因此，本发明的第一方面提供了一种制备含有亲水物质在疏水溶剂中
的单相疏水制剂的方法，此方法包括：
(i)使亲水物质与两亲物在液体介质中结合，在液体介质中，两亲物和
亲水物质之间无化学反应；
(ii)除去液体介质，留下两亲分子亲水基团前端朝向亲水物质定向的
排列；和
(iii)在亲水物质/两亲物排列的周围提供疏水溶剂；
其中下述化合物：
(a)一至少具有一定程度极性的低分子量化合物；和/或
(b)一类脂溶性有机酸；和/或
(c)一两亲物；和/或
(d)甘油或其它多羟基醇；
在一个或几个上述(i)-(iii)步骤中加入。
本发明的另一方面提供了一种制备含有亲水物质在疏水溶剂中的单相
疏水制剂的方法，此方法包括：
(i)使亲水物质与含磷酰基胆碱的两亲物在液体介质中结合，在液体介
质中，两亲物和亲水物质之间无化学反应；
(ii)除去液体介质，留下两亲物亲水基团前端朝向亲水物质定向的排
列；和
(iii)在亲水物质/两亲物排列的周围提供疏水溶剂；
其中下述化合物：
(a)一至少具有一定程度极性的低分子量化合物；和/或
(b)一类脂溶性有机酸；和/或
(c)一不同于上述使用的两亲物；和/或
(d)甘油或其它多羟基醇；
在一个或几个上述(i)-(iii)步骤中加入。
优选地，上述两方面中描述的(a)是至少具有一定程度极性的中性类脂
溶性低分子量化合物。
使用这里描述的这类化合物使得亲水物质增溶于其一般不溶的疏水溶
剂中形成单相物质变得很容易。这在所使用疏水溶剂是一种或几种长链甘
油三酸酯时特别有利。但是，在疏水溶剂不是长链甘油三酸酯的情况下，
使用这类化合物也能很容易地形成单相制剂，并可以，例如减少制备这种
单相制剂所需的时间。
优选地，
(a)可以是低分子量化合物如羧酸，氨基酸苄基醇，乙醇，叔丁醇，异
丙醇或甘油单油酸酯；
(b)可以是羧酸，苯酚，对甲酚，苯基硼酸，苄基硼酸，苯基磺酸，苯
基砷酸，苯甲酸，水杨酸，乙酸，山梨酸，valearic acid，油酸和己酸；
和
(c)可选自胆固醇半丁二酸酯(Chems)，α-生育酚，α-生育酚丁二酸
酯(αTS)，磷脂酸(PA)，磷脂酰基甘油，磷脂酰基肌醇和磷脂的任何lyso
衍生物。
在本发明中“亲水物质”是指任何一般溶于含水溶剂而不溶于疏水溶
剂的物质。
在一优选实施方案中增溶助剂在步骤(i)中加入和/或疏水溶剂在步
骤(iii)中加入。
所用化合物的浓度在0.1-75％制剂总重的范围内，优选在0.5-10％范围
内，特别优选在1-5％范围内。
在本发明说明书中的“化学相互作用”是指涉及如共价键、离子键或
氢键的相互作用。不包括范德华力(van der Waals force)或其它这一数量
级别的相互作用。
优选将选自两亲物或多羟基醇的化合物在步骤(i)加入。
按照本发明较大范围的大分子可被适合地增溶。一般地，大分子化合
物是亲水的或至少具有亲水部分，因为，在使疏水大分子溶于油溶液时一
般几乎没有困难。合适的大分子的例子包括蛋白质和糖蛋白，低聚和多聚
核酸，例如DNA和RNA，多糖和它们中的任何在某些情况下包括全细胞，
细胞器或病毒(其全部或部分)的超分子组合。联合增溶小分子如与大分子
结合的维生素，特别是多糖如环糊精也是很方便的。小分子如维生素B12
也可与大分子化学结合并包括在组合物中。
按照本发明的方法可成功地被增溶的优选的蛋白质的例子包括胰岛
素，降钙素，血红蛋白，细胞色素C，山葵过氧化物酶，抑肽酶，蘑菇酪
氨酸酶，红细胞生成素，促生长素，生长激素，生长激素释放因子，
galanin，尿激酶，因子IX，组织纤溶酶原活化剂，过氧化物歧化酶，过
氧化氢酶，过氧化物酶，铁蛋白，干扰素，因子VIII，黑素和它们的片断
(所用上述蛋白可从合适的来源得到)。其它可使用的大分子是FITC标记
的葡聚糖和Torulla酵母提取的RNA。
除了大分子，本发明的方法还可用于增溶小的有机分子。小有机分子
的例子包括葡萄糖，抗坏血酸，羧基二氢荧光素和许多药物制剂，例如抗
癌剂，但是，当然此方法还可用于其它小有机分子，例如其它维生素或药
物或生物化学试剂。另外，分子如氯化钙和磷酸钠也可用本发明的方法增
溶。事实上，本发明对药物和生物活性试剂特别有利，因为使用非水溶液
可使分子进入体内的路径改变，例如增加生物可利用率。
可包括在本发明疏水组合物中另一类物质是无机物如无机小分子或胶
体物质，例如胶体金属。本发明的方法可使胶体金属如胶体金，钯，铂，
铑的一些性质即使在疏水溶剂中还保持，而在一般情况下颗粒将聚集。这
对在有机溶剂中进行的反应的催化特别有用。
可用于本发明的两亲物和两性离子的两亲物很多如磷脂是其中最合适
的。具有磷脂酰基胆碱基团前端的磷脂已被特别成功地应用，这类磷脂的
例子包括磷脂酰基胆碱(PC)本身，lyso-磷脂酰基胆碱(lyso-PC)，鞘髓磷
脂，它们的衍生物，例如十六烷基胆碱磷酸或含有磷酰胆碱的两亲聚合物
和卤代的两亲物，如氟化磷脂。在本发明中磷脂酰基胆碱(PC)和卵磷脂可
互换使用。合适的天然的卵磷脂可从任何方便的来源衍生得到，例如蛋，
特别是大豆。在多数情况下，优选化学性质与所选择疏水溶剂相似的两亲
物，这一点将在下面更详细地讨论。
本发明的发明者发现两性离子两亲物如磷脂特别适用于此方法的事实
再次证明本发明与Okahata等的方法明显不同。很明显，在前述文献中作
者指出阴离子或两性离子脂类在其方法中是完全不适用的，并指出使用
这些脂类获得所述复合物的产率为零。
疏水溶剂的选择要根据预制备组合物的目的，要增溶的物质的类型和
两亲物而定。合适的溶剂包括非极性油如矿物油，角鲨烷和角鲨烯，优选
长链脂肪酸和不饱和脂肪酸如油酸和亚油酸，醇，优选中链醇如辛醇和支
链长链醇如叶绿醇，异戊间二烯化合物如橙花醇和香叶醇，松油醇，甘油
单酯如甘油单油酸酯(GMO)，其它酯如乙酸乙酯，乙酸戊酯和乙酸冰片基
酯，甘油二酸酯和甘油三酸酯，优选中链甘油三酸酯和其混合物，上述包
括卤代油的任何卤代类似物，例如，长链氟碳或碘化甘油三酸酯，例如
lipidiol。
当疏水溶剂和两亲物适当地配合时一般得到最好的结果。例如，当溶
剂为例如油酸时，两亲物选择lyso-PC比PC更合适，而当疏水溶剂是甘油
三酸酯时则相反。
另外，在一些情况下还发现在疏水溶剂加入与亲水物质/两亲物排列接
触之前向疏水溶剂中加入一定量的两亲物是有利的。这样可确保两亲物分
子不会因为其与疏水溶剂的高亲和力而从亲水物质周围其位置被清除。
特别优选本发明的制剂是光学澄清的，这可通过在可见光波长测量混
浊度和，在某些情况下，经过一段时间后检查其沉降监视。
亲水/两亲物排列是指其中两亲物的亲水基团前端指向在前被制备的
亲水物质，但从没有暗示此类型的组合物可溶于亲水溶剂。
Kirby等在生物技术(Bio/Technology)，1984年11月，979-984和
脂质体技术(Liposome Technology)，I卷，19-27页，Gregoriadis，Ed.，
CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，USA描述了制备脂质体的方法，
其中将磷脂悬浮于蒸馏水形成小的一层囊或多层囊，与要引入的物质混合
并冷冻干燥。然后将混合物再水合得到脂质体。
在此现有技术公开时，脂质体的制备正得到世界范围的关注，但是制
备大分子的单相疏水制剂的想法好象既没有被考虑过也被认为没有可能或
无价值。当然，没有任何现有技术建议将中间体的排列应用于脂质体制备
以外的领域。即使单相疏水制剂是客观所希望，加入疏水溶剂而不是亲水
溶剂的观点没有引起足够的重视，因为，在本领域中存在对亲水分子的疏
水制剂的严重偏见。
可用多种方法使两亲物分子的取向为其亲水基团前端面对亲水物质部
分的排列，特别适合的方法的例子将在下面详细讨论。
在第一种方法中，与上述Kirby等描述的方法出发点相似，将亲水物
质与两亲物在亲水溶剂中的分散液混合，这样两亲物分子形成亲水基团前
端 向外朝着含有亲水物质的亲水相的组合。然后除去亲水溶剂剩下干的
组合物，其中两亲物的亲水基团前端取向对着亲水物质。
在Okahata等描述的方法中，将蛋白质溶液与两亲物在水中的分散液
混合。但是，很明显，此篇文章的作者相信必然得到沉淀，然后再溶于疏
水溶剂。由于本发明优选的两亲物不会形成沉淀，Okahata等的结论是它
们没什么用途。在本发明的方法中，不需沉淀，事实上，一般认为不希望
形成沉淀，因为它将减少所需产物的产率。
在此第一种方法中，尽管可使用其它极性溶剂，但优选的亲水溶剂是
水。
两亲物集合所成的形式可以是胶束，单层囊，优选一般理解为具有直
径约为25nm的小的单层囊，多层囊或管状结构，例如蜗状柱，六角相，立
方相或髓磷脂型结构。所采用的形式依赖于所用的两亲物，例如，两亲物
如磷脂酰基胆碱(PC)趋于形成小单层囊，而lyso-磷脂酰基胆碱趋于形成胶
束。但是，在所有这些结构中，两亲物分子的疏水尾端都向里指向结构的
中心，而亲水基团前端向外指向分散亲水物质的溶剂。
两亲物：亲水物质的重量比在1∶1到100∶1的范围内，优选2∶1到
20∶1，且对PC来说，最优选约8∶1，对lyso-PC来说，最优选4∶1。
此优选比例的上限是考虑到经济原因，优选使用尽可能少量的两亲
物。下限更苛刻一些，比例2∶1或更低只能用于亲水物质具有明显的疏水
部分或特别大的情况。
快速除去溶剂可得到好的结果，且方便的除去溶剂的方法是冷冻干
燥，尽管还可使用其它方法。
在一些情况下，在亲水溶液中包括盐是有利的，特别是当亲水物质是
大分子化合物如大分子蛋白时。但是，因为存在大量的无机盐会增加结晶
的形成，因此，在混浊的溶液中，优选使用有机盐而不是无机盐如氯化钠。
乙酸铵由于其易于通过冷冻干燥除去所以特别适用于此目的。
用于制备具有两亲物基团前端指向亲水物质部分排列的组合物的第二
种方法是在共同的溶剂中联合溶解(co-solubilise)亲水物质和两亲物，然
后除去溶剂。
本发明方法的产物是新的，因为它使得制备含有亲水物质的单相疏水
制剂成为可能，而亲水物质一般是不溶于疏水溶剂的。因此，本发明的另
一方面是提供一种使用本发明方法制备的含有亲水物质在疏水溶剂中的单
相疏水制剂。
在单相疏水制剂中除了亲水物质还可有其它组分。这在亲水物质是大
分子时特别有利，在这种情况下，制剂可包括如胆汁盐，维生素或其它与
大分子结合或与大分子有关的小分子。
尽管上述Kirby等公开了一些大分子/两亲物排列，但所公开的排列都
是用于制备脂质体的中间体，而且，如上所讨论，没有包括此类型实体的
现有技术关注非脂质体的或疏水组合物。因此，本发明的排列，其中两亲
物不形成小单层囊且因此不被期望形成脂质体的两亲物是新的。
本发明制剂的一个优点在于它们基本上是无水的，且对水解是稳定
的。它们对冻-融也是稳定的且在高温也具有很高的稳定性，大概是因为
蛋白质打开并变性时必须存在水。这表明它们可被认为具有比亲水物质含
水制剂更长的存放期。
本发明的溶液具有多用性，可有很多应用。它们可单独使用或与含水
相结合形成乳液或类似的两相组合物，这又构成本发明的另一方面。
在本发明的这方面，提供了两相组合物，它含有亲水相和疏水相，疏
水相含有按本发明所述方法制备的亲水物质在脂质溶剂中的制剂。
一般地，在此类型的组合物中，疏水相被分散于亲水相。
两相组合物可以是瞬时的或稳定的乳剂，依赖于其所需的目的。
乳液颗粒的平均大小依赖于疏水和含水相的确定性质。但，一般可在
2μm范围内。
可通过混合制备疏水制剂在含水相中的分散液，例如，可通过短时间
例如约10-60秒，一般约15秒的剧烈搅拌，或通过几小时温和的混合，
例如使用轨道震动器。
含有本发明疏水制剂的乳液还可用于制备微胶囊。如果乳液是从含明
胶的含水相形成的，可用已知方法使明胶凝聚从溶液中沉淀出来，并形成
包围在含亲水物质的疏水相液滴周围的一层膜。除去亲水相，留下微胶囊。
此技术是本领域已知的，但在结合使用本发明的制剂时被证明为特别有
效。
本发明的另一方面提供了：
(i)使用
(a)一至少具有一定程度极性的低分子量化合物；和/或
(b)一脂溶性有机酸；和/或
(c)一两亲物；和/或
(d)甘油或其它多羟基醇；
促进亲水物质在其一般不溶的疏水溶剂中的增溶；
(ii)化合物是；
(a)一至少具有一定程度极性的低分子量化合物；和/或
(b)一脂溶性有机酸；和/或
(c)一两亲物；和/或
(d)甘油或其它多羟基醇；
用于亲水物质在其一般不溶的疏水溶剂中的增溶；和
(iii)使用下列化合物；
(a)一至少具有一定程度极性的低分子量化合物；和/或
(b)一脂溶性有机酸；和/或
(c)一两亲物；和/或
(d)甘油或其它多羟基醇；
制备试剂，此试剂用于促进亲水物质在其一般不溶的疏水溶剂中的增溶。
本发明的组合物一方面用于使一般在常规条件下不溶于脂质溶剂的物
质对哺乳动物，包括人口服给药。这样可用于食品添加剂如维生素或生物
活性物质，特别是蛋白质或糖蛋白，包括胰岛素和生长激素的提供。
在其它的应用中，可装入胶囊或微胶囊，例如使用上述方法，使用营
养素如维生素不仅作为人食品添加剂，还可用于农业或水产业，后者的一
个例子是制备用于养殖幼虾的食物原料。
另外，此组合物可用于制备药物或其它用于胃肠外给药的剂型，以及
用于局部或opthalmic应用的制剂。为了此应用，一般优选使用如上描述
的油溶液和含水相的乳液。
许多治疗和预防处理中期望持久的或延迟释放或涉及两组分系统，例
如包括一立即释放组分和一延迟或持久释放组分。由于其高度稳定性，本
发明的制剂特别适用于要持久或延迟释放的大分子制剂。
本发明组合物的较长的存放期在药物领域具有特别的优越性。
油包亲水制剂可用于药学或类似工业中用于隐藏滋味。特别是在药物
领域中存在的问题，因为许多药物具有令人讨厌的味道所以在病人，特别
是儿童中不能广泛应用。
另一种应用是在化妆品工业，在这，又一次，亲水化合物的疏水制剂
可很容易地混合入化妆品制剂。可用于此途径的大分子的例子包括抗氧化
剂，具有湿润或某些酶功能的大分子。本发明还可用于使蛋白质如骨胶原
混入皮肤霜或洗液。
最后，本发明在化学和生物合成领域中也有很多应用，例如，非含水
酶合成工艺。
实施例1
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每个小孔中加入50μl。另外，大豆磷脂酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷却
下用探针声处理10分钟，制成浓度100mg/ml，向所有孔中都加入，每排
的四孔每个孔分别加入100，125，150和200μl。平缓地震动混合孔中
的物质，然后在-20℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的各种油加入每排孔中。该板平缓震动几小
时，并用plate-reader在550nm定时地测量光密度。低吸收度表明低水平
散射，并与蛋白质在油中的有效分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向Miglyol 818
或向日葵油中加入叔丁醇帮助抑肽酶分散的效果。其结果用光密度对冷冻
干燥除去叔丁醇后(在恒定的蛋白浓度)的磷脂酰基胆碱的浓度的函数关
系表示，结果列于表中，并显示于图1和2。
开始，使用100μl纯油，或200μl 50∶50体积∶体积的油和叔丁醇的混
合物进行分散。测量光密度后，将样品冷冻，并冷冻干燥除去叔丁醇。再
测量所得油的OD值。接下来的试验证明甘油三酸酯中的叔丁醇残余在冷冻
干燥后不大于7％wt∶wt。
OD@550nm 每孔中PC的mg
10 12.5 15 20
只有M 818 0.222 0.204 0.154 0.089
M 818+叔丁醇 0.19 0.082 0.024 0.021
只有向日葵油 0.157 0.197 0.222 0.215
向日葵油+叔丁醇 0.046 0.028 0.05 0.087
实施例2
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为10mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每个小孔中加入100μl。另外，大豆磷脂酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷
却下用探针声处理10分钟，制成浓度100mg/ml，向所有孔中都加入，每
排8个孔中都加入125μl。平缓地震动混合孔中的物质，然后在-20℃冷冻，
然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有不同浓度添加剂的向日葵油加入每排孔中。将板平缓震
动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水
平散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入甘油单油酸酯，油酸和乙酸帮助抑肽酶分散的效果。其结果用光密
度对添加剂浓度(在恒定的蛋白浓度)的函数关系表示，结果列于表中，
并显示于图3。
添加剂％wt∶wt
所使用的添加剂 0 0.15 0.3 0.55 1 1.33 2.5 5
GMO 1.129 0.477 0.226
OA 1.013 0.444 0.144
乙酸 1.088 0.588 0.586 0.304 0.229 0.113 0.069 0.068
实施例3
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排5个小孔中各加入12.5μl。另外，大豆磷脂酰基胆碱分散于蒸馏水中，
在冷却下用探针声处理10分钟，制成浓度100mg/ml，每排的孔中分别加
入0，25，50，75和100μl。平缓地震动混合孔中的物质，然后在-20
℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入乙酸，山梨酸和油酸(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。
其结果用光密度对磷脂酰基胆碱浓度(在恒定的蛋白浓度)的函数关系表
示，结果列于表中，并显示于图4。
每孔中PC的mg 只有油 +油酸 +乙酸 +山梨酸
2.5 0.124 0.052 0.02 0.025
5 0.087 0.036 -0.002 -0.009
7.5 0.1 0.073 0.04 0.005
10 0.259 0.236 0.004 0.008
实施例4
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排5个小孔中各加入0，12.5，16.6，25和50μl。另外，大豆磷脂酰基
胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，制成浓度
100mg/ml，每排的孔中分别加入100μl。平缓地震动混合孔中的物质，然
后在-20℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入苯酚，苯甲酸，己酸，valearic acid，乙酸和山梨酸(浓度为1％
wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的
磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图5。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.33 0.5 1
苯酚 0.017 0.041 0.046 0.053 0.163
苯甲酸 0.024 0.019 0.023 0.035 0.145
己酸 0.018 0.031 0.029 0.041 0.151
Valearic acid 0.02 0.016 0.019 0.039 0.132
乙酸 0.031 0.023 0.016 0.04 0.105
山梨酸 0.012 0.032 0.038 0.039 0.19
只有油 0.155 0.1845 0.169 0.1915 0.322
实施例5
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排6个小孔中各加入0，12.5，16.6，25，33和50μl。另外，大豆磷脂
酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，制成浓度
100mg/ml，每排的孔中分别加入100μl。平缓地震动混合孔中的物质，然
后在-20℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入valearic acid酸和三乙胺(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散
的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂酰基胆碱浓度)的函
数关系表示，结果列于表中，并显示于图6。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.33 0.5 0.66 1
只有油 0.166 0.176 0.193 0.261 0.28
戊酸 0.017 0.038 0.053 0.071 0.144
戊酸+TEA 0.021 0.023 0.045 0.062 0.134
TEA 0.254 0.152 0.206 0.24 0.381
实施例6
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排6个小孔中各加入0，12.5，16.6，25，33和50μl。另外，大豆磷脂
酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，制成浓度
100mg/ml，每排的孔中分别加入100μl。平缓地震动混合孔中的物质，然
后在-20℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入苄基硼酸，苯甲酸和水杨酸(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散
的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂酰基胆碱浓度)的函
数关系表示，结果列于表中，并显示于图7。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.33 0.5 0.66 1
苄基硼酸 0.007 0.015 0.024 0.046 0.087 0.188
苯甲酸 0.002 0.008 0.014 0.045 0.08 0.169
水杨酸 0.005 0.003 0.003 0.005 0.015 0.06
只有油 0.04 0.137 0.172 0.236 0.275 0.285
实施例7
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排5个小孔中各加入0，12.5，25，37.5和50μl。另外，大豆磷脂酰基
胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，制成浓度
100mg/ml，每排的孔中分别加入100μl。平缓地震动混合孔中的物质，然
后在-20℃冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向向日葵油
中加入苯甲酸，水杨酸，对甲酚，苯甲酰基醇，硝基苯和乙酸(浓度为1
％wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定
的磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图8。
抑肽酶(mg/孔)
助剂的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
无 0.044 0.101 0.111 0.165 0.244
苯甲酸 0.006 0.01 0.025 0.052 0.112
水杨酸 -0.004 0.005 0.007 0.028 0.095
对甲酚 -0.004 0.02 0.061 0.121 0.192
苄基醇 0.017 0.03 0.051 0.165 0.229
硝基苯 0.006 0.018 0.12 0.209 0.206
乙酸 0.037 0.036 0.0556 0.095 1.161
实施例8
将微孔板的孔中装入实施例7的抑肽酶和大豆磷脂酰基胆碱，并冷冻
干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl西蒙得木油加入每排孔中。将板平
缓震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明
低水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向西蒙得木
油中加入水杨酸(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。其结果用
光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表示，结果
列于表中，并显示于图9。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.5 0.75 1
西蒙得木油 0.249 0.539 0.798 0.744 0.629
西蒙得木油+水杨酸 0.017 0.021 0.047 0.09 0.216
实施例9
将微孔板的孔中装入实施例7的抑肽酶和大豆磷脂酰基胆碱，并冷冻
干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl角鲨烷加入每排孔中。将板平缓震
动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水
平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物，向角鲨烷中
加入己酸，苯甲酸和苯酚(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。
其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表
示，结果列于表中，并显示于图10。
抑肽酶(mg/孔)
助剂的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
无 0.735 0.495 1.004 1.014 1.32
己酸 0.059 0.024 0.022 0.03 0.11
苯酚 0.061 0.099 0.052 0.192 0.094
苯甲酸 0.198 0.054 0.069 0.034 0.085
乙醇 0.5 0.651 0.912 0.826 0.811
实施例10
将微孔板的孔中装入实施例7的抑肽酶和lyso-磷脂酰基胆碱，并冷冻
干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl叶绿醇或辛醇加入每排孔中。将板
平缓震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表
明低水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用lyso-磷脂酰基胆碱作为两亲物，向叶绿醇或
辛醇中加入水杨酸(浓度为1％wt∶vol)帮助抑肽酶分散的效果。其结果
用光密度对蛋白浓度(在恒定的lyso-磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表
示，结果列于表中，并显示于图11。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.5 0.75 1
叶绿醇 0.023 0.147 0.533 0.636 0.667
叶绿醇+水杨酸 0.011 0.009 0.005 0.003 0.179
辛醇 0.013 0.044 0.021 0.302 0.741
辛醇+水杨酸 0.042 0.014 0.014 0.009 0.024
实施例11
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分散于微孔板的小孔中，
每排6个小孔中各加入0，12.5，16.6，26，33和50μl。另外，大豆磷脂
酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，并加入山梨酸，
山梨酸是通过将固体山梨酸与1ml每等分中水相中分散的磷脂浓度分别为
1，0.5，0.25，0.125和0.0625％的溶液混合得到的山梨酸。100μl磷脂悬
浮液分别加入新的一排6孔中。平缓地震动混合孔中的物质，然后在-20℃
冷冻，然后冷冻干燥过夜。
第二天，将有或无添加剂的100μl向日葵油加入每排孔中。将板平缓
震动18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低
水平光散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用山梨酸加入不同浓度的磷脂酰基胆碱分散液
时，对帮助抑肽酶在向日葵油中分散的效果。其结果用光密度对蛋白和山
梨酸浓度(在恒定的磷脂酰基胆碱浓度)的函数关系表示，结果列于表中，
并显示于图12。
抑肽酶/山梨酸 0 0.0625 0.125 0.25 0.5 1
0.25 0.049 0.062 0.073 0.02 0.012 0.008
0.5 0.147 0.113 0.14 0.085 0.042 0.004
0.66 0.23 0.162 0.18 0.124 0.074 0.071
1 0.366 0.271 0.251 0.198 0.127 0.143
实施例12
按照实施例7描述的方法制备磷脂分散液，其中既可含有100mg大豆
磷脂酰基胆碱/ml蒸馏水，也可含有90mg磷脂酰基胆碱和10mg磷脂酸/ml
蒸馏水。向微孔板的孔中加入抑肽酶和上述实施例7描述的一种或另一种
的磷脂分散液，并冷冻干燥过夜。
第二天，将100μl Miglyol 818或油酸加入每排孔中。将板平缓震动
18小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水平光
散射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用含有磷脂酸的磷脂悬浮液帮助抑肽酶在
Miglyol 818或油酸中分散的效果。其结果用光密度对蛋白和山梨酸浓度(在
恒定的磷脂浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图13和14。
M 818
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.5 0.75 1
PC 0.014 0.014 0.036 0.073 0.238
PC/PA 0.028 0.037 0.041 0.045 0.059
油酸
抑肽酶(mg/孔) 0 0.25 0.5 0.75 1
PC 0.013 0.023 0.11 0.223 0.304
PC/PA 0.04 0.04 0.045 0.048 0.087
实施例13
按照实施例7描述的方法制备磷脂分散液，其中既可含有100mg大豆
磷脂酰基胆碱/ml蒸馏水，也可含有90mg磷脂酰基胆碱和10mg或是磷脂酸
或是胆固醇半丁二酸酯/ml蒸馏水。向微孔板的孔中加入抑肽酶和上述实施
例7描述的一种或另一种的磷脂分散液，并冷冻干燥过夜。
第二天，将100μl鱼肝油加入每排孔中。将板平缓震动8小时，并用
plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水平光散射，并与蛋
白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用含有磷脂酸或胆固醇半丁二酸酯的磷脂悬浮
液帮助抑肽酶在鱼肝油中分散的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒
定的磷脂浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图15。
抑肽酶浓度
油+/-PA的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
PC/鱼肝油 0.341 0.578 0.936 1.169 1.124
PC：PA/鱼肝油 0.119 0.339 0.198 0.174 0.756
实施例14
按照实施例7描述的方法制备磷脂分散液，其中既可含有100mg大豆
磷脂酰基胆碱/ml蒸馏水，也可含有90mg磷脂酰基胆碱和10mg或是磷脂酸
或是胆固醇半丁二酸酯/ml蒸馏水。向微孔板的孔中加入抑肽酶和上述实施
例7描述的一种或另一种的磷脂分散液，并冷冻干燥过夜。
第二天，将100μl角鲨烷或向日葵油加入每排孔中。将板平缓震动8
小时，并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水平光散
射，并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用含有磷脂酸或胆固醇半丁二酸酯的磷脂悬浮
液帮助抑肽酶在角鲨烷或向日葵油中分散的效果。其结果用光密度对蛋白
浓度(在恒定的磷脂浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图
16和17。
角鲨烷 抑肽酶浓度
助剂的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
只有PC 0.773 0.685 0.475 0.544 0.601
PC+Chems 0.086 0.093 0.085 0.071 0.095
PC+PA 0.074 0.033 0.032 0.032 0.051
向日葵油 抑肽酶浓度
助剂的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
只有PC 0.342 0.308 0.203 0.484 0.593
PC+Chems 0.241 0.261 0.172 0.3 0.412
PC+PA 0.168 0.336 0.079 0.065 0.088
实施例15
按照实施例7描述的方法制备磷脂分散液，其中既可含有100mg大豆
磷脂酰基胆碱/ml蒸馏水，也可含有90mg磷脂酰基胆碱和10mg磷脂酸/ml
蒸馏水。向微孔板的孔中加入抑肽酶和上述实施例7描述的一种或另一种
的磷脂分散液，并冷冻干燥过夜。
第二天，将100μl西蒙得木油加入每排孔中。将板平缓震动53小时，
并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水平光散射，并
与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用含有磷脂酸的磷脂悬浮液帮助抑肽酶在西蒙
得木油中分散的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂浓度)
的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图18。
西蒙得木油 抑肽酶浓度
助剂的性质 0 0.25 0.5 0.75 1
只有PC 0.439 0.435 0.623 0.546 0.112
PC+PA 0.154 0.16 0.08 0.073 0.087
实施例16
按照实施例7描述的方法制备磷脂分散液，其中既可含有100mg大豆
磷脂酰基胆碱/ml蒸馏水，也可含有90mg磷脂酰基胆碱和10mgα-生育酚
丁二酸酯/ml蒸馏水。向微孔板的孔中加入25μl抑肽酶溶液和上述实施例
7描述的一种或另一种的磷脂分散液，并冷冻干燥过夜。
第二天，将100μl Miglyol 818加入每排孔中。将板平缓震动18小时，
并用plate-reader在550nm测量光密度。低吸收度表明低水平光散射，并
与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定使用含有α-生育酚丁二酸酯的磷脂悬浮液帮助抑
肽酶在Miglyol 818中分散的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定
的磷脂浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图19。
抑肽酶(mg/孔) 0 0.5
只有PC 0.051 0.085
PC+α-生育酚丁二酸酯 0.036 0.037
实施例17
将抑肽酶溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml，并分别装入一组5个B2玻
璃管中(第I组)，分别装入0，125，250，375和500μl。另外，大
豆磷脂酰基胆碱分散于蒸馏水中，在冷却下用探针声处理10分钟，加入每
个管，浓度为100mg/ml，加入1ml。另一组管(第II组)，分别加入0，
62.5，125，187.5和250μl上述抑肽酶溶液和0.5ml大豆磷脂分散液
(100mg/ml)。平缓地震动混合孔中的物质，然后在液氮中冷冻，然后冷
冻干燥过夜。
第二天，将1ml Miglyol 818加入第I组的每个管中，且向第II组的
每个管中加入每ml含10mg水杨酸的Miglyol 818 0.5ml。所有管用氮气
冲洗，密封，并在室温用滚动混合器混合，直至第II组中油的分散(水杨
酸作为助剂)基本澄清(3小时)。将第I组中的油各400μl转移至新的
管中，新管中含有干燥的固体水杨酸4mg，将管密封，用氮气冲洗，用滚
动器连续混合。将管以此方式保存5天，并在中间从管中取出100μl样品，
分散于plate-reader在550nm测定光密度。低吸收度表明低水平光散射，
并与蛋白质在油中有效的分散相对应。
使用上述方法，测定在油和蛋白/磷脂复合物混合前或后加入水杨酸
(浓度为1％wt∶vol)，使用大豆磷脂酰基胆碱作为两亲物时，对帮
助抑肽酶增溶的效果。其结果用光密度对蛋白浓度(在恒定的磷脂酰基胆
碱浓度)的函数关系表示，结果列于表中，并显示于图20。
在室温保温5天后，在550nm的光密度
抑肽酶 无助剂 加入前油中有助剂 在油之后加入助剂
0 0 0 0
0.25 0.002 0 0
0.5 0.443 0.004 0.017
0.75 0.488 0.009 0.016
1 0.866 0.002 0.128
实施例18
制备大豆磷脂酰基胆碱(soy PC)的含水分散液，含有100mg/g的悬
浮液用氮气彻底冲洗，并用峰峰之间为8微米的振幅的声波处理。每等分
用声波处理的总时间为4分钟，其中每隔30秒在冰水浴中冷却30秒。所
得小单层囊(SUV)的乳白色分散液离心15分钟，除去钛颗粒。
将5mg从念珠菌cylindericae得到的脂酶溶于蒸馏水，制成浓度为
10mg/g，将50微升每等分(即，含有0.5mg脂酶)加入小玻璃试管中。向每
个试管加入100μl SUV(即10mg PC)，将其中物质混合，在液氮中壳冷
冻(shell-frozen)并冷冻干燥过夜。向每份冷冻干燥物中加入亚油酸
665mg，涡流混合，留1小时使其分散。向所得澄清悬浮液中加入335mg甘
油三亚油酸酯，并混合。需要指出的是，加入甘油三酸酯对分散液的澄清
度无副作用，而直接向冷冻干燥物中加入甘油三亚油酸酯一般得不到这样
的分散液。在37℃下保温一周后，分散液的澄清度无变化。因此，在亚油
酸存在下，使得蛋白质在长链甘油三酸酯中的增溶成为可能。
实施例19
将从白霉属mehii得到的脂酶溶液，含有8.9mg蛋白/ml，分为0.1ml
的等分(0.89mg蛋白)装入小玻璃管。向其中加入如实施例1制备的含
100mg PC/g的200mg SUV(即每管20mg PC)，将混合物冷冻干燥过夜。50
％的冷冻干燥物用665mg油酸分散，且剩余部分用等量的亚油酸分散。将
分散液静置3小时直到完全澄清，然后向油酸分散液中加入335mg甘油三
亚油酸酯，并向亚油酸分散液中加入等量的甘油三油酸酯。两种都保持澄
清，在37℃保温2周后仍如此。
实施例20
冷冻干燥制备如上，每份含有1mg抑肽酶(从100微升的1％溶液得
到)，20或30mg soyPC(分别从200或300μl SUV获得)用分别含0，10，
20和30％(w/w)油酸的向日葵油分散。所有含油酸的那些变为澄清或轻
微乳白，而无油酸的制剂还是混浊的悬浮液。同样地，冷冻干燥物与更饱
和的含10％(w/w)油酸的玉米油混合，形成轻微乳白的分散液，而与纯玉
米油混合，形成混浊的悬浮液。
实施例21
准备5层，每层4排小试管。向每排试管中，第1，2，3，4排中
分别加入含0.36，0.72，1.08和1.44mg抑肽酶的等分溶液(抑肽酶以含
水溶液的形式加入，含10mg蛋白/ml)。向每管中加入含100mg PC/ml的
SUV 180μl(即加入18mg PC)，按照实施例1的方法将试管中物质混合，
壳冷冻并冷冻干燥过夜。向每层的试管1，2，3，4和5层分别加入180mg
含5，3，2，1和0％油酸的向日葵油。将试管涡流混合，并使其分散
过夜。然后将分散液转移至微滴板，并在550nm读吸收值，结果列于表1。
表1：油酸对抑肽酶在向日葵油中的增溶效果
抑肽酶含量
(mg)
向日葵油中油酸的含量
(％)
5
3
2
1
0
0.36
0.029
0.018
0.023
0.022
0.469
0.72
0.052
0.054
0.048
0.06
0.128
1.08
0.017
0.017
0.099
0.176
0.208
1.44
0.182
0.182
0.162
0.104
0.286
实施例22
准备2排小试管。向第1排试管中加入0.2ml 0.25％的抗坏血酸溶液(即
0.5mg抗坏血酸)，向第2排试管中加入0.2ml 0.125％的溶液(即0.25mg
抗坏血酸)。向每个试管中加入含实施例1制备的soy PC SUV 60μl，将
其壳冷冻并冷冻干燥过夜。向每排试管第1，2，3和4个中分别加入300mg
含1，2，3和4％亚油酸的向日葵油。将试管稍微涡流混合后使其分散。
24小时后，测定分散液可见的澄清度，澄清度分为1-10个等级。10表
示完全澄清，而1表示表面上无增溶发生。结果列于表2。
表2：亚油酸对抗坏血酸在向日葵油中的增溶效果
抗坏血酸含量
(mg)
向日葵油中亚油酸含量
(％)
1
2
3
4
0.25
9+
10
10
10
0.5
7
8
10
10
实施例23
制备400mM甘油储备溶液，并依次稀释得到200，100，50和25mM
溶液。向6个小试管中分别加入200μl含18mg抑肽酶/ml的溶液，并从左
到右分别加入75μl蒸馏水，25，50，100和200mM甘油。然后向每个试
管中加入实施例1制备的soy PC SUV 300μl，并将混合物壳冷冻，冷冻干
燥过夜，并使用300mg Miglyol 818分散冷冻干燥物。涡流混合并放置过
夜后，将分散液转移至微滴板的孔中，并在550nm测量吸收度。结果列于
表3。
表3：甘油对抑肽酶在Miglyol 818中的增溶效果
所加甘油的浓度(mM)
0
25
50
100
200
400
吸收值(550nm)
0.152
0.073
0.052
0.037
0.05
0.361
实施例24
i)100mg卵清蛋白溶于5ml蒸馏水。
ii)20mg脯氨酸，丝氨酸，谷氨酸和酪氨酸分别溶于1ml蒸馏水中。
iii)按照前述实施例的方法，将磷脂分散于蒸馏水中，制成浓度为
250mg/ml。
iv)按上述步骤制备的溶液分散于下列2ml玻璃管中：
标号 0 1 2 3 mg/管
PC(1) 90 90 90 90 22.5
卵清蛋白(1) 100 100 100 100 2
氨基酸(1) 0 12.5 25 50 0-1
氨基酸(mg) 0 0.25 0.5 1.0 0-1
v)将上述管中的物质充分混合，在液氮中冷冻并冷冻干燥过夜。
vi)第二天，向每管中加入Miglyol M840 0.2ml并在室温(at RT)振摇。
vii)第三天，将50L样品转移至微孔板的孔中，在波长600nm测定光密度。
所得结果列于下表：
0 1 2 3
谷氨酸 0.31 0.197 0.194 0.224
脯氨酸 0.27 0.196 0.163 0.15
丝氨酸 0.287 0.171 0.147 0.131
酪氨酸 0.324 0.253 0.213 0.21
此结果显示于图21。
由此可见，在将蛋白混入油中时，向水相中加入氨基酸可明显减少最
终制剂的混浊度，表明因为氨基酸改善了增溶。