褐藻胶低聚糖作为益生元的应用 技术领域：
本发明涉及褐藻胶低聚糖作为益生元的应用。
背景技术：
益生元(Prebiotic)是不被宿主胃肠道消化，能够选择性地刺激一种或几种有益菌在宿主肠道内生长，进而增进宿主健康的物质。1995年Gibson首次提出益生元的概念，现在益生元作为微生态调节剂的一种已经得到了广泛的研究与应用。益生元可显著促进双歧杆菌等肠道益生菌增殖，而双歧杆菌本身在自身繁殖的过程中产生大量乳酸，乳酸能够刺激肠蠕动，排出体内有害物质，促进维生素B1、B2、B6及人体对钙离子的吸收。同时益生元抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，减少肠道内有害物质的产生。通过上述作用改善肠道的微环境，进而双向调节人体机能，提高人体免疫力，改善内分泌系统，促进营养物质的吸收，从而达到改善人体亚健康状态，起到延年益寿、美容等作用；并可防治肿瘤、肠道感染等疾病的发生，维护人体健康。但是目前尚未见有将褐藻胶低聚糖用作益生元的报道。
发明内容：
本发明的目的是将褐藻胶低聚糖用作益生元，它能弥补现有技术的上述不足。
褐藻胶低聚糖用作益生元。
动物和人体试验证明褐藻胶低聚糖是一种非消化性低聚糖，能显著促进双歧杆菌和乳酸杆菌等肠道益生菌的生长，抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，起到了改善肠道微生态环境和净化肠道的作用，能提高人体免疫力，改善内分泌系统，促进营养物质的吸收，从而达到改善人体亚健康状态，发挥防治肿瘤、肠道感染等疾病以及延年益寿、美容等作用。因此，褐藻胶低聚糖是一种新型的益生元，它是一种新的药品、保健品、食品添加剂或饲料添加剂。
具体实施方式：
(一)褐藻胶低聚糖的制备：
申请号为02135571.1地中国专利中提供了一种化学氧化法制备褐藻胶低聚糖的方法。申请号为01107952.5的中国专利中提供了一种酸水解法制备褐藻胶低聚糖的方法。
本发明提供了一种酶解法制备褐藻胶低聚糖的方法，用这种方法制备的褐藻胶低聚糖的分子结构与上述两种方法制备的褐藻胶低聚糖的结构相比，主链都是由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸两种糖单元连续或交替连接而成的线性分子，平均分子量在500-2000范围内，聚合度在2-10的范围内，不同之处在于其还原末端的碳4位与碳5位之间存在不饱和双键。
酶解法制备褐藻胶低聚糖的步骤是：
首先提取褐藻胶裂合酶(见申请号为03112273.6的专利)，再将它按照10-50U的比例加入到1升重量百分比浓度为0.5％-1％的褐藻胶水溶液中，进行酶解，酶解温度为25-38℃，时间为6-8小时，最后通过离心或过滤除去未降解的大分子褐藻胶，用Sephadex G25凝胶柱进行层析分离，收集褐藻胶低聚糖组分，浓缩干燥。
(二)褐藻胶低聚糖的益生元作用(对肠道菌群中的调节作用)：
(1)动物实验：
①试验动物及分组：选用健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-20g，购于青岛动检所。按随机分组的方法将小鼠分为六组，每组8只。第一组(A组)为空白对照组，第二组(B组)为大豆低聚糖阳性对照组，第三组(C组)为褐藻胶给药组，第四组(D组)为低剂量褐藻胶低聚糖给药组，第五组(E组)为中剂量褐藻胶低聚糖给药组，第六组(F组)为高剂量褐藻胶低聚糖给药组。
②给药量及方法：褐藻胶为市售产品。大豆低聚糖为无色透明液体，由山东临沂山松生物制品有限公司生产。B组灌胃大豆低聚糖的量为：3.33毫升/(千克体重)(相当于厂方推荐的成人日服用建议量的20倍)。C组灌胃0.3％(重量百分比)的褐藻胶水溶液。D组灌胃15.0-18.7mg/ml的褐藻胶低聚糖。E组灌胃20.0-37.5mg/ml的褐藻胶低聚糖。F组灌胃50.0-75.0mg/ml的褐藻胶低聚糖。C、D、E、F组灌胃液体总量按0.02毫升/(克体重)计算。A组灌胃等量的蒸馏水。各组连续灌胃14天，灌胃完取小鼠盲肠内含物与粪便进行肠道菌的计数分析。
③培养基：双歧杆菌采用BL培养基或BLb培养基；乳杆菌采用LBs培养基；肠球菌采用胆盐一七叶苷—叠氮钠培养基；拟杆菌采用Bds培养基；肠杆菌采用EMB培养基；粪便样品稀释液采用液体硫乙醇酸盐培养基；盲肠内含物稀释液采用KH2PO44.5g，Na2HPO4 6.0g，L-盐酸半胱氨酸0.5g，吐温-80 0.5ml，琼脂1g，加蒸馏水稀释至1000ml，115℃灭菌20min。
④小鼠检测材料的取得和测定：取小鼠粪便0.2-0.4g，加入液体硫乙醇酸盐培养基，梯度稀释，使其重量百分比浓度为原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-8，10-9，选取合适的稀释度涂于各种选择性培养基上，每个稀释度做三个平板，培养后进行计数(活菌数/克粪便标本)，取平均值，同时挑选特征性菌落，进行形态和生化形状检测鉴定，确定其菌属。其中EMB培养基，胆盐—七叶苷—叠氮钠培养基37℃，需氧培养24-48小时，其余厌氧菌厌氧培养48-72小时。结果如表1所示。
将盲肠内含物用稀释液洗出，梯度稀释，使其重量百分比浓度为原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-8，10-9，选取合适的稀释度涂于各种选择性培养基上，每个稀释度做三个平板，培养后进行计数(活菌数/克粪便标本)，取平均值，同时挑选特征性菌落，进行形态和生化形状检测鉴定，确定其菌属。其中EMB培养基，胆盐—七叶苷—叠氮钠培养基37℃，需氧培养24-48小时，其余厌氧菌厌氧培养48-72小时。结果如表2所示。
表1：褐藻胶低聚糖连续灌胃后小鼠各种肠道菌群数量检测结果( x±s，n＝8)
双歧杆菌 乳酸杆菌 大肠杆菌 肠球菌 拟杆菌 A组灌胃前7.40±0.10 7.85±0.63 7.91±1.13 5.58±1.02 7.86±0.58灌胃后7.50±0.34 7.95±0.29 7.82±0.86 5.60±0.41 7.84±0.16 B组灌胃前7.58±0.38 7.89±0.30 7.89±0.88 5.11±0.75 7.74±0.29灌胃后7.94±0.16 8.54±0.42 7.80±0.11 5.42±0.23 7.92±0.25 C组灌胃前7.57±0.25 7.85±0.15 7.88±0.76 5.45±0.59 7.73±0.13灌胃后7.66±0.12 8.58±0.43 7.79±0.13 5.52±0.65 7.85±0.45 D组灌胃前7.41±0.76 7.83±0.38 7.90±0.75 5.07±0.18 7.86±0.42灌胃后8.61±0.351，3 8.62±0.552，3 7.58±0.211，3 5.65±0.43 7.47±0.421，3 E组灌胃前7.52±0.31 7.86±0.60 7.91±0.30 5.40±0.21 7.89±0.24灌胃后8.43±1.12 8.48±0.202，3 7.67±0.38 5.69±0.85 7.74±0.28 F组灌胃前7.48±0.65 7.84±0.25 7.89±0.82 5.26±0.20 7.64±0.29灌胃后8.53±0.111 8.33±0.14 7.94±0.32 5.31±0.55 7.84±0.14
表2：褐藻寡糖连续灌胃后小鼠盲肠菌群数量检测结果( x±s，n＝8)
A组 B组 C组 D组E组F组双歧杆菌7.18±0.22 7.48± 0.19 7.32± 1.07 7.7± 1.25*7.65±0.347.38±1.13乳酸杆菌8.12±0.29 8.38± 0.18 8.34± 0.22 8.52± 0.258.5±0.16*8.43±0.17大肠杆菌7.65±0.35 7.72± 0.27 7.26± 0.31 6.8± 0.91*7.03±0.647.18±0.28肠球菌4.58±0.71 5.11± 0.59 4.91± 0.77 5.07± 1.055.40±0.925.26±0.84拟杆菌7.75±0.33 7.81± 0.27 7.70± 0.30 7.3± 0.49*7.4±0.38*7.42±0.18
注：*与对照组比较(P＜0.05)
⑤.实验结果：
双歧杆菌的形态及生化特性：在BL平板上经48-72小时培养后形成直径为0.5-1mm的凸起、边缘整齐，成乳白色的不透明菌落；镜检为G+，呈Y字型、V字型、弯曲状等形态。
生化反应：接触酶试验(-)，吲哚试验(-)，明胶液化实试验(-)，硝酸盐还原试验(-)，尿素酶试验(-)。
表1是褐藻胶低聚糖连续灌胃后小鼠各种肠道菌群数量检测结果，表2是褐藻胶低聚糖连续灌胃后小鼠盲肠菌群数量检测结果。表中的数值为活菌数/克粪便标本的对数值。计数方法为：每1g粪便的细菌数CFU·g-1＝菌落数×10n×40(10n为与菌落相对应的稀释度；40为换算常数)，结果以每克粪便中的细菌菌落的对数值log CFU·g-1表示。表1和表2中所列的数值是以平均数( x)与标准差(s)表示为 x±s，n为各组小鼠的数量，n＝8。
表1和表2中某些数值的右上方标号“1”表示与自身对照比较(P＜0.05)；标号“2”表示与自身对照比较(P＜0.01)；标号“3”表示与对照组比较(P＜0.05)。P为显著性差异，采用SPSS 10.0 for Windows统计软件得出。P＜0.01为差异极为显著，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异无显著性。
由表1可见，经口给予小鼠褐藻胶低聚糖后，小鼠肠道内的5种细菌数量发生变化。大豆低聚糖阳性对照组(B组)与空白对照组(A组)相比，双歧杆菌的数量有增加趋势，差异无显著性(P＞0.05)，乳酸杆菌的数量明显增加，差异显著(P＜0.05)；单独褐藻胶给药组(C组)与空白对照组(A组)相比，双歧杆菌的数量有增加趋势，差异无显著性(P＞0.05)，乳酸杆菌的数量明显增加，差异显著(P＜0.05)；低剂量褐藻胶低聚糖给药组(D组)与空白对照组(A组)相比，双歧杆菌的数量明显增加(P＜0.05)，乳酸杆菌的数量显著增加(P＜0.05)，大肠杆菌与拟杆菌的数量明显减少(P＜0.05)。中剂量褐藻胶低聚糖给药组(E组)与空白对照组(A组)相比，双歧杆菌的数量显著增加(P＜0.05)，乳酸杆菌的数量显著增加(P＜0.05)，高剂量褐藻胶低聚糖给药组(F组)与空白对照组(A组)相比，双歧杆菌的数量明显增加(P＜0.05)，乳酸杆菌的数量有增加趋势，差异无显著性(P＞0.05)。
B组双歧杆菌的数量增加了2.29倍，乳酸杆菌的数量增加了5.25倍。
C组双歧杆菌的数量增加了1.23倍，乳酸杆菌的数量增加了5.37倍。
D组双歧杆菌的数量增加了15.85倍，乳酸杆菌的数量增加了6.16倍。
E组双歧杆菌的数量增加了7.58倍，乳酸杆菌的数量增加了4.17倍。
F组双歧杆菌的数量增加了11.22倍，乳酸杆菌的数量增加了3.09倍。
经以上的比较可知，B组对双歧杆菌数量的增加低于D组，即，褐藻胶低聚糖对双歧杆菌和乳杆菌的数量增加程度优于大豆寡糖。双歧杆菌与乳酸杆菌数量的增加并不是因为褐藻胶多糖的原因。
由表2可见，经口给予小鼠褐藻胶低聚糖后，小鼠盲肠内的5种细菌数量发生变化。与对照组比较，D组(低剂量褐藻胶低聚糖给药组)双歧杆菌的数量明显增加(P＜0.05)，乳酸杆菌的数量显著增加(P＜0.05)，大肠杆菌与拟杆菌的数量明显减少(P＜0.05)。E组(中剂量褐藻胶低聚糖给药组)双歧杆菌的数量增加(P＜0.05)，乳酸杆菌的数量显著增加(P＜0.05)。经比较表中数据可知，B组对双歧杆菌数量的增加低于D组，即，褐藻胶低聚糖对双歧杆菌的数量增加程度优于大豆寡糖。
综上可知，褐藻胶低聚糖不被宿主胃肠道消化，选择性的刺激双歧杆菌与乳酸杆菌这两种有益菌在宿主肠道内生长，抑制大肠杆菌与拟杆菌的生长，进而增进宿主健康，是一种新型的益生元。褐藻胶低聚糖益生元用于调节肠道菌群的有效剂量为15.0-75.0mg/ml，以15.0-30.0mg/ml的剂量范围为最优。对双歧杆菌的数量增加的效果优于市售大豆低聚糖。
(2)受试者实验：
受试者为血液，尿、便常规检查及肝功能检查，心率、血压、心电图检查，指标全部正常的志愿者15名(男7名，女8名)，受试者平均年龄(42.3±7.5)岁，近期无明显内分泌代谢性疾患，未曾使用抗生素等药物，试验期间正常饮食，无其他乳酸菌饮料使用。
实验方法与动物实验相同，受试者分别于服用前、服用7天后以及服用14天后，取粪便进行肠道菌群的分析。受试者服用受试物7天后，双歧杆菌与乳酸杆菌的数量明显增加，双歧杆菌比服用前增加了5-7倍，乳酸杆菌比服用前增加了4.5-6倍，个别受试者双歧杆菌比服用前增加了10倍，乳酸杆菌比服用前增加了11倍。大肠杆菌与拟杆菌的数量明显减少，大肠杆菌比服用前减少了2-4倍，拟杆菌比服用前减少了3-4倍，肠球菌的数量未有明显变化，4人便秘情况有所改善，表现为排便规律，粪便性状正常，排便通畅。受试者服用受试物14天后双歧杆菌比服用前增加了6.5-7.5倍，乳酸杆菌比服用前增加了5-6倍，大肠杆菌比服用前减少了2-4倍，拟杆菌比服用前减少了3-4倍，肠球菌的数量未有明显变化。3人有食欲增加现象，2人排气有所增加。无腹泻，无腹痛症状出现。饮食、睡眠及精神状态均良好。
本实施例中所用的褐藻胶低聚糖为酶解法制备的褐藻胶低聚糖，在上述实验中把它改用化学氧化法制备的褐藻胶低聚糖和酸水解法制备的褐藻胶低聚糖时，其实验方法与酶解法制备的褐藻胶低聚糖相同，效果也近似，在此不再重复。三者均具有选择性的刺激双歧杆菌与乳酸杆菌这两种有益菌在宿主肠道内生长，抑制大肠杆菌与拟杆菌的生长，进而增进宿主健康的功效，是一种新型的益生元。
本发明的褐藻胶低聚糖用作药品时的剂量为5mg-10mg，每日2次口服；用作保健品时的剂量为2.5mg-5mg，每日2次口服；用作食品添加剂时的重量百分数为0.1％-0.8％；用作饲料添加剂时的重量百分数为0.5％-1％。所述的食品为酸奶、奶粉；所述的饲料为鸡饲料、猪饲料、牛饲料。这四种用途经7-14天就能明显见效。