一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用。其中所述制备方法包括以下步骤：(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于番茄汁培养基中震荡培养获得发酵液；(2)将步骤(1)所得发酵液离心取上清，超滤取低分子部分，冷冻干燥即得。目前细菌素提取物的制备都依赖于化学合成培养基，而运用番茄汁制备细菌素提取物的研究尚未报道过，本发明首次将番茄汁培养基作为一种天然的发酵培养基应用于细菌素提取物的制备，因而其产物具有更高的食品安全性。该类芽孢杆菌细菌素提取物的原料为番茄，其来源广、成本低，发酵菌种为类芽孢杆菌单一菌种，上述工艺有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。

1.  一种类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于番茄汁培养基中震荡培养获得发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液离心取上清，超滤取低分子部分，冷冻干燥即得。

2.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.8333。

3.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的番茄汁培养基由包括以下步骤的方法制备而得：清洗成熟番茄，去皮，榨汁，过滤，过滤后煮沸1～10分钟，4,000～12,000g离心5～10分钟，取上清，调节pH值到6.0～8.0，110℃～135℃灭菌10～30分钟，冷却即得。

4.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述类芽孢杆菌的接种量为1～5％，所述百分比为体积百分比，所述发酵培养的温度为25℃～37℃，所述震荡的速度为100rpm～300rpm，所述发酵培养的时间为24小时～72小时。

5.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述类芽孢杆菌的接种量为2～3％，所述百分比为体积百分比，所述发酵培养的温度为30℃～35℃，所述震荡的速度为150rpm～250rpm，所述发酵培养的时间为36小时～48小时。

6.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的速度为8,000～12,000g，离心的时间为5～10分钟。

7.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的速度为10000～11000g，离心的时间为6～8分钟。

8.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述超滤使用的超滤膜的截留分子量为3,000Da～8,000Da。

9.  一种如权利要求1～8任一项所述制备方法所得类芽孢杆菌细菌素提 取物。

10.  如权利要求9所述的类芽孢杆菌细菌素提取物在制备食品防腐剂中的应用。

一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用。
背景技术
细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的物质，主要成分为多肽、蛋白质或蛋白质复合物，最早由Jacob于1953年提出。近年来，广谱抗生素的普及甚至滥用所带来的负面效应日益突出，新型抗生素替代品的研究迫在眉睫。作为蛋白质类物质的细菌素，由于可被蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越来越多的关注。尽管目前开发获得的细菌素(Nisin)已具备了极高的防腐与抑菌的应用价值，但受Nisin本身的特性(低pH条件下性质稳定，pH>7.0抑菌活性逐渐丧失)的影响，其应用的范围受到了极大的局限性，其次，目前细菌素的获得都来自化学合成培养基，此类培养基成分多样，配方复杂，配制过程繁琐具有潜在食品安全风险，再者，制备细菌素的成本非常高、细菌素的来源相对有限，上述问题很大程度上限制了细菌素的开发和利用。
中国专利申请(CN 103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种，Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性，但尚未得到该菌株产出的抑菌性细菌素。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有细菌素稳定性差，制备成本高，来源不足的现状，提供了一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法 和应用。
本发明人发现，类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株发酵番茄汁培养基获得的发酵液上清经超滤截取的低分子量部分，经冷冻干燥后可获得具有强烈抑菌性的类芽孢杆菌细菌素提取物，通过反复验证，该细菌素提取物的抑菌效果稳定，从而完成了本发明。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于番茄汁培养基中震荡培养获得发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液离心取上清，超滤取低分子部分，冷冻干燥即得。
其中步骤(1)为将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于番茄汁培养基中震荡培养获得发酵液。其中所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)为本领域常规的类芽孢杆菌，较佳地为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC No.8333。所述类芽孢杆菌为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过从保藏中心购买获得。其中所述番茄汁培养基为本领域常规的番茄汁培养基，所述的番茄汁培养基较佳地由包括由以下步骤组成的方法制备而得：清洗成熟番茄，去皮，榨汁，过滤后煮沸，4,000-12,000g离心5～10min，取上清，灭菌，冷却即得。其中所述的过滤采用的方法为本领域常规的过滤方法，较佳地为采用100目纱布过滤，煮沸的时间较佳地为1～10分钟，所述番茄汁培养基的pH值较佳地为pH6.0～8.0，所述的灭菌温度较佳地为110～135℃，灭菌时间较佳地为10～30分钟。其中所述类芽孢杆菌的接种量较佳地为1～5％，更佳地为2～3％，最优选2.5％，所述百分比为体积百分比，类芽孢杆菌的发酵培养的温度较佳地为25℃～37℃，更佳地为30℃～35℃，最优选为32℃，所述震荡的速度较佳地为100rpm～300rpm，更佳地为150rpm～250rpm，最优选地为200rpm，所述发酵培养的时间较佳地为24小时～72小时，更佳地为36小时～48小时，最优选地为42 小时。当所述发酵培养的温度和时间，或者类芽孢杆菌的接种量不在上述范围值之内时，所得发酵产物的抑菌效果会产生显著降低。
发明所述制备方法中，将所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于番茄汁培养基之前，较佳地还包括该类芽孢杆菌CGMCC No.8333活化获得类芽孢杆菌种子的步骤。所述活化的步骤较佳地为：将本发明所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种在TYC固体培养基中，25～30℃培养18～28小时即得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子；将所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子的菌落均匀分散于TYC液体培养基内，再按2％～5％体积百分比的接种量接种于TYC液体培养基中震荡培养，摇床转速为100～200rpm，培养18-28小时，将所得培养物离心弃去上清，所得菌体用无菌蒸馏水洗涤后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，即得发酵用的类芽孢杆菌的种子。
其中所述步骤(2)为将步骤(1)所得发酵液离心取上清，超滤取低分子部分，冷冻干燥即得。
其中所述离心的速度较佳地为8,000～12,000g，更佳地为10000～11000g，离心的时间较佳地为5～10分钟，更佳地为6～8分钟。当所述离心的速度和离心的时间不在上述范围值之内时，所得发酵产物的抑菌效果会产生显著降低，其抑菌性能的稳定性也会大幅下降。
其中所述的超滤为本领域常规的超滤方法，所述超滤是指以大分子与小分子分离为目的，以压力为推动力的膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。
所述超滤中使用的超滤膜为本领域常规的超滤膜，所述超滤膜的截留分子量较佳地为3,000～8,000Da，更佳地为5,000Da。
其中所述的冷冻干燥为本领域常规的冷冻干燥方法，所述冷冻干燥方法较佳地为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如本发明所 述的制备方法所得类芽孢杆菌细菌素提取物。
本发明所述类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法中各步骤所述技术特征的优选范围与上文所述类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法中相应的内容完全一致，具体请参见上文所述内容，此处不再赘述。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：如本发明所述的类芽孢杆菌细菌素提取物在制备食品防腐剂中的应用。
本发明所述类芽孢杆菌细菌素提取物可以广泛应用于制备各种食品防腐剂，功能性食品或者功能性饲料中。所述应用较佳地为在制备食品防腐剂中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、目前细菌素提取物的制备都依赖于化学合成培养基，而运用番茄汁制备细菌素提取物的研究尚未报道过，本发明首次将番茄汁培养基作为一种天然的发酵培养基应用于细菌素提取物的制备，因而其产物具有更高的食品安全性。
2、本发明所述用于制备类芽孢杆菌细菌素提取物的原料为番茄，其来源广、成本低，发酵菌种为类芽孢杆菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
3、解决了当前细菌素来源狭隘的现状，开创性地将类芽孢杆菌应用于细菌素的制备工艺。
4、本发明所述的类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法工艺简单，仅需四步：发酵、离心、超滤、冻干即可完成，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题，其次，整个制备过程不涉及任何有机溶剂，因此从根本上杜绝了有机溶剂残留的问题。
5、与传统细菌素Nisin相比，采用本发明制备的细菌素提取物的性质更稳定，尤其在中性条件下抑菌活性显著高于Nisin，因此，具有比Nisin更优的应用价值，其可作为一种新型的制备方法应用于类芽孢杆菌细菌素的工业化生产及相关领域中，应用前景十分广阔。
6、采用本发明制备的类芽孢杆菌细菌素提取物可以直接用于食品的生产，从而达到抑制腐败菌的增殖，延长食品货架期的目的，进而降低了食品防腐剂的应用成本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为15-25℃。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。
实施例1类芽孢杆菌细菌素提取物的制备与抑菌效果的检测
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)(所述类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.8333该菌株的来源请参见公开号为CN103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm震荡培养24h取出，以2％(体积百分比)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm震荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
指示菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC 1.879、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CGMCC 1.1848、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)CGMCC 1.9136，以上指示菌株都购买自CGMCC。
指示菌液的制备：将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于LB固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL LB液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm震荡培养24h取出，以2％(体积百分比)接种量接种于LB液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm震荡培养20h后，即得相应的指示菌液。
指示平板的制备：将上述方法制备的指示菌液进行稀释，使其细菌浓度约为10⁷cfu/mL，以体积比1：150的比例吸取稀释的指示菌液注入45℃无菌LB固体培养基中，充分混匀后迅速倒平板，待平板凝固且表面水分蒸发完全后即可。
抑菌活性的检测方法：以点种法在指示平板上滴加20μL待测样品，置于30℃培养20h后测量并记录抑菌圈直径。
番茄汁培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸1min，12,000g离心10min取上清，调节pH至6.0，110℃灭菌30min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁培养基。
2、类芽孢杆菌细菌素提取物的制备
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)以5％(体积百分比)接种量接种于pH6.0的番茄汁培养基中，25℃、300rpm震荡培养24h获得发酵液，将上述发酵液8,000g离心10min取上清，超滤(Mwco＝5,000Da)(本发明所述超滤设备Pellicon 0.1M²及超滤膜都购买自密理博公司)，取低分子量部分，冷冻干燥即得类芽孢杆菌细菌素提取物A。
3、类芽孢杆菌细菌素提取物抑菌活性的测定
向类芽孢杆菌细菌素提取物A加入无菌蒸馏水配制成50mg/mL的类芽孢杆菌细菌素提取物溶液，混合均匀后，测定其抑菌活性。结果如下表所示：
表1类芽孢杆菌细菌素提取物A的抑菌效果

由表1可以看出，类芽孢杆菌细菌素提取物A作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为15mm、17mm和14mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌细菌素提取物A对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。
实施例2类芽孢杆菌细菌素提取物的制备与抑菌效果的检测
1、材料与方法：
番茄汁培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心10min取上清，调节pH至8.0，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁培养基。
其他材料与方法同实施例1。
2、类芽孢杆菌细菌素提取物的制备
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)以1％(体积百分比)接种量接种于pH8.0的番茄汁培养基中，37℃、100rpm震荡培养72h获得发酵液，将上述发酵液10,000g离心8min取上清，超滤(Mwco＝8,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得类芽孢杆菌细菌素提取物B。
3、类芽孢杆菌细菌素提取物抑菌活性的测定
向类芽孢杆菌细菌素提取物B加入无菌蒸馏水配制成50mg/mL的类芽孢杆菌细菌素提取物溶液，混合均匀后，测定其抑菌活性。结果如下表所示：
表2类芽孢杆菌细菌素提取物B的抑菌效果


由表2可以看出，类芽孢杆菌细菌素提取物B作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为16mm、19mm和16mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌细菌素提取物B对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。
实施例3类芽孢杆菌细菌素提取物的制备与抑菌效果的检测
1、材料与方法同实施例1。
番茄汁培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，调节pH至7.0，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁培养基。
其他材料与方法同实施例1。
2、类芽孢杆菌细菌素提取物的制备
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)以2％(体积百分比)接种量接种于pH7.0的番茄汁培养基中，30℃、180rpm震荡培养48h获得发酵液，将上述发酵液12,000g离心5min取上清，超滤(Mwco＝3,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得类芽孢杆菌细菌素提取物C。
3、类芽孢杆菌细菌素提取物抑菌活性的测定
向类芽孢杆菌细菌素提取物C加入无菌蒸馏水配制成50mg/mL的类芽孢杆菌细菌素提取物溶液，混合均匀后，测定其抑菌活性。结果如下表所示：
表3类芽孢杆菌细菌素提取物C的抑菌效果

由表3可以看出，类芽孢杆菌细菌素提取物C作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为17mm、22mm和18mm，由此可见，本发明所得类芽孢杆菌细菌素提取物C对上述革兰氏阳性菌具有显著的抑菌效果。
实施例4类芽孢杆菌细菌素提取物的制备与抑菌效果的检测
1、材料与方法：
番茄汁培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心10min取上清，调节pH至8.0，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁培养基。
其他材料与方法同实施例1。
2、类芽孢杆菌细菌素提取物的制备
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)以2％(体积百分比)接种量接种于pH8.0的番茄汁培养基中，30℃、150rpm震荡培养36小时获得发酵液，将上述发酵液10,000g离心6min取上清，超滤(Mwco＝8,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得类芽孢杆菌细菌素提取物。
3、类芽孢杆菌细菌素提取物抑菌活性的测定
检测方法与实施例1相同，所得类芽孢杆菌细菌素提取物作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为13mm、16mm和14mm。
实施例5类芽孢杆菌细菌素提取物的制备与抑菌效果的检测
1、材料与方法：
番茄汁培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心10min取上清，调节pH至8.0，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁培养基。
其他材料与方法同实施例1。
2、类芽孢杆菌细菌素提取物的制备
将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)以2.5％(体积百分比)接种量接种于pH8.0的番茄汁培养基中，30℃、200rpm震荡培养42小时获得发酵液，将上述发酵液11,000g离心8min取上清，超滤(Mwco＝5,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得类芽孢杆菌细菌素提取物。
3、类芽孢杆菌细菌素提取物抑菌活性的测定
检测方法与实施例1相同，所得类芽孢杆菌细菌素提取物作用于金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及单增李斯特氏菌产生的抑菌圈直径分别为13mm、17mm和14mm。
对比例1
将实施例3中的接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度，培养基pH以及超滤截留分子量逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的类芽孢杆菌细菌素提取物。各组类芽孢杆菌细菌素提取物还原为冻干前的体积后，其测定的抑菌效果下表所示。
表4不同方法制备所得类芽孢杆菌细菌素提取物的抑菌效果

从表4所示的结果中可以得出，将所述类芽孢杆菌细菌素提取物的制备方法中接种量，培养温度，发酵时间，发酵震荡的速度，培养基pH以及超滤截留分子量调整到本发明之外的时候，所得类芽孢杆菌细菌素提取物的抑菌效果显著降低。
对比例2
以实施例3所述方法制备的类芽孢杆菌细菌素提取物C为待测样品，同时选用目前市场上常规的细菌素产品尼萨普林(Nisaplin，购买自丹尼斯克公司)为对照，尼萨普林是传统的商业化抑菌产品，其核心有效成分为乳酸链球菌素Nisin，此外还有氯化钠等其他成份。将类芽孢杆菌细菌素提取物C和尼萨普林分别溶解于pH＝3、5、7、9的0.2M磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为50mg/mL的待测样品组S-3、S-5、S-7、S-9和对照组N-3、N-5、
N-7、N-9，各组样品的抑菌效果如下表所示。
表5与常规细菌素产品的抑菌效果比较

表5显示了常规的细菌素制品与本发明制备的类芽孢杆菌细菌素提取物在不同pH条件下的抑菌效果，数据表明，尼萨普林在中性或中性以上的pH条件下，其抑菌活性开始丧失，而本发明制备的类芽孢杆菌细菌素提取物却在相同条件下依然保持着稳定的抑菌能力，由此可见，本发明制备的类芽孢杆菌细菌素提取物具有更优秀的抑菌稳定性，该特性推翻了现有细菌素制品只能应用于偏酸环境下的食品加工领域的局限性，因此，本发明制备的类芽孢杆菌细菌素提取物可应用的食品加工范围将比现有细菌素制品更广。
效果实施例1
按传统工艺制作的香肠(制作方法引自下述文献：袁秋萍.乳酸链球菌素在肉制品中的应用[J].食品工业科技,1998(4):27-28.)，其中，对照组1的香肠中仅添加亚硝酸钠，添加量为0.15g/kg，对照组2的香肠中添加亚硝酸钠和常规细菌素制品尼萨普林，添加量分别为0.04g/kg和0.4g/kg，样品组的香肠中添加了亚硝酸盐和实施例3制备获得的类芽孢杆菌细菌素提取物C，添加量分别为0.04g/kg和0.2g/kg，各香肠样品制作完成后测定菌落总数，结果如下表所示。
表6香肠制作工艺中类芽孢杆菌细菌素提取物的抑菌效果

由表6可知，在香肠的制作工艺中，添加本发明所制备的类芽孢杆菌细菌素提取物，其成品中的抑菌效果与现有细菌素产品相仿，而且香肠的色、香、味没有明显的变化，由此可见，以本发明所制备的类芽孢杆菌细菌素提取物完全可替代现有细菌素产品在各种防腐、抑菌等方面应用。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。