一类细胞因子的新适应症 本发明涉及细胞因子对促进血管再生的方法及细胞因子在治疗缺血性心脏疾病中应用。
急性心肌梗塞、冠脉狭窄以及经皮冠状动脉腔内血管成形术(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty，PTCA)后冠状动脉再狭窄是临床上的难题，心肌供血异常(缺血)是这些临床病症的共同特点之一。如果对心肌的血供可以恢复，这类疾病即可以得到治疗。目前已有一些传统的临床治疗方法可用于冠脉缺血疾病，如冠状血管搭桥手术和经皮冠状血管气囊扩张术对治疗单根或数根冠脉血管狭窄是有效的治疗方法。但是手术带来的血管内皮损伤会极大地增加术后冠脉再狭窄的可能性。对于有着广泛冠脉狭窄和病变的病人，采用这些技术不足以增加心脏血液的供应。因此，如果能生成新的血管并形成建立新的侧枝循环血供，将会有助于这些疾病的治愈。
因此，人们花费许多努力去开拓诱导心脏血管生长的新治疗方法，比如使用生长因子。目前已有一些血管生成因子，如血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子α(Fibroblast GrowthFactor，αFGF)、βFGF和胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)在进行动物实验和临床试验。但是，所有这些因子都尚未被批准在临床用于血管生成，甚至未被批准用于任何其他临床疾病。在证实这些因子的急性和慢性毒性、致癌作用以及其他任何潜在副作用之前，这些因子要用于血管生成还有很长的路要走。
人们在癌症病人的治疗中采用细胞因子来提高身体的免疫能力，特别是癌症病人化疗时引起白细胞下降，可注射细胞因子来提高白细胞数量，并且大量的临床数据证明粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在增加白细胞总量时其安全性、有效性和可重复性。再如促红细胞生成素(EPO)能增加红细胞，临床用于治疗肾性贫血以及其他各种原因，如艾滋病、癌症等引起的贫血。白细胞介素-2(IL-2)在临床上用作抗肿瘤药物，但副作用比较大。
本发明目的是提供一类细胞因子在治疗缺血性心脏病的药物中应用，更具体地说细胞因子对治疗急性心肌梗塞、冠脉狭窄或者冠状动脉再狭窄疾病的药物应用。
一类使血循环中的内皮祖细胞增加，促心肌血管生成的细胞因子在治疗缺血性心脏病药物中应用，它们包括G-CSF、GM-CSF、EPO、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1、IL-2、IL-7、IL-8等细胞因子有动员干细胞进入外周血的作用，使用这些细胞因子能显著增加外周血干细胞包括CD34+细胞的数量。因此，系统给予这些细胞因子，通过增加全身循环血液中CD34+细胞，达到促进新生血管生成。
对白血病患者进行HLA全相合地异基因外周血干细胞移植，患者用G-CSF做动员剂，皮下注射G-CSF 10μg/kg/天，分两次注射，共注射5天。动员前后分别采集外周血，加PE标记的CD34单抗共同避光室温孵育20分钟，裂解红细胞，洗涤，固定用FACS测定CD34+细胞数。测定动员后外周血CD34+细胞是动员前的10倍多。表明系统给予G-CSF能增加循环血液中CD34+细胞。
上述细胞因子可以是用大肠杆菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)以及其他生物器生产的重组人G-CSF、GM-CSF，G-CSF、GM-CSF可以是重组蛋白或含有上述因子的复合物。而G-CSF、GM-CSF还可以编码该蛋白的基因直接导入受体的方式给予，DNA或mRNA序列导入到受体细胞的方法可以是通过磷酸钙-DNA转运法，DEAE葡聚糖-DNA转运法、Lipofectin试剂转运法、基因枪技术、病毒基因转运系统以及肌内直接注射裸DNA，然后电穿孔法。
正常人的循环血液中CD34+细胞很少，几乎检测不到。但我们观察到，急性心肌梗塞病人血液循环中CD34+细胞短暂但明显增高。6位病人在心肌梗塞的急性发作阶段(0天)以及在根据临床症状和实验室检查后评定为急性心梗塞(第1天)，检测其白细胞总数以及CD34+细胞数，计算CD34+占白细胞数的比例。发现CD34+细胞在急性心梗发作时明显升高，约占白细胞总数的0.9％，但次日迅速下降，约为0.2％左右。可见血液循环中CD34+细胞在急性心肌梗塞后(当天)发生短暂升高。
本发明提供异体的CD34+细胞能迁移、分化并装配入鼠的心肌损伤区域的新生血管中，即受损心肌可以发生血管重生。
一组对雄性无胸腺裸鼠损伤心肌然后注射DiI标记的CD34+细胞。另一组对2只上述裸鼠施行假手术，然后注射DiI标记的CD34+细胞。再一组为损伤心肌然后注射抽取出CD34+细胞的DiI标记的外周单个核细胞，通过尾静脉注射由正常人分离出经荧光染料DiI标记的CD34+细胞。结果可从图2、图3、图4看出CD34+细胞明显增加，注射的CD34+细胞被发现仅分布于心肌损伤区域。在心肌正常区域或其他任何器官包括肺没有确认有该细胞，后一发现意义重大，因为细胞是静脉注射需要通过肺部才能到达心脏，从实验表明外源性内皮祖细胞迁移至损伤心肌，在心脏内这些细胞可以重新形成完全的血管，使用外源祖细胞对严重冠脉疾病患者形成新的血管可以起作用。
细胞因子药物对治疗缺血性心脏疾病，包括急性心肌梗塞、冠脉狭窄和PTCA后再狭窄中应用。
使用异体内皮原始祖细胞(CD34+细胞)治疗缺血性心脏病
A、适应病人：急性心肌梗塞、严重心绞痛、PCTA一天内以及PTCA冠脉再狭窄
B、血液样本：120ml静脉血
C、CD34+细胞的分离：
120ml血样用于分离CD34+细胞。有两个方法可用于CD34+细胞分离，视医院的具体设备情况选择其中之一。
a.使用磁性装置分离CD34+细胞：方法详见磁性辅助细胞分离法(Magnetic Assisted Cell Sorting，MACS)所用细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫)说明书，以及StemSepTM 细胞分离器(StemCell Technologies Inc，加拿大温哥华)说明书。
b.荧光标记细胞再使用流式细胞仪分离CD34+细胞：当医院有流式细胞仪时，该方法应当按说明书的标准化程序操作。
D、CD34+细胞增殖：
纯化的CD34+细胞与RPMI+10％FCS+1％青霉素和链霉素孵育，37℃，浓度为500,000个细胞/毫升。另外，在培养基中加入以下试剂：VEGF(5ng/ml)，βFGF(10ng/ml)，SCF(Stem Cell Factor，干细胞因子)(100ng/ml)，IL1-beta(100ng/ml)，G-CSF(100ng/ml)，和TPO(血小板生成素)(15ng/ml)。这些细胞孵育2周。每3天换一次培养基。
E、细胞收获：孵育2周后收获细胞，进行流式细胞仪(FACS)分析以确定CD34+细胞的纯度。如果纯度小于50％，需按步骤C进行CD34+细胞分离。存于-4℃备用。
F、CD34+细胞输注：
急性心肌梗塞、或严重心绞痛、或PTCA后冠脉再狭窄病人静脉输入增殖并纯化的CD34+细胞。
G、灭菌：
所有实验必须在灭菌条件下进行。
使用G-CSF治疗缺血性心脏病病人
A、适应病人：急性心肌梗塞、严重心绞痛、PTCA一天内以及PTCA冠脉再狭窄
B、血液样本：20ml静脉血
C、检测循环血中CD34+细胞数量
20ml血样用于检测CD34+细胞水平。有两个方法可用于CD34+细胞分离，视医院的具体设备情况选择其中之一。
a.使用磁性装置分离CD34+细胞：方法详见磁性辅助细胞分离法(MACS)所用细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫)说明书，以及StemSepTM细胞分离器(StemCell Technologies Inc.，加拿大温哥华)说明书。
b.荧光标记细胞再使用流式细胞仪分离CD34+细胞：当医院有流式细胞仪时，该方法应当按说明书的标准化程序操作。
D、重组人G-CSF的使用
重组人G-CSF静脉注射，剂量为2.5μg/kg或5μg/kg，每日一次，3-7天或绝对中性粒细胞达到10,000mm3为止。
本发明的一类细胞因子具有下列优点：
1、能系统给药，如静脉给药或皮下注射，不需特殊的传输技术，如心肌激光打孔、开胸心肌内直接注射、冠状动脉内注射、经皮心肌内直接注射等。
2、可多次治疗
3、本发明提供用于治疗的药物，如G-CSF、GM-CSF均已上临床，其急性、慢性毒性、致癌作用，以及其他的副反应都有较系统研究，用药比较安全。
附图简介
图1是异体干细胞供者使用G-CSF后外周血CD34+细胞变化的示意图。
图2是FACS检测分离的CD34+细胞纯度。
图3是分离细胞的组织学检查结果。
图4是受损心肌区域DiI荧光。
图5是受损心肌中一新血管的图像。
实施例1检测急性心肌梗塞病人血液循环中CD34+细胞的变化
研究了6位病人，在心肌梗塞的急性发作阶段(0天)以及在根据临床症状和实验室检查后评定为急性心梗后(第1天)，常规方法检测病人的白细胞数。抽取外周血用柠檬酸盐-磷酸盐葡萄糖(Sigma)抗凝，以1∶3体积比用PBS液稀释。400g离心30分钟。收集单个核细胞。用NH4Cl溶液(NH4Cl0.155M，NaHCO3 12mM，EDTA 10uM)溶解红细胞。低速离心(250g，每次5分钟)下用含2％小牛血清(FBS)的PBS液冲洗细胞3次。制成细胞悬液，与人的复合单克隆抗体(human monoclonal antibody cocktail MoAb，catalogue#ST-230H，StemCell Technologies Inc.，加拿大温哥华)孵育。然后加入磁性胶体(StemCell Technologies，Inc.)。用StemSep磁性分离柱(StemCellTechnolgies，Inc.)分离，游离的CD34+细胞通过柱子后被收集。检测CD34+细胞数。计算CD34+占白细胞数的比例。结果发现CD34+细胞在急性心梗发作时明显升高，占白细胞总数的0.87±0.59％，但次日即迅速下降，为0.19±0.13％。两组配对t检验p＜0.05，可见血液循环中CD34+细胞在急性心肌梗塞后(当天)发生短暂升高。
实施例2检测异体供者外周血干细胞动员前后CD34+细胞的变化
5例急性白血病患者进行HLA全相合的异基因外周血干细胞移植，5例供者均为患者的同胞，年龄10-50岁。男性4例，女性1例。在-5天开始，供者用G-CSF做动员剂，皮下注射G-CSF 10μg/kg/天，分两次注射，共用5天。动员前后分别采集外周血，加PE标记的CD34单抗共同避光室温孵育20分钟，裂解红细胞，洗涤，再加10g/L多聚甲醛固定，FACS测定CD34+细胞数。结果见图1。动员后外周血CD34+细胞是动员前的10.3倍，可见用G-CSF动员后供者血液循环中CD34+细胞明显增高。
实施例3目的是证实异体基因CD34+细胞是否会迁移、分化并装配入心肌损伤部位新的血管中
19只6周大的雄性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.)，分成5组。A组：为主要实验组，共8只鼠，损伤心肌后注射DiI标记的CD34+细胞，其余4组动物组成不同的对照组。B组：2只鼠施行假手术(施行了胸廓切开术但没有损伤心肌)，然后注射DiI标记的CD34+细胞。C组：2只鼠损伤心肌后不注射任何细胞。D组：5只鼠损伤心肌后注射抽取出CD34+细胞的DiI标记的外周单个核细胞。E组：2只鼠损伤心肌后注射DiI染料。
鼠心肌损伤模型制作：施行左侧胸廓切开术暴露心脏，用25号针10-20次透壁心肌针刺造成心肌损伤。该方法造成的心肌损伤的组织表现与缺血造成的心肌梗塞相似。
术后两天，约2×105CD34+细胞(分离自正常人志愿者，用荧光染料DiI标记)通过尾静脉注射。14天后将鼠处死，取器官并进行组织分析。除心脏外还检查肾、肝、脾、肺和脑以确定DiI染料或DiI标记的细胞在心脏以外是否出现。
人CD34+细胞分离：正常人供体的外周血用柠檬酸盐-磷酸盐葡萄糖(Sigma)抗凝，同实施例1中的方法，收集通过柱子后的CD34+细胞。冲洗洗脱的细胞，并放于Dulbecco氏改良Eagle培养基(GiboBRL，LifeTechnologies，纽约格兰德岛)备用。
用流式细胞仪(FACS)检测分离出来的CD34+细胞的纯度。分离的细胞与鼠抗CD34 IgG然后FITC-抗鼠IgG孵育各30分钟。用PBS液冲洗，用FACS检测CD34+纯度。
进一步检测分离细胞的特性，细胞涂片并用2％多聚甲醛固定。用鼠抗CD34抗体(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，加州圣胡塞)和FITC-羊抗鼠IgG(Becton Dickinson)检测CD34抗原性。RNA探针原位杂交检测eNOS：抗Von Willebrand因子(VIII因子，DAKO)抗体免疫染色检测VIII因子：抗CD31抗体(Becton Dickinson)免疫染色检测CD31抗原性。
分离的细胞用10uM荧光染料DiI(StemCell Technologies Inc.)在37℃标记2小时。标记好后，细胞冲洗并悬于基质以用于动物注射。
组织分析：动物处死后，采集组织并固定，做组织冰冻切片。为检测DiI荧光的存在，冰冻组织切片没有进一步处理，用荧光显微镜观察。为识别损伤区域，用标准技术进行苏木精-曙红(H&E)染色。
结果：
如图2：FACS检测分离的CD34+细胞纯度。细胞用CD45和CD34抗体双染色以分别检测单个核细胞数和CD34+细胞数。图2A显示CD34+细胞富集前外周单个核细胞中仅约0.4％为CD34+。图2B显示通过StemSep分离柱后约64％细胞为CD34+。表明该方法能明显富集CD34+细胞。
如图3显示分离细胞的特性。与抗CD34抗体免疫染色显示分离细胞CD34抗原的表达(图3A)；与抗人HLA1抗体免疫染色显示相同细胞表达HLA1(图3B)；因子VIII抗原性与CD34阳性共存(图3C和3D)，但细胞为CD31阴性(图3E)；eMOS表达原位杂交也是阳性(图3F)，提示这些细胞的内皮表型。
仅在心脏受损区域观察到DiI荧光。在这些区域内，观察到拉长、变平的DiI+细胞沿毛细血管和较大的血管排列。这些血管中有许多完全由DiI+细胞组成。如图4A显示注射DiI标记CD34+细胞的鼠的损伤心肌区域低倍显微镜图象，图4B为较高倍显微镜图象。即使在低倍显微镜下可以看见DiI荧光，并可见仅限于受损区域，邻近正常心肌未见荧光。如这些图所示，DiI标记的细胞有时在间质组织内随意出现(箭头a)，有时排列成行出现(箭头b)，有时这些细胞形成类似血管的中间空的圆环状(箭头c)。标尺条在图A相当于200μm，图B为50μm。作为对照，心肌损伤动物静脉注射DiI染料显示在受损区域或非受损区域没有出现荧光。这表明CD34+细胞迁移至心肌损伤部位并参与新血管形成。
DiI+荧光和VIII因子、CD31以及HLA1共处证实这是注射的人的细胞整合入或者是可能形成血管结构。如图5显示心外膜表面附近一个心肌损伤区域内一新血管邻近组织切片图象。一新鲜冰冻切片用一个DiI滤光器在荧光显微镜下显现为一个血管结构(图5A)。同样这张切片再用FITC-抗HLA-1抗体免疫染色(图5B)。阳性染色证实组成该结构的细胞来源于人，该切片的DiI信号在HLA-1染色后消失(图片未显示)。该切片显示强VIII因子免疫阳性(图5C)，这证实排列该结构的细胞为内皮表型。对另一个不同的邻近组织切片免疫染色显示该结构为CD34阴性(图5D)但CD31阳性(图5E)。说明注射的细胞进一步分化为内皮细胞，失去CD34抗原性获得CD31抗原性。