一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法.pdf

本发明涉及一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，该方法使用制备的无机纳米材料磷酸银加入头孢他啶中对大肠杆菌的抑菌性能进行增效,抑菌实验发现磷酸银对头孢他啶的抑菌性能有良好增效效果，显著降低头孢他啶的使用剂量，实现较低药物浓度下更好的抑菌效果。与现有技术相比，本发明技术方案利用纳米磷酸银对常规的杀菌药头孢他啶进行协同增效，有效的提高药物的疗效，并且对有力避免细菌对现有药物产生耐药性提供了一种全新的经验方法。在只加入少量无机纳米材料纳米磷酸银的情况下，保持甚至提高原有药物效果并降低原有药剂的使用剂量，这为发展新的抗菌剂提供了新的途径。

1.  一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，将纳米磷酸银加入市售头孢他啶中对头孢他啶的抑菌性能进行增效。

2.  根据权利要求1所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，所述的头孢他啶与纳米磷酸银质量比为1600:1-200:1。

3.  根据权利要求2所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，将纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中稀释，将头孢他啶粉末溶于无菌水中配成溶液，将纳米磷酸银颗粒溶液与头孢他啶溶液在超声反应器中均匀混合20分钟，得到纳米磷酸银和头孢他啶混合液。

4.  根据权利要求1所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，所述的纳米磷酸银由沉淀法制备而成，具体步骤为：将硝酸银缓慢滴加到磷酸氢二钠中，将得到的黄色沉淀经水洗、醇洗数次后，真空干燥，得到纳米磷酸银。

5.  根据权利要求4所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，所述的硝酸银与磷酸氢二钠的摩尔比为8:3。

6.  根据权利要求3所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，将纳米磷酸银和头孢他啶混合液对大肠杆菌进行抑菌协同增效。

7.  根据权利要求6所述的一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，其特征在于，对大肠杆菌进行抑菌协同增效的验证方法如下：
1)把大肠杆菌加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性；
2)将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU；
3)取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液中；
4)将混合后的溶液置于37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。

一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法
技术领域
本发明涉及一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
微生物耐药性已然成为全球性的关注焦点，多重耐药细菌的高患病率及广泛耐药甚至全耐药菌的出现严重影响了抗菌药物的治疗效果，导致由细菌感染引起的病死率逐年上升。人们长期以来一直依靠两种路径来提高药效，一种是开发新的更有力的抗菌药物，尽管大量资金和人力的投入，由于相应制剂技术的落后而面临阻碍，另一种是增加现有药物的使用剂量以弥补药效的下降，然而，这又会进一步导致细菌耐药性的诱发并且给患者带来经济、身体上的多重损失。
迄今为止，纳米材料作为新兴科技产物应用于协同抗菌素联合抑菌给上述困境带来了希望。有报道表明通过结合纳米颗粒可以减小抗菌药物的剂量，并且提高双方的杀菌性能，从而减小二者单独使用所带来的体内毒性。银系材料作为最常用的抗菌剂已被证实具有高效广谱杀菌活性和高安全性，此外，纳米磷酸银作为一种新型可见光催化剂不仅是金属型杀菌剂，更有光催化型杀菌剂，同时，纳米磷酸银本身可作为载体缓慢释放银离子起到长效杀菌的作用。
目前文献有以纳米金属材料如金、银、铁等或其氧化物对抗菌剂进行增效抑制微生物的研究，但是还没有盐类对抗菌剂协同抑菌的报道。
发明内容
本发明的目的在于从源头上克服因大剂量而导致的细菌耐药性，进而提出一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法。本发明通过纳米磷酸银与头孢他啶这种广谱抗菌素在不同浓度下共同作用于革兰氏阴性菌种代表大肠杆菌，在显著降低头孢他啶剂量的同时维持甚至提高其原有抑菌效果。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种纳米磷酸银对头孢他啶抑菌性能的增效方法，将纳米磷酸银加入市售头孢他啶中对头孢他啶的抑菌性能进行增效。
作为优选，所述的头孢他啶与纳米磷酸银质量比为1600:1-200:1。
作为进一步优选，将纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中稀释，将头孢他啶粉末溶于无菌水中配成溶液，将纳米磷酸银颗粒溶液与头孢他啶溶液在超声反应器中均匀混合20分钟，使得所述的头孢他啶与纳米磷酸银质量比为1600:1-200:1，得到纳米磷酸银和头孢他啶混合液。
本发明中，所述的纳米磷酸银由沉淀法制备而成，具体步骤为：将硝酸银缓慢滴加到磷酸氢二钠中，将得到的黄色沉淀经水洗、醇洗数次后，真空干燥，得到纳米磷酸银。所述的硝酸银与磷酸氢二钠的摩尔比为8:3。其中，硝酸银浓度为0.4mol/L，磷酸氢二钠浓度为0.15mol/L。
本发明中，将纳米磷酸银和头孢他啶混合液对大肠杆菌进行抑菌协同增效。
对大肠杆菌进行抑菌协同增效的验证方法如下：把大肠杆菌(ATCC25922)加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性。将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU。取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液中。将混合后的溶液置于37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。
与现有技术相比，本发明首次提出把半导体光催化剂纳米磷酸银应用于联合抗菌剂的领域中。
首先，使用常用广谱类第三代头孢抗生素头孢他啶作为抑菌协同对象。其次，采用简便的直接沉淀法制备纳米级磷酸银，不需要高温高压的苛刻条件，对实验设备和实验条件的要求低，很容易实现。另外，添加极少量纳米磷酸银于头孢他啶共同作用后即可实现降低后者浓度并保持或提高其药效。抑菌实验发现磷酸银对头孢他啶的抑菌性能有良好增效效果，显著降低头孢他啶的使用剂量，实现较低药物浓度下更好的抑菌效果。
本发明技术方案利用纳米磷酸银对常规的杀菌药头孢他啶进行协同增效，有效的提高药物的疗效，并且对有力避免细菌对现有药物产生耐药性提供了一种全新 的经验方法。在只加入少量无机纳米材料纳米磷酸银的情况下，保持甚至提高原有药物效果并降低原有药剂的使用剂量，这为发展新的抗菌剂提供了新的途径。
附图说明
图1为实施例1所制得纳米磷酸银颗粒的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图2为实施例1所制得纳米磷酸银颗粒的X射线粉末衍射(XRD)图谱。
图3为实施例2所用磷酸银，头孢他啶，磷酸银头孢他啶混合物的傅里叶红外(FTIR)图谱。
图4为实施例2、3、4、5中不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液抗菌实际效果图。
图5为实施例2、3、4、5中不同浓度的头孢他啶溶液、磷酸银溶液、以及头孢他啶和磷酸银混合溶液抗菌结果统计图。
图4与图5中：
a：对照组，
b-e：2、4、8、16g/L头孢他啶，
f：0.01g/L纳米磷酸银，
g-j：2g/L头孢他啶+0.01g/L纳米磷酸银、4g/L头孢他啶+0.01g/L纳米磷酸银、8g/L头孢他啶+0.01g/L纳米磷酸银、16g/L头孢他啶+0.01g/L纳米磷酸银。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例中参与反应体系中的所有原料均为市售或赠与。头孢他啶购于上海瑞楚生物科技有限公司(货号AB62561，CAS号72558-82-8)，纯度98％。硝酸银(AR，沪试，货号810012360,CAS号7761-88-8)，磷酸氢二钠(AR，沪试，货号20040617,CAS号7558-79-4)，配制LB培养基所用氯化钠(AR，沪试，货号10019318，CAS号7647-14-5)、胰蛋白胨(BR，沪试，货号69024138，CAS号91079-40-2)、琼脂粉(BR，沪试，货号10000561，CAS号9002-18-0)均购于国药集团化学试剂有限公司。酵母浸出粉(货号YSYL004，CAS号8013-01-2)购于郑州亚世生物有限公司，试验用去离子水为同济大学自制，稀释用无菌水为去离子水经高压灭菌 自制。大肠杆菌(ATCC25922)由上海市第十人民医院检验科提供，以上试剂或原料均未经纯化直接使用。
实施例1
采用沉淀法制备纳米磷酸银：将10ml 0.4mol/L硝酸银缓慢滴加到10ml 0.15mol/L磷酸氢二钠中，将得到的黄色沉淀水洗醇洗数次，60℃下真空干燥过夜，得到纳米磷酸银。
本实施例制得的纳米磷酸银颗粒的扫描电子显微镜(SEM)照片如图1所示，X射线粉末衍射(XRD)图谱如图2所示。
实施例2
第一步，将实施例1制备得到的纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中配成浓度为0.01g/L的溶液，超声作用20分钟使其充分分散，将购买的头孢他啶粉末溶于无菌水配成溶液，浓度分别为2、4、8、16g/L；将浓度为2g/L的头孢他啶与浓度为0.01g/L的纳米磷酸银混合，在超声下作用20分钟使其作用充分。
本实施例中所用磷酸银，头孢他啶，磷酸银头孢他啶混合物的傅里叶红外(FTIR)图谱如图3所示。
第二步，把大肠杆菌(ATCC25922)加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性。将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU。取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入0.01g/L的纳米磷酸银中，2、4、8、16g/L头孢他啶溶液，2g/L头孢他啶+0.01g/L的纳米磷酸银混合溶液中。将混合后的溶液放入37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。
不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液、以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液抗菌实际效果如图4、图5所示。
从图4和图5中可以看到头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液(两者质量比为200：1)取得了良好的相加抑菌效果(g，抑菌率达到了38％)，远超单独使用头孢他啶(b，抑菌率2％)时所达到的药效。
实施例3
第一步，将实施例1制备得到的纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中配成浓度为0.01g/L的溶液，超声作用20分钟使其充分分散，将购买的头孢他啶粉末溶于无 菌水配成溶液，浓度分别为2、4、8、16g/L；将浓度为4g/L的头孢他啶与浓度为0.01g/L的纳米磷酸银混合，在超声下作用20分钟使其作用充分。
第二步，把大肠杆菌(ATCC25922)加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性。将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU。取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入0.01g/L的纳米磷酸银，2、4、8、16g/L头孢他啶溶液，4g/L头孢他啶+0.01g/L的纳米磷酸银混合溶液中。将混合后的溶液放入37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。
不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液、以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液抗菌实际效果如图4、图5所示。
从图4和图5中可以看到头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液(两者质量比为400：1)取得了非常不错的协同抑菌效果(h，抑菌率达到了78％)，远超单独使用头孢他啶(c，抑菌率11％)和纳米磷酸银(f，抑菌率49％)时所达到的药效。
此实施例所达到的抑菌率最高，为最优选实施例。
实施例4
第一步，将实施例1制备得到的纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中配成浓度为0.01g/L的溶液，超声作用20分钟使其充分分散，将购买的头孢他啶粉末溶于无菌水配成溶液，浓度分别为2、4、8、16g/L；将浓度为8g/L的头孢他啶与浓度为0.01g/L的纳米磷酸银混合，在超声下作用20分钟使其作用充分。
第二步，把大肠杆菌(ATCC25922)加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性。将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU。取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入0.01g/L的纳米磷酸银，2、4、8、16g/L头孢他啶溶液，8g/L头孢他啶+0.01g/L的纳米磷酸银混合溶液中。将混合后的溶液放入37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。
不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液、以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液抗菌实际效果如图4、图5所示。
从图4和图5中可以看到头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液(两者质量比为800： 1)取得了良好的协同抑菌效果(i，抑菌率达到了52％)，远超单独使用头孢他啶(d，抑菌率11％)时所达到的药效。
实施例5
第一步，将实施例1制备得到的纳米磷酸银颗粒分散于无菌水中配成浓度为0.01g/L的溶液，超声作用20分钟使其充分分散，将购买的头孢他啶粉末溶于无菌水配成溶液，浓度分别为2、4、8、16g/L；将浓度为16g/L的头孢他啶与浓度为0.01g/L的纳米磷酸银混合，在超声下作用20分钟使其作用充分。
第二步，把大肠杆菌(ATCC25922)加入到配制好的LB液体培养基中，在37℃下过夜培养以使其恢复活性。将培养得到的大肠杆菌菌液用LB液体培养基进行稀释，使其浓度达到1×10²CFU。取1ml稀释后的大肠杆菌菌液加入0.01g/L的纳米磷酸银，2、4、8、16g/L头孢他啶溶液，16g/L头孢他啶+0.01g/L的纳米磷酸银混合溶液中。将混合后的溶液放入37℃恒温震荡池内作用30分钟，从每种溶液中取100μl均匀涂布在LB固体培养基平板上，在37℃下培养20小时，观察结果。
不同浓度的头孢他啶溶液、纳米磷酸银溶液、以及头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液抗菌实际效果如图4、图5所示。
从图4和图5中可以看到头孢他啶和纳米磷酸银混合溶液(两者质量比为1600：1)取得了较好的相加抑菌效果(j，抑菌率达到了69％)，超过单独使用头孢他啶(e，抑菌率40％)时所达到的药效。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。