含有截短侧耳素衍生物的微球 本发明涉及含有稳定形式的截短侧耳素衍生物作为抗生素的动物饲料粒(pellet)。本发明也涉及稳定的截短侧耳素衍生物的制备方法、上述的动物饲料粒的制备方法以及其在控制动物感染性疾病方法中的用途。
在下文中，可将截短侧耳素衍生物理解为以含有如下式I大环结构为特征的化合物，
其中R1是乙基或乙烯基，在碳原子1和2之间或者为双键或者为单键，Ra和Rb相互独立，分别为氢或卤素，且T优选为如下文详述的短链或长链的有机基团。
在一些文献中，术语截短侧耳素、万尼菌素、泰妙菌素和mutilins作为同义词应用。在本文中始终应用术语。
对兽医来说，截短侧耳素是目前应用最普遍和有效的抗生素。已知的最具代表性的包括下文中描述的Tiamutin(活性物质：泰妙菌素)及最新的Econor(活性物质：万尼菌素)。这两者均可非常有效地治疗动物呼吸系统和消化道的所有细菌感染性疾病，甚至在因为产生耐药性而不得不将常规抗生素以多种活性药物联合大剂量方式应用的那些棘手情况下也表现出它的有效性。
截短侧耳素的有效菌谱包括如Streptococcus aronson、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、Mycoplasma bovimastitidis、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、支原体属的种、犬支原体(Mycoplasmacanis)、狸猫支原体(Mycoplasma felis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、鸡支原体(Mycoplasma gallinarum)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、A.granularum、人型支原体(Mycoplasmahominis)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、Actinobacillus laidlawii，火鸡支原体(Mycoplasma meleagridis)、溶神经支原体(Mycoplasmaneurolyticum)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)和猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)的病原体。
另外，WO 98/01127描述了万尼菌素对无论何地饲养的动物发生的疾病综合征都有显著活性，如为了运输，占有非常窄的空间(增加了存储的密度)且因此承受较高的压力的动物。在此具有决定性作用的最普通地病原体是猪肺炎支原体、Serpulina(之前为Treponema)hyodysenteria、Serpulinapilosicoli、Lawsonia intracellularis、鸡败血支原体、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、Actinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniae和副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，经常同时伴有呼吸道和其他感染性疾病并形成复杂的临床症状。对所有家养的动物如牛、羊及猪，也包括家禽都有效。
在当今大范围的如猪、牛、马、羊和家禽的家畜的养殖中，对于所提及的动物疾病，不给予抗生素是不可能的，因为除非给予治疗，否则疾病经整批动物迅速蔓延，从而导致不必要的损失。因此，人们急需对在大量牧群感染前能够快速有效控制动物间传染性疾病的抗生素。
尽管截短侧耳素作为抗生素在功效方面满足了人们所有的期望，但是它们有一个不能轻视的共同缺点，即它们在给药形式下的相对不稳定性，而该给药方式由于易于操作对于兽医而言尤为重要。如在WO 01/41758中所讨论的，截短侧耳素、尤其是游离碱形式的截短侧耳素特别不稳定，这使得人们不得不在注射溶液中采用酸加成盐形式，优选为盐酸盐。酸加成盐在室温下可稳定保存五年。兽用的口服给药形式至今却是个例外，即使作为饲料添加剂，也仅仅应用在有限范围内。
而人用抗生素可以极其不同的给药形式给药，如片剂、糖衣片剂、乳剂、注射溶液等，因为可以依赖于患者的服从性及其想康复的愿望，但是对于动物而言，这个方面却是一个要面对的相当实际的问题。
在动物中，必须制备一种能够服用药物的制备物。当然，以动物不得不吞咽或注射的方式给予抗生素从而对单个动物或少量动物进行治疗也是可能的。然而这些强制方式不能被大批动物接受，因为这是高强度的劳动，在个别情况下需要兽医在场，最终导致高成本，而这些成本则因为竞争的存在而无法转嫁给肉或奶制品消费者。因此，在大规模的畜牧场中，需要简便可靠的给药形式，牧场主就能独立操作或甚至完全自动化，并且成本控制在合理的范围内。
一种解决所有这些问题的方法为在动物的干饲料(也就是所说的饲料粒)中掺入准确剂量的抗生素。
当今家养动物和生产性家畜，如猪，以及牛、羊和家禽经常饲养于配备最现代化的全自动饲养系统的动物舍内。在这种情况下，根据动物年龄和体重完全可以自动化地分配饲料并每天在确定的时间将每日确定的量运送给每一个动物且填入它的饲料槽内。所说的饲料粒常应用于这种完全自动化系统中。这种粒是植物和/或动物基的浓缩干饲料，可添加如蛋白、维生素和矿物质的添加剂进行强化。这种饲料粒为简单合成的具有流动性的长的或园的颗粒，或者根据不同的生产方法，将其加工成与动物的种类和年龄相符的统一大小规格的杆状，从用于家禽的几毫米到用于成年猪和牛的约1厘米。商业饲料厂通过将有机原料磨碎、将成分混合成所需的组合物并最后压制成粒状来生产饲料粒的；将饲料粒装入袋内并运送给那些将其添加入分配系统的牧场主。由于这种粒具有规格统一、可流动性和贮存稳定性，所以这种粒的最大优点是易于操作。可轻易地将其从容器内完全自动化地倒出，计量分成小份，经由传送带或管将恰好准确量的饲料粒运输至每一个动物。而且，饲料粒较新鲜饲料占用更少的空间，最重要的是，动物可以自愿地享用而没有任何问题。
因此，不仅将蛋白质和其他如维生素和矿物质的营养素而且将所需的抗生素加入那些饲料粒内都是有益的。在实践中，已经应用这种方式，但是在此讨论的截短侧耳素类活性物质的情况中，这种方式面临着一些具体的困难，这些困难对于此类物质而言是特异的，在下文中将更详细地进行解释。
已经发现截短侧耳素有点儿不稳定，首先，在饲料粒制备中当与饲料原材料(尤其是植物和动物纤维)接触时，相当大部分就已在制备中损失了。在饲料粒制备中，干的动物源性或植物源性的有机原材料被磨碎，与添加剂、维生素、微量元素、抗生素(在此情况下为截短侧耳素衍生物)等充分混合，也就是充分均匀地混合，然后用约5-10％重量的水或水蒸汽润湿，在约60-80℃(优选65-75℃)的高温、约1-100kbar(常用25-100kbar)的高压下压制成粒剂。持久的高温(如100℃)对产生不利效果，大大降低了粒剂的粘性。相反，在此压力内达到200℃的短期局部的温度峰即所说的闪点却没有问题。在此压力下材料停留的时间为约5-180秒，优选10-90秒，可根据粒剂大小而定。
而纯的截短侧耳素可以很好地耐受这种温度，可在室温下存放甚至几个月而没有任何可测得的活性物质的损失，但是在压力下及与饲料中的动物或植物纤维密切接触后以及高温下，它们分解的相对较快。似乎是与纤维的接触催化了分解过程。甚至在技术可能的范围内将高温、高压阶段控制的非常短，压制过程后立即将制成的饲料粒冷却至室温，仍然有1/4-1/3的活性成分丢失。尽管降解产物对对所治疗的动物并无不利影响，但不可避免的活性物质的损失必然导致相当可观的制成物成本的增加。
此外，申请人也已经发现在饲料粒中还保存完好的截短侧耳素与如纯的活性物质相比贮存稳定性更差。制成饲料粒中的活性成分甚至在室温下仍继续降解。三个月后，活性成分含量已经降低至少于60％。现今，这种相对的不稳定性也意味着饲料粒中的活性物质的准确给药剂量仅仅维持在饲料粒制成后约4-6周这一段时期内。因此，现今的牧场主不得不只用刚刚制成的饲料粒。他们不能长期贮存大量的饲料粒，所以不得不大约每4-6周向饲料厂发出新的产品订单来确保有新的含有确实有效抗生素含量的饲料的供应。尽管这在技术上可行，但实际上它需要精密的后勤计划，且使饲料厂不得不重复履行不适合他们生产安排的小额订单，且引起不便的等候时间，尤其是引起饲料粒成本额外的增加。
因此，鉴于上述原因，在截短侧耳素稳定性方面做了很多努力，使其在饲料粒制备过程中能够耐受高温高压而无活性物质的损失，且制成的饲料粒具有适于实际应用的长期贮存稳定性。
这种稳定性尝试失败的例子包括：(1)通过压制成颗粒缩小活性成分的表面积，尝试了各种大小的颗粒；(2)用各种各样的保护层密封上述活性成分颗粒，如明胶或各种糖及包衣；(3)用各种如纤维素、淀粉、硅酸或沸石的多孔物质将活性成分包裹，有或无额外的保护层；以及(4)活性物质的基本的大环结构的化学修饰。尽管在一些情况下化学修饰改进了化合物本身的稳定性，但同时也使活性丧失。
然而，这些尝试一个也没有做到在压制饲料粒时能够减少活性成分的损失或者在贮存稳定性上有较大的改进。然而，申请人现在已经取得了令人惊奇的成功，使得使用者可将饲料粒以这样一种形式方便地给药，即其中的活性成分不再出现上述缺点。令人惊讶地是，目前可能使截短侧耳素稳定，这些截短侧耳素不仅可以抵御饲料粒制备过程中的破坏作用，而且也可在极长的期间内保存。
尽管在下文中参照万尼菌素的具体实施例对本发明进行了说明，但是，同样也可适用于Tiamutin/泰妙菌素和其他具有如本文开头所示的式I基本的大环结构的截短侧耳素衍生物。
在本发明的上下文中，优选如下式I的截短侧耳素，包括其生理学上可接受的酸加成盐及季铵盐
其中R1为乙基或乙烯基；
(A)碳原子1和2之间为单键，Ra和Rb为H，T为如下a-i基团中任意一个：
a)-CH2-OH；
c)-(CH2-X)m-(CH2)n-N(R2)(R3)，其中X为-O-、-S-、-NH-或m为0或1；n为2-5的整数；R2和R3相互独立，
分别为C1-6烷基，或者与它们所连接的氮原子一起形成含有-S-、-O-或-N(R4)-(其中R4为C1-6烷基或C1-6羟烷基)的杂部分的五元或六元杂环，且Y和Z相互独立，分别为-O-或-S-；
d)-CH2-S-(CH2)k-N(R5)(R6)，其中k为2-5的整数；R5和R6相互独立，分别为C1-6烷基；
e)-CH2-S-C(CH3)2-CH2-NH-C(O)-R7，其中R7为-NH2取代的C1-6烷基，或者为饱和的含有一个或两个选自-S-和-NH-的杂原子的五元杂环；
f)-CH2-S-C(CH2)l-R8，其中l为0或1，且R8为其中K为H、C1-6烷基磺酰基、-NH2、-CHO、-N(R9)(R10)、-S-(CH2)q-N(R9)(R10)或-C(G)-NHR11，G为氧或硫，R9和R10相互独立，分别为H、C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基；C1-6羟烷基、C1-6二羟烷基或未取代的或C1-6烷基磺酰基取代的C1-6烷酰基；或R9和R10与它们所连接的氮原子一起形成未取代的或取代的哌嗪基，其中第二个氮原子可由选自C1-6烷基、C1-6羟烷基和C1-6二羟烷基的取代基取代；R11为C1-6烷基或C1-6烷基羰基；Q为H、-NH2、-CF3、C1-6烷基、吡啶基或-N(R9)(R10)，R9和R10如上所述；
g)-CH3、-CH2Cl、CH2Br、-CH2SCN、-CH2-NH2、-CH2-N3、-CO-OH、-CH2-OCOCH3或
h)-N(R15)(R16)，其中R15和R16相同或不同，选自H，未取代或取代的直链或支链饱和或未饱和的C1-6烃基的基团；未取代或取代的饱和或未饱和的C3-8环烷基基团；未取代或取代的杂环；以及未取代或取代的芳基基团；或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成一个不含有其他杂原子或含有选自-N-、-O-和-S-杂原子的三元至八元环；或者R15为上述基团之一，且R16为-SO2R17、-C(O)R18、-O-R19或N(R19)(R20)；R17选自未取代或取代的直链或支链饱和或未饱和的C1-6烃基基团，未取代或取代的饱和或未饱和的C3-8环烷基基团，未取代或取代的杂环，未取代或取代的芳基基团，未取代或取代的C1-6烷基氨基基团以及未取代或取代的芳基氨基基团；R18选自H，未取代或取代的直链或支链饱和或未饱和的C1-6烃基基团，未取代或取代的饱和或未饱和的C3-8环烷基基团，未取代或取代的杂环以及未取代或取代的芳基基团；R19和R20相同或不同，选自未取代或取代的直链或支链饱和或未饱和的C1-6烃基的基团，未取代或取代的饱和或未饱和的C3-8环烷基基团，未取代或取代的杂环以及未取代或取代的芳基基团，或者R19和R20与它们所连接的氮原子一起形成一个任选含有选自-N-、-O-和-S-杂原子的三元至八元环状基团；
(B)碳原子1和2之间为双键，且Ra和Rb为H，T为如下基团i：
i)-CH2-CO-R12，其中R12为未取代或取代的含氮的五元或六元杂环，未取代或取代芳基基团或-CH2-R13基团，R13为卤素或-SR14，且R14为氨基-C1-6烷基，或者未取代或取代的含氮的五元或六元杂环或者未取代或取代的芳基基团，上述杂环或芳基基团的取代基为选自1-3个选自下列的基团：OH、CN、NO2、N3、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、二-N-C1-6烷基氨基、C1-6酰基氨基、C1-6酰基羰基氨基、C1-6酰氧基、C1-6氨基甲酰基、一-N-和二-N-C1-6烷基氨基甲酰基、C1-6酸基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚硫酰基和苯甲基；
(C)碳原子1和2之间为单键，Ra为H、OH或F，且Rb为H；或者Ra为H且Rb为F，T为如下基团k：
k)-CH2-CO-R12，其中R12如基团i所定义。
通过已知的方法，式I的游离化合物可被转换成它的酸加成盐，反之亦然。在酸加成盐中，最优选盐酸盐。同样通过本身已知的方法，可制备季铵盐。
除非另外说明，取代基的定义是以普通化学领域的技术人员通常理解的内容为基础的。在上式I的上下文中，根据碳原子的数目，烷基本身或作为其他取代基的一部分为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基等。“卤素”为氟、氯、溴或碘；优选氟、氯或碘且更优选氯。
优选含有一个或多个杂原子(优选硫和氮)的饱和或未饱和的五元或六元杂环。更优选含有1、2或3个氮原子而没有其他杂原子的这种杂环的亚基团。其中，尤其优选那些仅含有一个氮原子作为杂原子的未饱和的五元或六元杂环，如吡啶、吡咯及5，6-二氢-3H-吡咯。适当的含有两个氮原子的未饱和的五元或六元杂环为如咪唑、哒嗪和嘧啶。这种环上也可有一个或多个苯环与其稠合。苯并咪唑、喹啉、异喹啉和2，3-二氮杂萘为典型示例。适当的含有三个氮原子的五元或六元杂环为如1，2，4-三唑。另外优选含有一个氮原子和一个硫原子的杂环基团。包括如各种噻唑、4，5-二氢噻唑和苯并噻唑。1，3，4-噻二唑是含有两个氮原子和一个硫原子的杂环的典型示例。除非特别说明，芳基或芳基基团(尤其是苯基或萘基)可以是未取代的或者可以携带多达4个选自下列的相同或不同取代基：OH、硝基、氨基、氰基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、卤代C1-6烷基、一-N-C1-6烷基氨基、二-N-C1-6烷基氨基、C1-6酸基、C1-6酰氨基、C1-6酰基羰基氨基、C1-6氨基甲酰基、一-N-和二-N-C1-6烷基氨基甲酰基、C1-6酰基氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚硫酰基和苄基。除非特别说明，适当的取代基与条环的取代基相同，同样，杂环基也可由相同或不同的基团取代一次或多次。尤其优选的杂环基为：3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶-2-基、1，3，4-噻唑-2-基、苯并噻唑-2-基、2H-1，2，4-三唑-3-基、氮杂双环庚基、氮杂双环辛基及哌啶基。
本发明尤其涉及如下定义的式I化合物，包括其生理学上可接受的酸加成盐及季铵盐，其中R1为乙烯基，碳原子1和2之间为单键，且Ra和
Rb为氢或卤素，优选氢，T如式I所定义。
特别优选如下定义的式I的截短侧耳素衍生物，包括其生理学上可接受的酸加成盐及季铵盐，其中
R1为乙烯基；碳原子1和2之间为单键；
Ra和Rb为H，且
T为-CH2-S-(CH2)k-N(R5)(R6)，其中k为2-5的整数；且R5和R6相互独立，分别为C1-6烷基。其中，最优选T为-CH2-S-(CH2)2-N(C2H5)(C2H5)的截短侧耳素衍生物。
同样优选如下定义的式I的截短侧耳素衍生物，包括其生理学上可接受的酸加成盐及季铵盐，其中
R1为乙烯基；碳原子1和2之间为单键；
Ra和Rb为H，且T为-CH2-S-C(CH3)2-CH2-NH-C(O)-R7，其中R7为-NH2取代的C1-6烷基或者饱和的含有一个或两个选自-S-和-NH-的杂原子的五元杂环。其中，优选T为-CH2-S-C(CH3)2-CH2-NH-C(O)-R7的截短侧耳素衍生物，其中R7为-NH2取代的C1-6烷基，更优选T为-CH2-S-C(CH3)2-CH2-NH-C(O)-CH(NH2)-CH(CH3)2的截短侧耳素衍生物。
因此，在本发明的上下文中，优选化合物泰妙菌素和万尼菌素，鉴于其广谱活性，最优选万尼菌素。如上所述，两种药物已在商业上应用。这两种优选药物的化学结构如下：
文献中已详细描述式I化合物，如下仅供参考：
其中R1和A如式I所定义，T如基团a中定义的式I化合物由Kavanagh等分离得到并在Proc.Natl.Acad.Soc.37，570-574(1951)描述。该化合物基本上代表了在此讨论的这类物质，即截短侧耳素。在美国专利4 247 542中指出稍后发现的截短侧耳素的结构特征在于，上述式I中的Y为-CH2-OH。同一美国专利也描述了R1为乙烯基，碳原子1和2之间为单键，Ra和Rb为H，且T为-CH2-β，D-吡喃木糖基的式I化合物。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团b的式I化合物在美国专利4 129 721中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团c的式I化合物在美国专利4 148 890中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团d的式I化合物在美国专利-3 919 290中描述，包括已经特别提及几次的泰妙菌素，其商品名为Tiamutin。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团e的式I化合物在欧洲专利0 153 277中描述，包括已经特别提及几次且也已经从WO 98/01127中了解的万尼菌素。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团f的式I化合物在美国专利-4 428 953中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团g的式I化合物在美国专利-3 979 423中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团h的式I化合物在WO97/25309中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团I的式I化合物在WO01/14310中描述。
其中R1和A如式I所定义，T定义为基团k的式I化合物在WO01/14310中描述。
可以理解，在这些参考文献中特别提及的每个实施例均包括在本发明优选的实施方案中。
文献中公开了一系列将药物(包括泰妙菌素)加入动物饲料的试验，但是这些试验不能解决本发明提出的技术问题。如下简要讨论一下某些参考资料：
欧洲专利0 165 577涉及含有锌杆菌肽的饲料添加剂，当与饲料混合后或制粒时，锌杆菌肽增强了稳定性并可能延长存放时间。通过给含有锌杆菌肽的饲料添加剂提供聚合包衣使稳定性获得改进，如多糖、聚丙烯酸盐、脂肪、脂肪类化合物或石蜡被用作锌杆菌肽的聚合包衣。
1991.04.26的Derwent Publication XP002197610[JP 03 101619 ASDS BIOTECH CORP]涉及一种由沸石载体和泰妙菌素组成的无苦味的颗粒形式的兽药。
1988.02.13的Derwent Publication XP002198060[JP 63 033330 ANIPPON KAYAKU KK]涉及泰妙菌素的口服抗菌药给药形式，以聚丙烯酸钠为基础，可使活性成分吸收量增强。给药形式包括粉末，其也可压制成颗粒或片剂并与动物饲料混合。
欧洲专利0 707 798描述了含有药用活性物质的饲料的制备方法。该方法的特征在于，将药用活性物质单独或以在适当的盖伦凝胶形式的制剂中的混合物以可喷雾凝胶形式喷雾于以物理方法制备的饲料上。
欧洲专利申请EP-0 658 313描述了由芯和包衣制备的颗粒。芯由如植物的有机物质或者无机物质制备而成，且直径为100-800μ。包衣由含有活性成分的水溶性聚合物制备而成，其中的聚合物可溶于水、尤其胃液。将活性成分掺入包衣内或与其粘附。在生产过程中，首先制备芯。芯的表面用酸处理，然后喷上活性成分的水溶液。目的是制备能够毫无困难地与动物饲料混合的细颗粒。但是，与本发明相反，在该参考文献中所描述的颗粒不能使活性成分具有显著的稳定性，因此不适合于含有截短侧耳素衍生物的动物饲料粒的制备。不仅如此，还与本发明不同的是，活性成分在胃内释放。
申请人现已惊奇地发现，可通过已知的方法将截短侧耳素衍生物包于微球中；可将这些微球掺入干动物饲料中并在高温高压下压制成饲料粒，随后烘干，而无现有技术中的不可避免的活性物质的损失。而且，新获得的饲料粒中活性物质具有很高的稳定性，所以最终饲料的贮存稳定性极高。在室温下，这种饲料粒可持续存放几个月，也就是说，活性成分的含量基本上是不变的。
微球中所包含的活性物质不仅使稳定性有了不曾预料的提高，而且与纯活性物质的相比，更有利于微球不形成粉尘，不形成团块，具有显著的流动性并保护活性物质免于不必要的外界影响。因此，例如可避免在操作中无意间吸入或接触皮肤和眼睛。由于活性物质包含于微球内，所以，万一人误服用了，可简单安全地处理而不需要采用特别的防护措施。因为微球基本上对设备的表面不具有粘合性，并且既不形成团块或硬结也不以任何方式粘结，所以在饲料生产厂中，可以毫无技术困难地清洗所用的设备；简单的真空清洗通常足够了。
而且，使用这些微球还具有另外的优点。当口服给予抗生素时，在敏感病人中发现治疗过程加重了食欲衰退。那么医生可以根据情况的严重程度，换成其他的不通过胃的给药形式，如针剂或栓剂。在动物中，在个别情况下发现了相同现象。食欲衰退表现为拒绝吃足够量的饲料。而且，饲料的代谢较差，也不出现所希望的体重增加。因为这些动物吃的饲料更少，所以，口服治疗也无效。对于动物，也不能选择变换成栓剂，而且针剂具有上述的缺点，本发明的目的就是要解决这些问题。根据本发明，当口服应用微球时，未发现所说的过敏及伴发的拒绝进食，因此推测与微球的基质的抗酸性有关。
生物利用率的研究显示，微球可以完好无损的通过胃，活性成分仅在碱性环境的肠腔内释放。在小猪中进行下列对比饲料试验：用a)含有游离的盐酸万尼菌素的饲料粒或者商用的ECONOR进行，以及用b)根据实施例2所制备的饲料粒进行，该饲料粒在微球中包裹有盐酸万尼菌素，每小时抽取试验动物的血样并测定血浆内万尼菌素的浓度，发现：在a)的情况下，在给药2-3小时后，活性成分的浓度迅速升高达到最高值。8-10小时后，曲线开始回落并接近零。在用微球进行处理的b)情况下，延迟约1-2小时后活性成分的浓度开始增加，约3-4小时后达到最大值，约10-12小时后开始回落至零。因此，尽管在b)情况下达到有效血浆浓度的时间稍微延迟，但是，这对治疗并没有不利影响。这种新的方法产生了有价值的给药方式，该给药方式对胃无刺激并且使口服治疗更有效。如果需要，通过添加如碳酸氢钠的添加剂，可使本发明的微球在胃的酸性环境中溶解并释放活性物质。然而，在多数情况下是不需要的。
在本发明的上下文中，微球可以理解为直径微小、绝大部分的微粒平均大小约为1-5000μm的球形聚合基质颗粒，通常为50-3000μm。截短侧耳素衍生物包含于其中。因此，它们是极小的球体，其中包括紧密的聚合基质，而所述活性成分以固体或液体形式高度分散于该结合基质中，而不仅仅是被包衣。也可能描述为一种特殊的包囊形式。
本发明中制备微球的方法本身是已知的；同样，用于制备胶囊的原料和所用的截短侧耳素衍生物也是已知的。然而，以该种方式制备微球则是首创，因此，含有这些微球的饲料粒及其在动物中抗感染性疾病的口服用法都是新的。
微球的制备可以以类似于如下提及的文献中的方法进行：
Shigeru Goto等，Journal of Microencapsulation，1986，第3卷，第4期，第293-305页；
Shigeru Goto等，Journal of Microencapsulation，1986，第3卷，第4期，第305-316页或者美国专利3 714 065(相应于DE-2 105 039)。
本发明在微球的制备或截短侧耳素的口服应用方面涉及较少，而本发明的重点在新的饲料粒，该饲料粒含有在微球中稳定存在的截短侧耳素衍生物，因此在制备或储存中无明显的活性成分的丧失。本发明在于使饲料粒中的活性成分稳定。本发明试图帮助所属领域的技术人员解决现存的技术问题，为其提供可在相当长的时间内储存含有截短侧耳素的饲料粒并将这些饲料粒给予家庭养殖及生产性家畜的方法，同时不需要大量的人员、时间和后勤。最后，不仅在实践中节省时间和金钱而且十分明显地增加了安全性和可靠性。
在由有机相或有机-水相(第一相)和油相(第二相)组成的双相系中，可以方便地制备微球。有机或有机-水相由适于形成微球的聚合成分的溶液或分散液、溶剂和待包裹的截短侧耳素衍生物组成。油相为在适当油中分散的单硬脂酸铝、二硬脂酸铝、三硬脂酸铝、硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁的分散液，所述适当的油优选为液体石蜡或硅油。另外，也可用非离子性的，如失水三梨糖醇单油酸脂(Span-80)的分散剂或乳化剂。油相体积最好大于有机相体积几倍。通过强劲的搅拌使两相充分混合，甚至可在高压或静态搅拌器的帮助下达到均化。在此过程中形成微小的聚合微粒。微球中包含高分散形式的活性成分，且微球在反应混合物中不溶解，所以可通过滗析或过滤分离、洗涤及干燥。
两相的搅拌对于形成微球也很重要。通常而言，可使用具有螺旋桨形状的搅拌棒的搅拌装置，转速至少约为100-1500rpm，以保证两相间充分的混合并迅速形成微球。当然，也可使用静态混合器。
制备微球的详细步骤如下：
(a)制备适于形成微球的聚合物溶液，聚合物选自紫胶和以纤维素、丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酐、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇为基础的聚合物，这可通过在对石蜡油或硅油有低亲和力且介电常数约为10-40的有机溶剂中溶解紫胶或聚合物进行，适当时，可加水；
(b)在搅拌下将截短侧耳素衍生物掺入到紫胶或聚合物溶液中，形成不与石蜡油或硅油相混溶的第一相有机相；
(c)在强劲搅拌(如使用静态搅拌器或高压均化器)下，将第一相掺入第二相(由石蜡油或硅油组成的油相)，并继续搅拌所得混合物直到溶剂蒸发或去除后形成含有截短侧耳素衍生物的微球；
(d)分离，并且如果适合，可洗涤和干燥微球。
在制药工业中，紫胶被熟知，可用于制备天然味的糖衣片剂的糖衣。
对纤维素基的聚合物来说，适当的原料为乙酸邻苯二甲酸纤维素或N，N-二-正丁基羟基丙基醚乙酸纤维素。
丙烯酸或甲基丙烯酸基的聚合物所用的原料为如甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸共聚物、2-甲基-5-乙烯基-吡啶/甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯/马来酐共聚物或者甲基丙烯酸甲酯/马来酐共聚物。
对马来酐基的聚合物来说，适当的原料为乙烯甲基醚/马来酐共聚物或者苯乙烯/马来酐共聚物。在本发明的上下文中，特别优选丙烯酸或甲基丙烯酸基的聚合物作为微球的外壳。最好使用商用产品进行制备。这些产品为丙烯酸和丙烯酸酯聚合的产物，其中含有少量季铵基团。来自德国Darmstadt的Rhm的EudragitE、L或S的商业产品非常适合。EudragitE是甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯及中性的甲基丙烯酸酯的阳离子型聚合物。EudragitL和S是甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子型聚合物。
对聚乙烯吡咯烷酮基的聚合物来说，适当的原料为聚乙烯吡咯烷酮。
对聚乙烯醇基的聚合物来说，适当的原料为聚乙烯醇本身。
使用相当大量的油相，使有机相/油相的体积比约为1/20-5/10。
通常而言，在室温或略高的温度下即约20℃-45℃温度下进行操作。然而，室温是完全足够的。
对第一相有机相来说，适当的有机溶剂为与油相尽可能不相混溶且易挥发的溶剂。这些溶剂的介电常数在10-40为最适合。在下表中示例了许多这种溶剂。
溶剂 介电常数 溶剂 介电常数
甲醇 32.6 苯酚 9.8
乙醇 24.3 丙酮 20.7
异丙醇 18.7 乙酸 9.7
丁醇 17.1 酸酐 20.7
苯甲醇 13.1 硝基甲烷 35.9
乙二醇 37.7 乙二胺 14.2
丙二醇 35.0 酸溶纤剂 16
可用单一溶剂或这些溶剂的混合物，如丙酮-乙醇混合物(1∶1)。加入少量的水可达到较佳效果，即约1-5份体积的水配10-50份体积的有机溶剂。优选丙酮-水混合物(约30∶1)。
已经证实，在使用前向第二相(油相)中加入单硬脂酸铝、二硬脂酸铝或优选三硬脂酸铝、硬脂酸钠、硬脂酸钙、硬脂酸镁或其他如失水三梨糖醇单油酸脂(Span-80)非离子型的乳化剂或分散剂是有利的，强劲搅拌使分散液均匀。这种添加方式尤其促进了大小均匀的微球的快速形成。结果所形成的微球预防了在制备过程中彼此的聚结。当含有聚合物的截短侧耳素衍生物的第一相由丙酮-水混合物制备而成并且在800-1000rpm的转速搅拌下将两相混合时，那么可得到50-1000μm大小均匀的微球。截短侧耳素和硬脂酸盐的重量比优选为0.5/1-10/1，更优选约1∶1。
可用乙醚、石油醚或正己烷、甲基环戊烷或者优选环己烷洗涤微球。在真空、室温下极其温和地去除溶剂。不言而喻，溶剂去除后剩余物应尽可能地低。
通过上述方法所获得的微球有相对坚固的聚合外壳。为了获得较大的柔软性，可向有机相内加入约3-10％的增塑剂，基于聚合物重量计。适当的增塑剂为三醋精；乙酰化的单甘油酯；甘油；如PEG400或PEG600的聚乙二醇；如邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二丁酯的邻苯二甲酸酯；如柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰三乙酯、柠檬酸三丁酯或柠檬酸乙酰三丁酯的柠檬酸酯；以及如蓖麻油、菜籽油或葵花籽油的植物油。可使用约4-10％的柠檬酸三乙酯。然而，通常不必添加增塑剂，因为已发现增塑剂的比例越高，最终饲料粒的贮存稳定性越差。因此，增塑剂的添加在稳定性的改善上起反作用，但也不意味着，不能加入增塑剂，尤其是相对少量的增塑剂。增塑剂降低了玻璃化转变温度。所以，根据本发明人的经验，当玻璃化转变温度低于约100-150℃时，在饲料粒的制备中活性成分不再受到保护。
经常由饲料厂生产饲料粒。通常以粉状谷物为基质。在此基质中，加入如油和植物以及动物蛋白的额外成分。所有成分在研磨或混合设备中充分混合，用水喷洒或蒸汽处理并且在高温下通过直径约2-15mm的圆形喷嘴挤压，即压制。在压制过程中，湿润原料被压实，且以相对硬的棒状形式离开喷嘴，在喷嘴出口处用切割装置切成所需要长度的块，如约5-25mm长度。获得的还是温热的饲料粒在被运输走的过程中在空气中干燥，或者放到传送带上通过加热室在约80-120℃下干燥。制成的饲料粒为棒状或圆柱状；它们有相对光滑的表面并易于倾倒而无破碎或粉尘形成。它们通常的密度约为1.2g/cm3。
通常，根据本发明，制备稳定化的饲料粒的方法并不与不添加药物的常用饲料粒的制备方法完全相同。但是，不管是何种方法，在压制过程前均需将微球和粉末状均化的有机饲料成分充分混合在一起，用约5-10％重量的水或蒸汽湿润并在约60-80℃(优选65-75℃)的高温下压制成饲料粒。当饲料粒首先和相对小部分的其余饲料成分充分混合后，由此获得一个所谓的含有相当大的比例的微球的预混合料时，则最有利于达到良好的均化作用。然后，将一部分预混合料与其余的饲料原料混合形成另外的混合物，在最后一步，将这部分混合物用另外的饲料原料稀释成最终浓度。该稀释使饲料粒内包裹的活性成分分布特别均匀。
将饲料粒冷却到室温并且装入纸袋或其他适当的容器内贮存或运送到最终的消费者。无需特别的预防措施，因为饲料粒贮存时非常稳定并且所含有的活性成分在一层包衣中，从而防止了外界对活性成分的影响。无活性成分能够成功地溢出这些贮存的饲料粒的外面。
在压制成饲料粒的前后对活性成分的量的测定表明，使用造粒制备的微球令人惊奇地没有导致任何可测得的活性成分的损失。
实施例的实施
实施例1：甲基丙烯酸树脂包裹的盐酸万尼菌素的制备
成分 重量
盐酸万尼菌素(活性物质) 12.5g
赋形剂
EudragitL 100* 37.5g
单硬脂酸铝 11.25g
水 9.4g
丙酮 303.1ml
轻质液体石蜡 1250ml
总重 1351.94g
*Eudragit是Rhm的商业产品。它由甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸(2-二甲基氨基乙基)酯和甲基丙烯酸甲酯共聚物制备而成。
步骤1：在室温、搅拌(800rpm/5分钟/磁力搅拌器)下，在玻璃烧杯内将Eudragit分散于100ml丙酮中。在相同条件下继续搅拌分散液并加入水。10分钟后，聚合物完全溶解。逐份加入本活性物质万尼菌素同时继续搅拌。再过10分钟后，得到清澈的溶液。
步骤2：在带有3刃螺旋搅棒(1000rpm)的2升反应器中，在室温下将单硬脂酸铝分散于轻质液体石蜡中。10分钟后分散液均匀。
步骤3：在室温下，将在步骤1中所获得的溶液加入步骤2所获得的分散液中，同时继续搅拌(1000rpm)。在室温下将所形成的乳液进一步搅拌(800rpm)24小时。(或者，也可首先将乳液在1小时内、在200mbar的压力下加热至40℃，然后维持2个小时)。在两种情况下，都形成包裹了活性物质的微球，即由甲基丙烯酸树脂制备而成的微球。
步骤4：停止搅拌后，微球下沉到反应器的底部，尽可能完全地倒出上层的石蜡和单硬脂酸铝。用环己烷洗涤微球几次(3次/瓷漏斗/织物过滤膜)并且在真空中去除过量的环己烷。
实施例2：用于猪饲养的饲料粒的制备：(小猪饲料)
将80g的活性物质(万尼菌素)加入3920g常用的粉末状均质的小猪干饲料中并用螺旋搅拌器充分混合。通过这种方法得到4000g的预混合料。在100升螺旋混合器中将4000g的预混合料加入到另外的36kg常用的粉末状均质的小猪干饲料中，以同样方式充分混合。然后，将所得到的40kg的部分混合物混合入另外的360kg常用的粉末状均质的小猪干饲料中，转入挤压机中并在68-72℃、10-100kbar压力下压制成约10mm长、6mm宽的棒状饲料粒。在压制过程中，使用蒸汽(2bar，136℃)。在挤压机加热部分的保留时间约为75秒。将制成的粒以每袋25kg装入各袋内。
实施例3：由游离活性成分、商用包衣的活性成分或者微球包裹活性成分组成的饲料混合物的稳定性试验
根据制备实施例2，将不同预处理但相同含量的活性成分制备三种小猪饲料粒A、B和C。A型饲料粒包括商用ECONOR50％(活性成分为万尼菌素)，其活性成分用羟丙基甲基纤维素(HPMC)包裹。B型饲料粒包括单一活性成分盐酸万尼菌素，C型饲料粒包括根据制备实施例1所制备的含有盐酸万尼菌素的微球。
对于稳定性的测定，依照制备实施例2制备三种饲料粒，并在制备完成后立即取出第一批样品，每种各50g。取A型样品、B型的样品各9个，对于C型需制备三种不同批次的饲料粒，彼此在饲料原料的成分上稍微不同。同样，从每个批次中取9个样品。立即检验所有样品并通过分析确定未降解的万尼菌素的含量。将剩余饲料粒等分为两份，转入两个气候变化的箱内用于长期研究。箱(I)为25℃，相对湿度为60％，模拟室温下的正常贮存。箱(II)为40℃高温，75％高的相对湿度，模拟长期贮存的情况。
以一个月的间隔，从每个箱室中的每个型号和批次的饲料粒中取出3个各50g的样品，并测定未降解的万尼菌素的含量。
如下表1和2列出不同气候条件下所测定的平均值及其标准差。
表1：25℃/相对湿度60％
数据[万尼菌素％/(标准差)]造粒后当时一个月后两个月后六个月后A型98.36％76.68％70.54％37.31％
ECONOR50％，HPMC/(9.28)/(2.56)/(1.38)/(1.39)B型盐酸万尼菌素78.38％/(8.66)43.55％/(15.37)47.30％/(1.00)26.62％/(0.87)C型包含于微球内的万尼菌素102.93％/(6.49)99.69％/(3.18)99.20/(2.11)96.22％/(3.91)
表2：40℃/相对湿度75％
数据[万尼菌素％/(标准差)]造粒后当时一个月后两个月后六个月后A型ECONOR50％，HPMC98.36％/(9.28)38.72％/(2.28)25.35％/(1.13)6.83％/(0.96)B型盐酸万尼菌素76.38％/(8.66)34.65％/(15.98)15.33％(0.24)9.14％/(0.90)C型包含于微球内的万尼菌素102.93％(6.49)96.42％/(1.74)89.12％/(3.19)79.70％/(6.62)
上表十分清楚地表明，存在于A、B和C型饲料粒中的万尼菌素的稳定性是不同的。纯万尼菌素(B型)明显地降解最快，且在造粒过程中已经损失约21％。在通常的室温下两个月后，B型中的万尼菌素含量降至少于50％，且在40℃高温下甚至降至少于20％。A型用HPMC对万尼菌素进行包衣，万尼菌素的降解确实少一些，但是依然相当大。在造粒过程中1％的活性成分的损失可以忽视，但是，在25℃下贮存两个月后，则造成约30％的显著损失，在40℃下甚至达到约76％。相反，活性成分包含于微球中的C型饲料粒的活性成分损失明显减少。在25℃下两个月后，仅损失约1％，在40℃高温下仅损失约11％。在C型的情况下甚至6个月后，几乎80％的活性成分依然存在，而在另两种情况下活性成分的含量降至10％以下。
人们无法预料饲料粒中的活性成分的稳定性显著增加，尤其是因为在未压制的饲料中掺入微球并不能产生任何稳定作用。在未压制的饲料中，未保护的万尼菌素和微球内万尼菌素表现形式完全相同且损失完全相同。
备注：在本申请提交时，上述试验仍在进行中；另外的数据将在未来几个月得到。