光可切除的磁粒子分子标签、其制备方法及在多肽合成制备中的应用.pdf

本发明公开了一种磁粒子分子标签、其制备方法及在多肽合成制备中的应用。在磁粒子上连接光敏感性的分子基团，将其作为新型的分子标签，对常规固相多肽合成全长目标肽链进行衍生标记、切割，通过外部磁力介导分离，光切除分子标签并最终分离，得到目标全长高纯多肽。本发明的新型分子标签可用于固相多肽合成和纯化制备中，能简单、快速、精确合成目的全长多肽，具有低成本，高效率，节省仪器和试剂投入，并可大规模制备的优点。

1、  一种光可切除的磁粒子分子标签，其特征在于：在磁粒子的表面连接有对光敏感的活性分子。

2、  根据权利要求1所述的磁粒子分子标签，其特征在于磁粒子是顺磁性的粒子，其表面含有游离氨基。

3、  根据权利要求1所述的磁粒子分子标签，其特征在于磁粒子组成材料为Fe3O4。

4、  根据权利要求1所述的磁粒子分子标签，其特征在于磁粒子的粒径为1-1.5μm。

5、  根据权利要求1所述的磁粒子分子标签，其特征在于光敏感的活性分子对近紫外线光照敏感。

6、  根据权利要求5所述的磁粒子分子标签，其特征在于光敏感的活性分子结构为：


7、  根据权利要求1-6任意之一所述的磁粒子分子标签可以通过外加磁场聚集、沉淀。

8、  一种制备权利要求1所述的磁粒子分子标签的方法，依次包括如下步骤：
(1)将光可切除连接分子用无水1-羟基苯并三氮唑和二异丙基乙二胺，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中活化；
(2)加入表面包覆有氨基的磁性粒子，避光反应；
(3)分离、洗涤、干燥得磁粒子分子标签。

9、  权利要求1所述的磁粒子分子标签在多肽合成制备方面的应用。

10、  权利要求9所述的磁粒子分子标签用于多肽固相合成和纯化制备，其工艺方法如下：
(1)用固相合成方法在树脂上合成多肽链，采用经典的Fmoc或Boc方法连接第一个氨基酸。
(2)在合成循环中每个氨基酸连接完毕，采用乙酸酐或者2-氯-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯试剂加帽封闭未反应完全的N端氨基，使截短序列不能继续组装合成，为以后纯化制备创造条件，保证全长序列的纯化方便。
(3)在多肽序列组装合成到末端最后一个氨基酸完成后，加帽完毕，脱保护，游离出NH2基团，用二氯甲烷洗涤。
(4)用六氟磷酸邻-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基铀、1-羟基苯并三氮唑、二异丙基乙二胺2-5倍过量情况下，在N，N-二甲基甲酰胺溶液或N，N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷体积比1∶1溶液中活化分子标签，避光加入准备好的肽-树脂反应器中，N2气搅动下避光反应2-3小时，用异丙醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇洗涤，真空干燥树脂混合物。
(5)把上述分子标签-肽-树脂混合物用标准多肽切割混合物从树脂上切割下来，切割液离心，取未沉淀的液体，加入冷乙醚析出，用乙醚洗涤，结合外部磁力吸附导引沉淀。
(6)放置得到的聚集沉析物，使残留乙醚挥发完全。
(7)加入双蒸水，充分溶解分子标签-肽，使浓度接近1mg/ml。
(8)将分子标签-肽溶液用近紫外线照射2.5-5小时。
(9)用磁铁吸附干净磁粒与光可切除的连接物沉析聚集，收集上清液。
(10)冻干上清液得到目标全长高纯多肽。

光可切除的磁粒子分子标签、其制备方法及在多肽合成制备中的应用
技术领域
本发明涉及一种光可切除的磁粒子分子标签及其制备方法和用途，特别涉及一种光化学敏感可光切除的磁粒子分子标签、其制备方法及其在多肽规模化合成和纯化制备中的应用。
背景技术
自从二十世纪四十年代科学家发明固相多肽方法以来，人们用9-芴基甲氧羰基(Fmoc-)或叔丁氧羰基(Boc-)已经合成了成千上万条各种序列的多肽，许多多肽类新药品都是通过此类方法合成制备而来。随着现代生物技术及分子生物学、蛋白组计划的快速发展，科学家和各类生物医药研发机构对多肽这类在生物体系中存在重要生理活性的物质开始非常关注，越来越多的科学家开始研究多肽，希望在多肽中筛选得到有活性并且价格便宜的新药品，这些因素促使多肽合成和纯化制备领域快速发展，从最初的手工合成，到现在使用多肽合成仪全自动化合成，从液相合成到固相合成，Fmoc/Boc高通量合成等，新的合成方法层出不穷。
人们在研究开发中发现，对于多肽合成和纯化制备一体化考虑，快速、精确、低成本的把目的全长多肽序列合成并制备得到高纯度的药品或试剂仍然存在很大的困难，主要因为：(1)在用固相多肽合成中，不可避免的会遇到许多由于空间障碍造成连接的不完全；(2)不合格的催化剂或不纯试剂也会造成截短序列。这些因素使得每一步连接循环都不可能保证100％的连接率，于是就产生少量的截短序列，如果不进行处理，则交错的连接下去，对下游纯化造成很大困难。
一般情况下，用过量的乙酰酐封闭肽链N末端未反应的氨基，阻止错位链的继续组装，这样处理可以解决纯化问题，但随着计划合成多肽序列的增长，干扰序列由于只差一个或几个氨基酸残基，后续分离行为即使用现在经典的反相高压色谱梯度(RP-HPLC)分离，也难于完全分离，更难于大量的高效制备。
这样就要求把整个多肽合成和制备纯化过程，特别是长的肽序列作为一个整体进行系统优化，设计出一种更高效的合成和分离方法去解决上述问题。科学家发现除了在合成中使用“加帽”的方式优化合成以外，在肽一树脂的最后一个氨基酸N端衍生一个可以切割下来的化学敏感性的分子标签，9-芴基甲氧羰基(fmoc--)，亲脂性-(lipophilic)或生物素(biotinylated)，可以大大改善多肽特别是长肽合成和纯化制备的HPLC行为，通过2次RP-HPLC分离纯化，使整个多肽纯化制备可以比常规使用的方式简单、快速、高效的多(Weng C.Chen et aI，Fmocsolid phase peptide synthesis，A Practical Approach，Oxford university press，2000，266-276)。
该技术使用化学敏感性的分子标签，在纯化操作中给体系中引入了杂质分子，无论截短加帽序列或者目标全长肽或引入的分子标签，都需要通过不断给HPLC进样而得到有效纯化，并且需要二次纯化，由于使用梯度洗脱，耗时并耗费大量昂贵试剂(如乙氰)。
有鉴于此，发明人考虑到以下两点：(1)磁性粒子可以通过外加磁场富集、沉析和聚集；(2)光敏感的可切除分子连接替代化学敏感的分子连接不给系统引入新的杂质(易于分离)。光可切割的分子连接在多肽合成中作为间接应用分子，与树脂载体连接，作为安全捕获连接已经有很多报道(Cano，et all，J.Org.chem，2002，67，129-135)，也有光可切除连接(linker)做为骨架分子与其他载体材料连接，如与AMPS树脂、CPG玻璃珠等连接(美国BiosearchTechnologies Inc.产品)，具体连接实例见文献报道(D.H.Rich and S.K.Gurwara，J.Am.Chem.Soc.，1975，97，1575；H.venkatesan and M.M.Greengurg，ibid.，1996，61，525；C.P.Homes and D.G..Jones ibid.，1995，60，2318；M.R.Carrasco，et al.TetrahedronLett.1997，38，6331.)，但没有发现此类骨架分子与磁粒子连接用于多肽标记的报道。将二者结合，发明人得到了一种新的光可切除的磁粒子分子标签、其制备方法及其在多肽规模化合成制备中的应用，很好的克服了上述不足。
发明内容
本发明的目的是提供了一种磁粒子分子标签，使用磁性粒子，在其上连接光敏感性的分子基团，把其作为新型的分子标签。
本发明的另一目的是提供制备上述磁粒子分子标签的合成方法。
本发明的再一目的是使用该分子标签对常规的固相多肽合成全长目标肽链进行衍生标记、切割，通过外部磁力介导分离，光切除分子标签并最终分离，得到目标全长高纯多肽。
一种光可切除的磁粒子分子标签，在磁粒子的表面连接有对光敏感的活性分子，磁粒子可以是顺磁性的粒子，如Fe₃O₄，其粒径为1-1.5μm。光敏感分子连接骨架分子选择Biosearch Technologies Inc.公司的名为：Photolabile--Nu-Linker的产品，通过化学方法将光敏感分子与磁粒子连接得到磁粒子分子标签，得到的磁粒子分子标签表面含有活性基团，如氨基。该磁粒子分子标签对酸，如三氟乙酸(TFA)稳定，对近紫外线，特别是365nm的光照敏感。
一种光可切除的磁粒子分子标签的制备方法，依次包括如下步骤：
(1)将光可切除连接分子用无水1-羟基苯并三氮唑和二异丙基乙二胺，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中活化；
(2)加入表面包覆有氨基的磁粒子，避光反应；
(3)分离、洗涤、干燥得磁粒子分子标签。
下面结合附图进一步详细叙述本发明的磁粒子分子标签。
图1是磁粒子结构示意图；
图2是光可切除分子修饰磁粒子获得得分子标签复合物的结构示意图；
图3是肽树脂结构示意图；
图4分子标签组合物与肽树脂结合原理图；
，在外部磁场的作用下能够定向移动，撤掉磁场，则可分散开来，磁核外部包覆一层高分子材料，表面分布着许多活性基团，例如氨基(图1所示)，可以和其它活性分子相连接，可以吸附、富集其他蛋白、抗原、抗体、酶、细胞和核酸等，该功能磁粒可以从德国美天妮公司或淄博赫兹生物公司商购得到。
光可切除连接分子及选择。发明人选择Biosearch Technologies Inc.公司的产品名称为Photolabile--Nu-Linker，结构如下所示的连接骨架分子。

光可切除分子修饰磁粒子分子标签复合物的制备。图2为光可切除分子修饰磁粒子获得得分子标签复合物的结构示意图，M代表磁粒子，其与光可切除连接之间用对酸稳定的酰氨键连接(如下结构图所示)，在磁粒地外周包覆好NH₂基团后(替代度d＝1mmol/mg)，与光可切割分子在HOBT(1-羟基苯并三氮唑)，DIEA(二异丙基乙二胺)过量情况下，DMF溶液中反应2.5小时制备，反应完毕，用磁铁吸附沉析出反应连接好的分子标签，用分别用DMF，二氯甲烷，甲醇洗并沉析各3次，减压干燥备用。

肽-树脂合成和末端标记。图3为肽树脂结构示意图，肽树脂合成按标准肽合成程序进行，在每一个氨基酸连接完成，进行末端加帽封闭，最后一个氨基酸连接完毕，末端脱保护，对于加帽封闭了末端的截短肽不能和分子标签缀合物结合。
图4为分子标签组合物与肽树脂结合原理图。合成树脂与多肽序列之间的连接对酸不稳定，磁性粒子与光可切割分子之间的连接位置对酸稳定，光可切割分子与多肽序列之间的连接是光切割点，对365nm光不稳定，可切除。
通过上述方法得到的磁粒子分子标签可用于多肽固相合成和纯化制备，并且分子标签可以通过浓缩洗涤而重复利用，其具体工艺方法及操作过程如下：
(1)用固相合成方法在树脂上合成多肽链，采用经典的Fmoc或Boc方法连接第一个氨基酸。
(2)在合成循环中每个氨基酸连接完毕，采用乙酸酐或者2-氯-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯[Z(2-CI)-Osu]试剂加帽封闭未反应完全的N端氨基，使截短序列不能继续组装合成，为以后纯化制备创造条件，保证全长序列的纯化方便。
(3)在多肽序列组装合成到末端最后一个氨基酸完成后，加帽完毕，脱保护，游离出NH₂基团，用DCM(二氯甲烷)洗涤。
(4)用HBTU(o-Benzotriazole-N，N，N’，N’-tetramethyl-uranium-hexafluorophosphate，六氟磷酸邻-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基铀，)、HOBT、DIEA 2-5倍过量情况下，在N，N-二甲基甲酰胺溶液或N，N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷体积比1∶1溶液中活化分子标签，避光加入准备好的肽-树脂反应器中，N₂气搅动下避光反应2-3小时，用异丙醇、二氯甲烷、DMF、甲醇洗涤，真空干燥树脂混合物。
(5)把上述分子标签-肽-树脂混合物用标准多肽切割混合物从树脂上切割下来，切割液离心，取未沉淀的液体，加入冷乙醚析出，用乙醚洗涤，结合外部磁力吸附导引沉淀。
(6)放置得到的聚集沉析物，使残留乙醚挥发完全。
(7)加入双蒸水，充分溶解分子标签-肽，使浓度接近1mg/ml。
(8)将分子标签-肽溶液用近紫外线(365nm)照射2.5-5小时，使分子标签与目标全长肽完全解离。
(9)用磁铁吸附干净磁粒与光可切除的连接物沉析聚集，收集上清液。
(10)冻干上清液得到目标全长高纯多肽，取部分进行HPLC分析和MS检测。
把磁性粒子作为新型分子标签，对常规的固相多肽合成全长目标肽链进行衍生标记、切割，通过外部磁力介导分离，光切除分子标签和最终分离，得到目标全长高纯多肽。本发明所采用的新型标签分子及其介导的固相多肽合成和纯化制备工艺，在分子标签从树脂上切割下来沉析洗涤的过程中就可以把大量截端加帽封闭的干扰序列清除掉，将目标产品进行了纯化。本发明所述的方法解决了目前该领域中困扰人们的关于高效合成和得到高纯级生物活性多肽投入巨大、效率差、困难度大等问题。本发明可以简单、快速的精确合成目的全长多肽，具有低成本，高效率，节省仪器和试剂投入，可以大规模制备的优点。因而本发明弥补了目前高效低成本快速合成和纯化制备高纯度多肽的工艺方法缺陷和不足。
具体实施方式
下面的实施例是结合上述发明内容对本发明做进一步的解释，这些实施例不是对本发明做的任何范围的限制，本领域的技术人员在权利要求的范围内所进行的某些改变和调整也认为属于对本发明的范畴。
实施例1：磁粒子分子标签的合成
称取1克Fe₃O₄磁粒，磁粒外周已经包覆好NH₂末端，末端NH₂摩尔数为1mmol/g，称取2mmol的光可切除连接分子4-Hydroxymethyl-2-methoxy-5-nitrophenoxybutyri Acid(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧化丁酸)，用无水HOBT，DIEA，4倍摩尔数过量情况下，在5ml DMF溶液体系中，活化光可切除分子，把活化5-8分钟的液体加入磁粒子中，避光反应2.5小时，反应完毕，用磁铁吸附沉析出反应连接好的分子标签，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤并沉析各3次，减压干燥备用，得1.32克连接好的磁粒子分子标签。
实施例2：合成制备0.5mmol P23肽
合成制备序列为SKYTESFVAAFKRAGAGVEKAEA-NH₂，序列长度为23个氨基酸的多肽。
称取0.5克替代度为d＝1mmol/g的王树脂，加入多肽反应器，用标准Fmoc偶连方式组装合成多肽，在每一步氨基酸连接完毕用过量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，4-6mL封闭未反应的NH₂末端，阻止截端序列的继续组装合成，在最后一个氨基酸合成完毕切除末端NH₂的保护。
洗干净，使肽-树脂保持湿润，称取2.5克实施例1制备的磁粒子分子标签，在5ml DMF中用HOBT、PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，六氟磷酸-1-氧基三吡咯烷基瞵-苯并三唑)、DIEA 4倍摩尔量作为催化剂活化分子标签，活化5-8分钟，加入肽-树脂中避光反应2.5小时，用标准肽合成洗脱程序洗脱干净树脂，树脂干燥后，用标准多肽TFA切割混合物[(9.5ml三氟乙酸(TFA)：0.4ml苯甲硫醚(thioanisole)：0.4ml 1，2-二巯基乙醇(EDT)：0.2ml苯甲醚(anisole)]避光2.5小时，切割混合物在4000rpm离心弃掉树脂，把上层得到的液体用200ml冷乙醚，在外加磁场下沉析、吸附和聚集，继续用冷乙醚洗分子标签—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子标签缀合物标定，被洗弃去掉，把聚集沉析下来的聚集物，室温下30分钟放置，挥发掉乙醚，加水溶解到纯肽含量到1mg/ml左右，用紫外灯，最好365nm紫外光照射2.5-3小时进行光切割，产生纯净肽和分子标签。外加磁场去除磁粒—光可切除分子标签缀合物，清液中含有纯净全长目标肽，冻干纯净肽得232mg，进行HPLC纯度分析，为96％，MS分子量确证(理论单元子分子量MW＝2416.24，实际测试为2417.52)。
实施例3  合成制备1mmol P38肽
合成制备序列为HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRIKNK-NH₂的序列长度为38个氨基酸的多肽
称取0.5克替代度为d＝0.3-0.8mmol/g的Rink Amide-AM树脂加入多肽反应器，用标准Fmoc偶连方式组装合成多肽，在每一步氨基酸连接完毕用过量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，4-6mL封闭未反应的NH₂末端，阻止截端序列的继续组装合成，在最后一个氨基酸合成完毕切除末端NH₂的保护，洗干净，使肽-树脂保持湿润，称取2.5克实施例1制备的磁粒子分子标签，在5ml DMF中用HOBT、PyBOP、DIEA 4倍摩尔量作为催化剂活化分子标签，活化5-8分钟，加入肽-树脂中避光反应2.5小时，用标准肽合成洗脱程序洗脱干净树脂，树脂干燥后，用标准多肽TFA切割混合物避光2.5小时，切割下的混合物在4000rpm离心弃掉树脂，把上层得到的液体用200ml冷乙醚，在外加磁场下的沉析，吸附和聚集，继续用冷乙醚洗-分子标签—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子标签缀合物标定，被洗弃去掉，把聚集沉析下来的聚集物，室温下30分钟放置，挥发掉乙醚，加水溶解到纯肽含量到1mg/ml左右，用紫外灯最好365nm紫外光照射2.5-3小时进行光切割，产生纯净肽和分子标签，外加磁场去除磁粒—光可切除分子标签缀合物，清液中含有纯净全长目标肽，冻干纯净肽得580mg，进行HPLC纯度分析为92％，MS分子量确证(理论单原子分子量MW＝4548.4，实际测试为4549.95)。
实施例4：合成制备20mmol P12肽
规模合成制备序列为TPQAYPLREAGS-NH₂的序列长度为12个氨基酸的多肽。
称取20克替代度为d＝0.3-0.8mmol/g的王树脂加入多肽反应器，用标准Fmoc偶连方式组装合成多肽，在每一步氨基酸连接完毕用过量乙酸酐按乙酸酐∶DMF＝1∶1(V/V)，40-60mL封闭未反应的NH₂末端，阻止截端序列的继续组装合成，在最后一个氨基酸合成完毕切除末端NH₂的保护，洗干净，使肽-树脂保持湿润，称取50克磁性分子标签，在100mlDMF中用HOBT、PyBOP、DIEA 4倍摩尔量作为催化剂活化分子标签，活化5-8分钟，加入肽-树脂中避光反应2.5小时，用标准肽合成洗脱程序洗脱干净树脂，树脂干燥后，用标准多肽TFA切割混合物[190ml三氟乙酸(TFA)：8ml苯甲硫醚(thioanisole)：8ml 1，2-二巯基乙醇(EDT)：4ml苯甲醚(anisole)]避光2.5小时，切割下的混合物在4000rpm离心弃掉树脂，把上层得到的液体用4000ml冷乙醚，在外加磁场下的沉析，吸附和聚集，继续用冷乙醚洗分子标签—肽3-6次，截短末端加帽肽不能被分子标签缀合物标定，被洗弃去掉，把聚集沉析下来的聚集物，室温下30分钟放置，挥发掉乙醚，加水溶解到纯肽含量到1mg/ml左右，用紫外灯最好365nm紫外光照射5小时进行光切割，产生纯净肽和分子标签。外加磁场去除磁粒—光可切除分子标签缀合物，清液中含有纯净全长目标肽。冻干纯净肽得14.65g，进行HPLC纯度分析为96.3％，MS分子量确证(理论单原子分子量MW＝1288.64，实际测试为1288.75)。