搅拌24小时后，在减压下蒸发掉DMF。将残渣溶解在氯仿中并用水洗涤。将有机提取物干燥(Na2SO4)并蒸发，得到1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-十八烷基)-N-(2-氨基乙基)酰胺基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷钆(III)(1e)
f)GdAE-DO3A-N-十二烷基-N-PEG5000
将从(1e)得到的化合物溶解在氯仿中并用1.1当量的三乙胺和1.0当量的甲氧基-琥珀酰基-PEG5000(Shearwater Corp)处理。在室温下搅拌24小时后，用水洗涤反应混合物，干燥并通过旋转蒸发浓缩。将粗品从乙醇/异丙醇/水中重结晶。
实施例3
以胺核心的分枝状聚合物为基础的试剂
A)制备第4级分枝状聚合物
用Watson(WO-93/06868)中相同的方法得到第4级分枝状聚合物。将G4(0.56g)溶解在去离子H2O(20ml)中并在分液瓶中，将DO3A-bz-NCS(2.31g，20％过量如GB9407812.8中所述制备)溶解在H2O(80ml)中并用5N NaOH调节PH至8.5。在剧烈搅拌下，将后一种溶液加入到分枝状聚合物溶液中。在10分钟内加完。搅拌4天后，让溶液通过中级多孔玻璃滤器并通过旋转蒸发(热定形60)除掉挥发物。得到0.48g淡澄色固体并通过Centriprep C-10滤器过滤。从所需要的产物中，有效地分离出低分子量的杂质这一点由GPC来显示。用这种方法，将粗品混合物中的其余部分过滤，分离得到总量为2.1g的产物。1HNMR谱积分表明，每分枝状聚合物(Y＝30)平均装载大约30个螯合物，装载效率63％。通过13C NMR和CZE分析确定产物的特性。
(B)钇的结合：
将步骤A得到的产物(551mg)溶解在去离子H2O(11ml)中，同时将Gd(OAC)3、4H2O(0.90g)溶解在8ml H2O中。将分枝状聚合物溶液加到后者中，其中并非全部醋酸钆都溶解。再加水(10ml)并控制PH(5.O)。在室温下放置24小时后，将溶液加热到45℃ 3.5小时。用Centriprep C-10滤器将得到的溶液过滤，除掉大部分未反应的钆盐。将得到的溶液的PH升高至9，沉淀任何未反应的钆如Gd(OH)3并通过O.45μm的滤器过滤。二甲酚橙试验阴性，不含钆。通过超声波过滤除掉盐酸盐，并通过GPC监测。这样产生纯的产物(大约300mg)。
C)、聚乙二醇化作用
将步骤B得到的产物，G4(N[CS]N-bz-DO3A)30(160mg，5.3×10-5mol)和PEG-NPC(硝苯基氨基甲酸酯)5000(480mg9.6×10-5mol，Shearwater Chemical SPA)放到其中加入去离子水(分别为10ml)的分液瓶中。将轻度混浊的PEG溶液迅速加到G4(N(CS)N-bz-DO3A)30中并在室温下将得到的溶液(PH7.8)搅拌24小时。利用超声过滤(Contriprep C-10和C-30)将溶液纯化。TLC(MeOH/CHCL3，1∶1)显示，除掉PEG物质是有效的。通过常规分光镜法(NMR，IR，UV)和光散射(LALLS，PCS)来确定产物的特性。或者利用G-50 Sephadex色谱法来纯化产物。
实施例4
以分枝状聚合物为基础的试剂
(a)合成PG2(DO3A)10
将PG2(NH2)24(250mg，0.05mmol)(如GB9407812.8中所述来制备)溶解在H2O(15ml)中并注意PH(10.1)。在分液瓶中放入溶解在H2O(40ml)中的DO3A-bz-NCS(750mg，1.18mmol，23.6eq)。用1N NaOH将PH从2.1升至7.0。将PG2溶液迅速加入螯合物中并注意PH(8.0)。将轻度混浊的黄色溶液搅拌6小时，然后过滤(0.2μm)并将得到的澄清黄色溶液浓缩至30ml。然后，将浓缩物放到4个C-3装置中并超声过滤(3×60分钟)。合并残渣并除掉，得到标题产物的淡黄色固体(610mg)。
元素分析表明，含有某些未反应的螯合物。NMR和荧光胺分析表明，24个位点中有10个位点被修饰。
(b)合成PG2(Gd DO3A)10
将PG2(DO3A)10(560mg，0.333mmol)和Gd(OAC)3(410mg，1.22mmol)放在分液瓶中并各自溶解在H2O中(分别为20和10ml)。将Gd加到分枝状聚合物中并用1N NaOH将PH调至5.5。每2小时检测一次PH。搅拌后，将溶液浓缩并通过彻底的超声作用(C-3设备，7×40分钟)，将过量的Gd除掉。此时，二甲酚橙试验为阴性。分离得到标题产物的淡黄色固体(270mg)。小角激光散射(LALLS)和荧光光谱学测定螯合物的负荷数为10。下一步，将产物进行聚乙二醇化。
(c)合成PG2(GdDO3A)10(PEG2000)14
将PG2(GdDO3A)10(270mg，2.35×105mol)溶解在硼酸盐缓冲液中(PH8.7，80ml)。将该溶液迅速加入含固体PEG2000-NPC(0.89g，4.49×10-4mol，20eq)的分液瓶中。溶液立即变成亮黄色(含对-硝基苯酚。)搅拌18小时后，将溶液浓缩并经过Sephadex G-25柱以便除掉硝基苯酚及其盐。通过在硼酸缓冲液(PH9)中透析(Sigma 12KD管)，除掉过量的PEG。LALLS表明，含有与MW4000相对应的物种和MW为30KD的产物。
通过许多方法可确定产物的特性。LALLS表明，在装载10个或11个PEG分子时，MW为31KD。荧光光谱学表明，末端胺基全部装载，即结合了14个PEG分子。元素分析提示也装满PEG。鉴定分离得到的黄色固体(410mg)产物为PG2(Gd DO3A)10(PEG2000)14松弛性(水，20MHz)r1＝13.7mm-1s-1。
实施例5
G3(GdDO3A)10(PEG2000)9的放大
(a)制备G3(N[CS]N-bz-DO3A)10
将前面形成的方法用于始起物G3(400mg，7.97×10-5mol)(见GB9407812.8)和DO3A-bz-NCS(1.48g，2.3mmol)。分离得到产物为黄色固体(1.44g)。1HHMR积分显示，在24个末端胺位点装载10个螯合物。
(b)制备G3(N[CS]N-bz-DO3A)10
将常规合成方法用于G3(N[CS]N-bz-DO3A)10(1.33g和Gd(OAC)3 3H2O中。分离得到标题产物为淡黄色固体(760mg)。光散射和荧光表明，含有10个螯合物，符合前面的结果。下一步进行物质的平衡。
(c)制备放大的G3(Gd DO3A)10(PEG2000)
(i)开始时，用100mg G3(Gd DO3A)10和200mgPEG2000-NPC，在小聚合体上进行反应，用上述类似的方式处理产物，得到产物的灰白色固体(140mg)。
(ii)上述关于PG2(Gd DO3A)10(PEG2000)14的方法再次以下列量使用，G3(Gd DO3A)10(650mg)和PEG2000-NPC(2.1g)。分离得到产物为灰白色固体(750mg)并且用LALLS荧光、ICP(Gd)和水透析来确定其特性。所有的分析都与所设计的结构相符。通过末端胺的荧光分析鉴定，PGE装载数为13.8。松弛性(水，20MHz)r1＝13.7mM-1s-1。
实施例6
合成G3(Gd DO3A)10(PEG5000)x
如上所述，合并G3(Gd DO3A)10(100mg)和PEG5000-PC(0.615，ca15eq)。分离得到产物为灰白色固体(530mg)。荧光谱学表明，PEG占据剩下的14个胺位点的反应是高度有效的。TLC表明，含有未反应的游离PEG，同时LALLS表明，EPG已发生二聚，其分子量为10000。通过分析鉴定，PEG装载数为11.3，松弛性(水、20MHz)r1＝15.8mM-1s-1。
实施例7
1，4，7-三-四丁氧基羰基甲基-10-甲氧基羰基-甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。
将1，4，7-三-四丁氧基羰基甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷氢溴化物(25.0g，42mmol)混合于乙腈中并用TMG(70ml)处理。一次性加入溴乙酸甲酯(6.5g，42mmol)，并将混合物回流3小时。在室温下再搅拌18小时后，通过旋转蒸发除掉溶剂和过量的TMG。将残渣溶解在CHCL3中，用水洗涤，干燥(Na2SO4)蒸发掉溶剂，得到标题化合物为苍色油(23g，95％)。1HNMR(CDCl3)：1.4(s，27H)，2.8(s，16H)，3.2(s，6H)，3.4(s，2H)，3.6(s，3H)。
实施例8
1，4，7-三-四丁氧基羰基甲基-10-(N-(2-氨基乙基)-酰氨基甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷
将实施例7的甲酯(23.0g，40mmol)溶解在甲醇(500ml)中并用乙二胺(200ml)处理。在室温下将混合物搅拌3天。通过旋转蒸发除掉溶剂和过量的乙二胺，并将残渣溶解在氯仿中，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。将溶剂蒸发掉，得到标题产物为粘性油(18g，75％)。1HNMR(CDCl3)：δ1.4(S，27H)，2.5-3.0(m，20H)，3.3(m，8H)，6.0(brs，1H)。
实施例9
1，4，7-三(羰基甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷[GdAE-DO3A]
通过在室温下，与纯TFA(200ml)反应3小时，将实施例8的酯(10.0g，16mmol)脱保护。除掉TFA后，将残渣溶解在1MNaOH中并装到离子交换柱[AG1×8(OH-)，200ml]上。用水洗涤柱子并用1.5M HOAC洗脱产物。将含标题化合物的馏分浓缩，得到7.0g(93％)白色固体。1HNMR(D2O)：δ2.9-3.6(br mult.)，分析计算C18H34N6O7HOAC：C，47.14；H，8.11；N，16.49。实测：C，47.00；H，7.98；N，16.48。
实施例10
1，4，7-三(羰基甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷钆(III)
将实施例9的化合物(1.0g，2.38mmol)溶解在水(37ml)中。通过加入1MNaOH将PH调至5。分次少量加入醋酸钆(III)，直至含有微过量的金属(通过二甲酚橙测定)。在加入过程中，将PH保持在5-6。在室温下，将反应混合物搅拌过夜。加入配位体(50mg)并连续搅拌直至获得阴性二甲酚橙试验。在真空下除掉水。将残渣在Sephadex G-10上色谱分析，除掉无机盐。通过MS(FAB)分析馏分：MH+＝602。
实施例11
1，4，7-三(羰基甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N-半琥珀酰胺
将在吡啶(20ml)中的实施例9化合物(6.1g，13.6mmol)加热直至溶解。加入琥珀酸酐(1.5g，15mmol)，并将混合物加热1小时。将溶液冷却并加入丙酮来沉淀产物。用丙酮彻底洗涤白色固体并真空干燥，得到5.0g标题产物(67％)。
实施例12
1，4，7-三(羰基甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N-半琥珀酰胺钆(III)
(A)将实施例11的化合物(1.9g，3mmol)溶解在水(30ml)中，用1N NaOH将PH调至5.0。滴加氯化钆(～1.4/10ml)的水溶液直至保持金属在微过量下几小时。再加入钆(50mg)，并将反应混合物搅拌，直至获得阴性的二甲酚橙试验。将水蒸发掉，并用乙醇将残渣洗涤几次。通过反相(C18)制备的HPLC，用2％甲醇/水作为流动相将标题产物纯化。
(B)通过另一方法也可制备标题化合物：在80℃下将在DMSO(80ml)中的实施例9的化合物(240mg，0.4mmol)加热直至溶解。加入琥珀酸酐(40mg，0.4mmol)并将混合物加热6小时。冷却至室温后，加入丙酮来沉淀标题产物。用丙酮洗涤白色粉末并真空干燥。MS(FAB)：MH+683.2，MNa+705.1。
实施例13
13-胆甾烯基-3，6，9，12-四氧杂-十二烷-1-醇
将胆甾醇甲苯磺酸酯(2.0g，3.7mmol)和三水缩四乙二醇(6.42ml，37mmol)溶解在二烷中(100ml)并在70℃下加热6小时。将溶剂蒸发掉，将残渣溶解在甲苯中并用水彻底洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩至油状物。通过色谱，在短的硅胶柱上，用0-20％甲醇/氯仿梯度洗脱，得到1.0g(49％)标题产物的苍色油。
实施例14
13-胆甾烯基-3，6，9，12-四氧杂-十二烷-1-酸
通过滴加Jones试剂直至微过量，将在丙酮(20ml)中实施例13化合物(0.5g)氧化。用异丙醇处理反应混合物并通过硅胶塞过滤。通过TLC和NMR将标题产物粗品纯化。
实施例15
GdDO3A-硬脂酸酰胺
将实施例9化合物(100mg，1.6mmol)在溶解在DMSO(10ml)中并用硬脂酰氯(51mg，1.6mmol)处理。在60℃下，将反应混合物加热2小时，并在室温下搅拌过夜。加入水(50ml)并将产物提取到氯仿中(3×100)将提取液干燥并浓缩，得到标题产物为白色固体。MS(FAB)868.5MH+
实施例16
GdAE-DO3A胆甾醇氨基甲酸酯
将实施例9化合物(300mg，0.8mmol)溶解在DMSO(20ml)中并用胆甾醇氯甲酸酯(225mg，0.5mmol)处理。在80℃下，将反应混合物加热5小时。将混合物保持在室温下，直至无色结晶析出。MS(FAB)：MH+1014.5，MNa+1036.5。
实施例17
LaDO3A-琥珀酰基-PE
将LaDO3A-琥珀酰胺(130mg，0.2mmol)溶解在DMSO(3ml)中。加入二环己基碳二酰亚胺(39mg，0.2mmol)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(22mg，0.2mmol)在室温下，将反应混合物搅拌1小时，加入在氯仿(20ml)中的PE(130mg，0.2mmol)。6小时后，将反应混合物过滤，用水洗涤，干燥并蒸发，得到标题产物。TLC(65 CHCL3/25MoOH/4H2O/1 甲酸)Rf＝0.2MS(FAB)：MH+1400.7，MHa+1422.7。
实施例18
GDAE-DO3A-戊二酰基-PE
用N-羟基琥珀酰亚胺(25mg，0.21mmol)和二环己基碳二酰亚胺(50mg，20.25mmol)处理在氯仿(5ml)中的蛋PE-戊二酰(100mg，0.11mmol)。在室温下，将反应混合物搅拌过夜并过滤除掉尿素。加入在甲醇(1ml)中的实施例10化合物(100mg，0.16mmol)和1ml三乙胺。在室温下，将反应搅拌6小时，并蒸发至干。将残渣溶解在氯仿中(10ml)并放到透析袋中。将反应在醋酸钠缓冲液(1L，50mM，PH5.5，12小时)，Tris缓冲液(1L，PH8，50mM，5小时)和去离子水(1L，5小时)中透析。通过加入甲醇，将在氯仿层中形成的少量沉淀溶解。将溶液干燥(Na2SO4)并蒸发，得到标题产物为白色蜡状固体(150mg，89％)。TLC(65CHCL3/25MeOH/4H2O/1 甲酸)Rf＝0.2，MS(FAB)：MNa+1459。
实施例19
在真空下，将蛋PC(52μmol)和蛋PE-戊二酰(48μmol)在氯仿中的混合物蒸发至薄膜。将脂质混合物溶解在乙醚中(3ml)并用23ml缓冲液(25mMMES，100mMNaCl)处理。通过声处理混合物，形成乳浊液。蒸发掉乙醚形成凝胶。通过涡旋使凝胶崩溃，并蒸发掉残余的溶剂。再加入1ml缓冲液并连续蒸发直到除掉全部溶剂痕迹。在室温和快速搅拌下，用GdAE-DO3A(140mg)和EDA(130mg)将脂质体处理过夜。通过将产物通过SephadexG-75柱(1×8in)除掉未反应的试剂。将脂质体通过两张100nm的膜压出三次。分析最终混合物，已知[Gd]＝1.14mM，[P]＝5.04mM。根据P/Gd比，已知衍生47.1％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝18±2(mMSec)1。
实施例20
将合成实施例19时所述的同一方法用于蛋PC(20μmol)和二油酰PE-琥珀(17μmol)。分析最终混合物，已知[Gd]＝0.56mM，[P]＝3.8mM根据P/Gd比，已知衍生30％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝18±2(mMSec)-1。
实施例21
用合成实施例19时所述的同一方法。用蛋PC(10μmol)和二油酰PE-十二烷酰(8μmol)。将脂质挤出(3×200nm，3×50nm)。分析最终混合物，已知[Gd]＝0.66mM，[P]＝3.49mM。根据P/Gd比，已知衍生43％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝17±2(mMSec)-1。
实施例22
将制备实施例19时所使用的同一方法用于蛋PC(56μmol)和蛋PE(53μmol)的混合物。在室温快速搅拌下，用EDAC(100mg)和GdAE-DO3A-琥珀酰亚胺(80mg)将脂质体处理过夜。除掉未反应的试剂后，将脂质体挤出(3×200nm，3×50nm)。分析最终混合物，已知[Gd]＝0.39mM，[P]＝5.87mM。根据P/Gd比，已知衍生14％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝27±2(mMsec)-1。
实施例23
按照制备实施例19时所使用的同一方法，由蛋PC(13μmol)和胆甾醇半琥珀酸酯(16μmol)制备脂质体。用EDAC(25mg)和GdAE-DO3A(25mg)处理脂质体。除掉未反应试剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×50nm)。分析最终产物，已知[Gd]＝0.26mM，[P]＝2.93mM。根据P/Gd比，已知衍生7.2％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝21±2(mMSec)-1。
实施例24
按照制备实施例19时所使用的同一方法，由蛋PC(80μmol)和6-(胆甾烯基)-7-氧杂庚-1-醇(80μmol)制备脂质体。用EDAC(70mg)和GdAE-DO3A(40mg)处理脂质体。除掉未反应试剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×50nm)。分析最终混合物，已知[Gd]＝0.39mM，[P]＝3.34mM。根据P/Gd比，已知衍生11％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝19±2(mMsec)-1。
实施例25
按照制备实施例19时所述的方法，由蛋PC(68μmol)，蛋PE-戊二酰(55μmol)和脑PS(6μmol)制备脂质体。用GdAE-DO3A(40mg)和EDAC(75mg)处理脂质体。除掉未反应剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×100nm)。分析最终混合物，已知[Gd]＝0.51mM，[P]＝4.15mM。根据P/Gd比，已知衍生29％的PE-戊二酰。松弛性(水，20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。
实施例26
按照合成实施例19时所述的方法，由胆甾醇半癸二酸酯(130μmol)和蛋PC(130μmol)制备脂质体。用GdAE-DO3A(120mg)和EDAC(120mg)处理脂质体。通过凝胶色谱法除掉未反应试剂并将脂质体挤出。
实施例27
将实施例16的化合物(71mg，6μmol)加到在氯仿中的二油酰PC(15mg，20μmol)中。在真空下除掉溶剂。将残渣溶解在乙醚(1ml)中。加入水(1ml)，并将混合物声处理直至形成乳浊液。在真空下缓慢蒸发掉乙醚。形成稠的凝胶。再加入水(1ml)并将凝胶涡旋搅拌直至凝胶崩溃形成泡。将产物挤出(3×200nm，3×50nm)。
实施例28
将实施例18的化合物(25mg，17.4μmol)和蛋PC(13.7，18μmol)溶解在氯仿(3ml)中。在真空下，将溶液蒸发至干。将残渣溶解在乙醚(3ml)中并过滤。加入MES缓冲液并将混合物声处理直至乳浊液形成。通过在真空下蒸发(偶尔涡旋搅拌)除掉乙醚。
实施例29
将实施例15的化合物(50μmol)和氢化蛋PC(150μmol)溶解在氯仿(10ml)和甲醇(2ml)的混合物中。在75℃下将溶剂蒸发。在MES缓冲液中，在75℃下，通过振摇，将残渣薄膜水合。在冻-熔4次后，在75℃下，将脂质体挤出(3×100nm)。
实施例30
药代动力学
在开始研究前几天，将导管插入鼠的颈静脉冲。在注射样品前采血样300μL并放到含肝素的配衡管中。在0时注射试验化合物。经24小时的时间间隔采血样(300μl)。在第7天，将动物处死，除掉肝，脾和肾。用硝酸和过氧化氢来消化血样和器官样并通过ICP来分析钆的浓度(μg/g)。
实施例产物 器官滞留7天后
剂量 t1/2 肝 脾 肾
μg Gd/ 分 ％ ％ ％
Kg
19 831 98 9.9 1.3 0.7
19 1190 111 7.4 0.6 0.6
25 1764 69 24.0 11.8 0.5
26 1310 58 34.8 8.9 0.8
实施例31
生物分布
用153Gd标记(2-氨基乙基)-DO3A，如实施例13，将螯合物偶联成1∶1蛋PC/蛋戊二酰脂质体(100nm)。将放射性标记的脂质体注射到鼠的尾静脉中。每个时间点使用3只鼠。在第1天，第2天，第3天时，计数血，肝，脾，肾和皮肤样。计算在各器官中保留的注射剂量的百分数并如下列出。肝脏消除半衰期为3.2天。
器官滞留 (％注射剂量)
1day 3day 7day
血 0.60 0.54 0.51
肝 18.22 9.91 4.88
脾 0.86 0.79 0.69
肾 1.03 0.74 0.64
皮肤 1.68 1.19 0.80