促进生长的含二肽基肽酶IV抑制剂的药物组合物 本发明涉及促进动物生长，如发育不全的人的生长以及促进组织修复和再生的活性物质和组合物。
DP-IV抑制剂
二肽基肽酶IV(DP-IV，也称为二肽基氨基肽酶IV，DPP-IV，DAP-IV，EC3.4.14.5)是一种丝氨酸肽酶，它裂解肽和蛋白质的氨基末端二肽。它识别其中N-末端序列是X-Pro或X-Ala的底物。DP-IV抑制剂被推荐用于治疗炎性疾病和AIDS的治疗剂。已知的DP-IV抑制剂通常都是底物的类似物。DP-IV抑制剂的实例公开于DD 296075 A5(Neubert等人，1991年11月)、WO 91/16339(Bachovchin等人，1991年10月)、WO 93/08259(Bachovchin等人，1993年4月)、WO 95/15309(Jenkins等人，1995年6月)、WO 98/19998(Villhauer，1998年5月)、WO 99/46272(Scharpe等人，1999年9月)和WO 99/61431(Demuth等人，1999年12月)。WO 99/67278和WO 99/67279(均为Demuth等人，1999年12月)中还记载了某些这类抑制剂的前药。
下表列出了常见类型的DP-IV抑制剂化合物和其具体实例，它们在本发明的应用中是优选的；表中还给出了公开较宽范围的此类化合物的专利文献号并画出了化合物实例的结构。应该强调的是，所引用的DD和WO说明书中公开的所有DP-IV抑制剂均可用于本发明，参考文献是指这些先有说明书中关于通式和相关的更具体的结构式以及单个化合物的全部信息。例如，按照所示文献的教导，下表中所示的吡咯烷和噻唑烷环可被许多不同环大小的其它杂环替换和/或所示氨基-酰基部分可被多种其它的结构部分替换，从而得到可用于本发明地其它DP-IV抑制剂。
生长激素的作用
生长激素(GH，生长激素)是由脑垂体响应下丘脑生长激素释放激素(GHRH)信号而分泌的。人GH的最丰富的异构形式是191-残基肽，而GHRH是44-残基肽。GH是促进儿童正常发育的关键因子，GH缺乏可导致侏儒症。尽管成年人和儿童具有相似的血浆GH水平，但GH对成年人的重要性尚缺乏良好的定义。GH可能在损伤后的组织修复中起着作用。
目前对于GH缺乏的治疗选择包括施用合成GH或者施用GHRH。但由于这些激素是肽，因此不能通过口服给药。给药一般通过注射进行，虽然开发了无针注射系统，但注射仍使患者感到痛苦(尤其是对于儿童)。
另外，一次注射GHRH仅大约相当于下丘脑一次脉冲释放量的该激素。总而言之，由于这两种激素都是相对较大的肽，GHRH、尤其是GH的生产成本较高。因此，对促进GH作用的治疗剂仍有需求。现在我们发现DP-IV抑制剂可提高循环GH的浓度。
第一方面，本发明是一种治疗侏儒症和低于正常生长(例如，儿童中)的，以及促进组织修复(如，损伤后)的药物组合物，该组合物的特征在于含有DP-IV抑制剂。第二方面，本发明是一种DP-IV抑制剂的新用途，即在治疗侏儒症和组织损伤中的用途。第三方面，本发明是一种改进的促进儿童生长和损伤组织再生的方案，其中给所述受治疗者施用含DP-IV抑制剂的组合物。
与目前涉及GH或GHRH的治疗方案相比，以这种方式使用DP-IV抑制剂具有许多优点。GHRH，尤其是GH是从天然资源(例如，动物脑制品)分离的或者用重组细胞培养制备的大分子肽。人们注意到，从动物源中分离需承担疾病传播的风险，同时还存在抗原性蛋白污染物。重组激素不易传播人类病原体，但仍有可能被抗原性蛋白污染。GHRH可通过合成制备，但这类合成成本高并且需要仔细纯化产物。相反，DP-IV抑制剂是很容易采用标准合成方法获得的小分子。它们是非抗原性的，易于纯化并且便宜。
DP-IV抑制剂的另一个优点是，在许多情况下，口服给药后仍具有生物活性。这与GH和GHRH不同，后两者都必须通过注射给药。因此，使用DP-IV抑制剂是侵入性较小的方案，患者不太会紧张。
第一方面，本发明提供一种治疗低于正常发育或侏儒症的药物组合物。该组合物对于由于生长激素缺乏引起的低于正常发育或侏儒症的治疗特别有效。本发明还提供促进组织再生的组合物。这些组合物的特征在于它包含DP-IV抑制剂。该组合物也可包括，例如本领域通常已知的可药用赋形剂，如稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、分散剂和稳定剂等。
在本发明的上下文中，如果一种化合物在1μM浓度下抑制DP-IV的作用，则被认为是该酶的抑制剂。这类化合物优选在低于100nM浓度下抑制DP-IV的作用，同时在低于1μM浓度下不抑制其它酶。下表列出了常见类型的DP-IV抑制剂化合物和其具体实例，它们在本发明的应用中是优选的；表中还给出了公开较宽范围的此类化合物的专利文献号并画出了化合物实例的结构。应该强调的是，所引用的DD和WO说明书中公开的所有DP-IV抑制剂均可用于本发明，参考文献是指这些先有说明书关于通式和相关的更具体的结构式以及单个化合物的全部信息。例如，按照所示文献的教导，下表中所示的吡咯烷和噻唑烷环可被许多不同环大小的其它杂环替换和/或所示氨基-酰基部分可被多种其它的结构部分替换，从而得到可用于本发明的其它DP-IV抑制剂。
在本发明的一个优选方案中，DP-IV抑制剂是氨基-酰基吡咯烷腈。特别优选的是WO 95/15309和WO 98/19998中公开的那些氨基-酰基吡咯烷腈。
本发明的组合物可配制成通过任何已知的途径给药于人类患者的形式：包括口服给药、经粘膜给药(如颊、舌下、鼻内、阴道和直肠给药)、透皮给药或者注射(包括静脉内、肌肉内和皮下注射)。优选的给药途径是口服给药。在口服给药的情况下，组合物适于配制成片剂或胶囊。
第二方面，本发明提供了已知是DP-IV抑制剂的化合物的一种新用途，该用途是作为治疗低于正常发育和侏儒症或者用于促进组织再生的治疗剂。
第三方面，本发明包括一种改进的治疗低于正常发育和侏儒症，尤其是由于生长激素缺乏引起的低于正常发育和侏儒症和促进组织再生的方法，其中给所述患者施用含有治疗有效量的DP-IV抑制剂的药物组合物。该治疗包括单独使用所述组合物或者将该组合物与如前所述的其它治疗剂联合使用。给药可以是单剂量给药，或者以一定的时间间隔如2-6小时分次给药。在特别优选的给药方案中，组合物在晚上睡前每天给药一次。当用于促进组织再生时，治疗过程可持续数天或数周；或者当用于治疗低于正常发育时，治疗过程可持续更长的一个时期。何时达到适宜的临床治疗终点和具体的给药方案应由主管医师决定。
实施例
实施例1.抑制剂的制备
DP-IV抑制剂可按照文献描述的方法制备。氨基-酰基吡咯烷腈类的合成记载于WO 95/15309和WO 98/19998中。下列方法是这些方法的说明。
实施例1A-合成(2S)-N-异亮氨酰吡咯烷-2-甲腈
(a)叔丁氧羰基-异亮氨酰脯氨酰胺
向搅拌下的脯氨酰胺盐酸盐(225mg，1.50mmol)在无水二氯甲烷(15ml)中的悬浮液中加入二异丙基乙基胺，得到透明的碱性(pH9)溶液。一次性地加入N-(叔丁氧羰基-异亮氨酰氧基)琥珀酰亚胺(328mg，1.0mmol)，并在氮气氛下、在室温下将该混合物搅拌16小时。真空蒸发溶剂并将残余物分配到乙酸乙酯和0.3N硫酸氢钾溶液中。有机层用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残余物经硅胶短柱滤过，用己烷/乙酸乙酯(10∶90)，然后是乙酸乙酯洗脱纯化。将含产物的洗脱液浓缩，得到无色泡沫玻璃体状的标题化合物：301mg(92％)。 1H NMR(CDCl3)：δ6.90(1H，br.s)；5.51(1H，br.s)；5.18(1H，d，J＝9.6Hz)；4.62 (1H，dd，J＝2.6 & 7.0Hz)；4.29(1H，dd，J＝8.4 & 9.2Hz)；3.79-3.58(2H，m)；2.36(1H， m)；2.09-1.57(5H，m)；1.43(9H，s)；1.17(1H，m)；0.95(3H，d，J＝6.6Hz)；0.90(3H，t， J＝7.3Hz)ppm.
(b)(2S)-N-(叔丁氧羰基-异亮氨酰)吡咯烷-2-甲腈
在氮气氛下，向搅拌下的步骤(a)的酰胺(203mg，0.62mmol)在无水吡啶(10ml)中的溶液中加入咪唑(84mg，1.24mmol)。使该混合物冷却到-35℃，然后滴加三氯氧化磷(0.25ml，2.48mmol)。将该混合物搅拌1小时，期间使温度升高到-20℃，然后真空蒸发溶剂。残余物经硅胶色谱纯化，得到无色油状的标题化合物；产率：180mg(94％)。 1H NMR(CDCl3)：δ5.14(1H，d，J＝9.2Hz)；4.80(1H，dd，J＝2.6 & 7.1Hz)；4.22(1H， dd，J＝7.9 & 9.1Hz)；3.81(1H，m)；3.71(1H，m)；2.30-2.12(4H，m)；1.75(1H，m)； 1.60(1H，m)；1.42(9H，s)；1.19(1H，m)；0.97(3H，d，J＝6.9Hz)；0.91(3H，t， J＝7.3Hz)ppm. 13C NMR(CDCl3)：δ171.7；155.6；118.0；79.6；56.0；46.5；46.0；37.8；29.6；28.1； 25.0；24.2；15.2；10.9ppm.
(c)(2S)-N-(异亮氨酰)-吡咯烷-2-甲腈三氟乙酸盐
将步骤(b)的腈溶于三氟乙酸并将该溶液在室温搅拌1小时。真空蒸发溶剂，残余物溶于水。将该溶液冻干，得到白色蓬松固体的标题化合物；产率：60mg。
FAB质谱：计算值：m/e 209.3；实测值：210.2(M+H)+1H NMR(D2O)：δ4.3(1H，m)；3.64(1H，d，J＝5.6Hz)；3.16(2H，m)；1.86-1.48(5H，m)；0.98(1H，m)；0.68(1H，m)；0.51(3H，d，J＝6.9Hz)；0.38(3H，t，J＝7.3Hz)ppm.13C NMR(D2O)：δ169.7；119.7；57.3；48.6；48.1；36.9；30.2；25.8；24.5；15.4；11.5ppm.
实施例1B-合成(2S)-N-((2’S)-2’-氨基-3’，3’-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-甲腈
按照实施例1A的方法，用相应的叔丁基甘氨酸衍生物代替异亮氨酸衍生物制备。1H NMR(CD3OD)：δ4.86-4.81(1H，m)；4.04(1H，s)；3.77-3.71(2H，m)；3.34(2H，s)；2.34-2.08(4H，m)；1.14(9H，s)ppm.13C NMR(CD3OD)：δ167.40，117.99，58.78，46.53，34.21，29.54，25.22，25.03ppm.
实施例2.对循环生长激素的作用
动物
用从Iffa Credo(L’Arbresle，法国)得到的雄性Sprague-Dawley大鼠(200-220g)进行实验，在控制温度和湿度的实验室中，动物随意进食标准的实验室饲料并保持12小时光-暗条件。
手术
将大鼠称重并用戊巴比妥麻醉。将咽喉的前侧剃净并在咽喉中央下部作一切口。暴露右颈静脉并插入与医用硅橡胶管(外径0.94mm)相连的聚乙烯套管(外径1.0mm)(颈静脉一侧为硅橡胶管)。将管固定，并通过在颈的后背侧作一切口使管的聚乙烯一测外露。导管用含0.1％肝素的300μl林格氏溶液冲洗。使大鼠在单独的笼中恢复至少24小时，并随意进食和饮水。
实验方法
在注射GHRH(0.1μg/kg，i.v.)前15分钟，注射实施例1B的化合物(3mg/kg，i.v.)或其载体。在临注射抑制剂和GHRH前，及注射GHRH后5、10、15、20、30和60分钟后，抽取血样。将每份血样加入等体积的含0.1％肝素的林格氏溶液中。提取血浆并贮存于-20℃下直至采用RIA测定GH。
结果
实施例1B的化合物增强通过施用GHRH诱导的GH峰(表1)。给予载体和抑制剂的治疗组的积分的GH响应值分别为720.0±217.0ng/ml.60min和5072.8±837.3ng/ml.60min(p＜0.05)。
表1：实施例1B的DP-IV抑制剂对经静脉注射GHRH诱导的GH峰的影响。结果为6只大鼠的平均GHng/ml±s.e.m.时间(min)-150 5 1015 203060AUCGHRH42.1±12.540.1±8.0 155.7 ±25.1 91.0 ±15.661.0±12.953.6±12.534.1±8.226.7±3.0720.2±217.0GHRH+抑制剂50.0±16.433.4±6.9 483.0 ±91.0 309.5 ±55.40164.3±28.3103.1±18.152.1±7.726.3±3.35072.8±837.3
获得的结果表明DP-IV抑制剂能提高生长激素的循环水平，因此可用于治疗由于生长激素缺乏引起的低于正常发育，及促进组织生长对其具有重要意义的其它适应症。
实施例3.药物制剂
3A-50mg片剂
如下制备含有相当于50mg实施例1A的化合物作为活性成分的片剂：实施例1A的化合物(三氟乙酸盐形式)154.5g玉米淀粉53.5g羟丙基纤维素13.5g羧甲基纤维素钙11.0g硬脂酸镁2.0g乳糖165.5g总计400.0g
将原料混合后压片，得到2000片200mg的片剂，每片含相当于50mg游离碱形式的实施例1A化合物。
3B-100mg阴道栓制
如下制备含有相当于100mg实施例1A的化合物作为活性成分的适于阴道给药的栓剂： 实施例1A的化合物 (三氟乙酸盐形式) 154.5g 玉米淀粉 210.0g 胶体二氧化硅 2.5g 聚维酮30 49.0g 硬脂酸镁 23.0g 己二酸 57.0g 碳酸氢钠 43.0g 月桂基硫酸钠 5.0g 乳糖 456.0g 总计 1000.0g
将原料混合后压成1000枚1g的栓剂，每枚含有相当于100mg游离碱形式的实施例1A化合物。
前面的实施例用于说明本文公开的发明，而不旨在限制。本领域专业技术人员认为是等同变化的这类扩大均包括在本发明的范围中，权利要求进一步限定了该范围。
对于特定目的的本发明组合物和方法，可使用一种或多种DP-IV抑制剂作为仅有的活性成分。