攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)及其应用 技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体地说涉及攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)及其应用。
背景技术
乙型肝炎是一种严重危害全人类健康的疾病，目前临床上用于治疗乙型肝炎的药物有两类，一类为阿尔发干扰素，它对乙型肝炎病毒没有直接作用，其抗病毒作用是通过诱导肝细胞形成一种抗病毒状态来实行的；第二类拉米夫啶，是一种非特异性的逆转录酶的抑制剂，其主要作用是抑制RNA病毒的逆转录过程从而达抑制病毒的复制。它们的共同缺点是针对乙型肝炎病毒的特异性差，并且两者治疗乙型肝炎地有效率较低(30％-40％)，对乙型肝炎病毒的表面抗原的转阴率更低，阿尔发干扰素为6％，而拉米夫啶的效果还不确定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)。为此本发明采用以下技术方案：它为双链RNA分子并且其核苷酸序列与具有以下特征的核苷酸序列(I)至少70％的同源度：正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，正义链和反义链各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表第4号核苷酸序列中连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％(即G/C比例)，核苷酸序列(I)的反义链及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同源性。
“无同源性”在此是指核苷酸序列(I)反义链和其任意一个位置的核苷酸突变体和已知人类基因和基因表达片段无100％的相同。
上述小干扰RNA分子(SiRNA)为人工合成，正义链和反义链各自的3’末端有两个脱氧胸苷酸(TT)，其它19个核苷酸的碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)；两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补(A和U，C和G)形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链的形式存在。
当序列表中第4号核苷酸序列出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，上述“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表中第4号核苷酸序列的连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，”可以被理解为“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和序列表中第4号核苷酸序列的任意两个连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致。”
人类乙型肝炎病毒是属于一种小的噬肝性DNA病毒，其基因组是有3200个左右的核苷酸组成的不完全的双链的环状DNA分子，在成熟的病毒基因组，它有一条完整的用于编码mRNA分子的负链和一条不完整的正链组成。虽然它属于DNA病毒，但它基因组的复制和一般的DNA病毒不一样，而与RNA病毒中的逆病毒(retrovirus)十分相似，需要依靠一个RNA中间体来完成。具体的过程是在病毒感染细胞后，它的DNA分子会被转运到细胞核，在那里不完全的双链的环状DNA分子会成熟成共价状、闭合的环状DNA分子(covalently closed circular DNA，ccc DNA)，在再以此ccc DNA分子中的负链为模板利用细胞核内的RNA转录酶II转录产生一条比负链稍长的前基因RNA分子，此分子的作用第一是作为逆转录合成病毒DNA的模板，第二是和其它mRNA分子一样负责编码HBV的核心抗原(c抗原)和多功能聚合酶，因此前基因RNA分子也称作核心抗原/多聚酶(c/pol)mRNA分子。
乙肝病毒的繁殖除了其基因组的复制以外，还需要其它功能和结构蛋白的合成，编码这些结构蛋白的mRNA分子一共有四种。第一是长为3.5kb的e抗原mRNA，它比c/多聚酶mRNA(前基因RNA)分子还要长，含e抗原蛋白的启动子，编码病毒的e抗原蛋白；第二是长为2.4kb编码长表面蛋白(LHBs)mRNA，它主要合成LHBs(也称作前S1蛋白)；第三是长为2.1kb编码中等长和短表面蛋白的mRNA，编码中等长(前S2蛋白)和短表面蛋白(通常指的表面抗原蛋白)；第四是长度只有0.7kb的编码X蛋白的x mRNA。这些mRNA编码的蛋白的功能各不相同，X蛋白是HBV合成的唯一调控蛋白，和病毒的复制关系密切。三种表面抗原是病毒的重要结构蛋白，其中长表面抗原还是病毒和肝细胞结合的主要分子，在病毒的感染性中起到十分重要的作用。e抗原则和乙肝病毒感染后慢性肝炎的发生关系密切。
序列表中第4号核苷酸序列是发明人从乙肝病毒的ADR、ADW、和AYW三个亚型的共同序列经过排序后得到的的共同序列。ADR、ADW是分布于西太平洋延岸的亚太地区乙肝高发国家的乙肝病毒亚型，AYW是主要分布于非洲和欧洲的许多国家的乙肝病毒亚型。其过程是首先从各个亚型的已知病毒基因组序列中找出各自的共同序列(序列表中第1、第2、第3号序列分别是ADR、ADW、和AYW亚型的共同序列)，再对此三个共同序列进行排序，得到ADR、ADW、和AYW三个亚型的共同序列，排序所用的手段是公认的Clustal W，序列表中第4号序列就是这个共同序列的正义链。其中用于ADR亚型共同序列的病毒基因组在基因文库中的登陆号包括：AB026811、AB026812、AB026813、AB026814、AB026815、AB033550、AB042282、AB042283、AB042284、AF411408、AF411409、AF411411、AF411412、AF458664、AF458665、AF461357、AF461361、AF461363；ADW亚型包括：AB033551、AB033552、AB033553、AB033554、AB033555、AB033556、AB033557、AF100308、AF100309、AF282917、AF282918、HBVCGWITY、HBVP4CSX、HBVP6CSX、HPBADW1、HPBADW2、HPBADW3、HPBADWZ；AYW包括：AB033558、AB033559、AB048701、AB048702、AB048703、HBVAYWGEN、HBVORFS、HBVP2CSX、HBVP3CSX、HBVP4PCXX、HBVP5PCXX、HBVP6PCXX、U95551、XXHEPA、XXHEPAV。
本发明提供的对应于该共同序列的小干扰RNA分子(SiRNA)能够特异性地针对人类乙型肝炎病毒，它通过细胞内的RISC(RNA-induced silencing complex)有效地降解乙肝病毒的前基因RNA分子和蛋白信使核糖核酸分子，可以直接阻断病毒基因物质的复制、病毒的繁殖，还可以抑制其和致病密切相关蛋白质的合成，为治疗急、慢性肝炎以及与其密切相关的肝硬化和肝癌找到了新的有效的手段。
当核苷酸序列(I)还同时具有以下特征时，本发明所提供的小干扰RNA分子，其所实现的效果更好：
1)、核苷酸序列(I)的正义链自5’端开始的第一个核苷酸是碱基为鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的核苷酸中的一种；也就是说当序列表第4号序列中出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和该两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸中的最后两个核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，”。
2)、所述连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸为序列表第4号序列中以下排位数处的核苷酸，即：在序列表第1号、第2号核苷酸序列中与该排位数相同处均为连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸，并且，序列表第1号和第2号核苷酸序列中这两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致、或者其中有一个核苷酸不同、或者其中有两个不相邻的核苷酸不同。
下表列出了符合这些条件的核苷酸序列(I)
序列号 正义链序列 反义链序列 MW* 攻击范围#
5 UCUUCUCGAGGACUGGGGATT UCCCCAGUCCUCGAGAAGATT 13489.6 123-143
6 CCUCUUGUCCUCCAAUUUGTT CAAAUUGGAGGACAAGAGGTT 13459.4 342-362
7 GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT GACAAACGGGCAACAUACCTT 13474.5 458-478
8 GGAACCUCUAUGUUUCCCUTT AGGGAAACAUAGAGGUUCCTT 13459.4 542-562
9 CCUCUAUGUUUCCCUCNUGTT CANGAGGGAAACAUAGAGGTT 13466.5 546-566
10 CCUUCGGACGGAAACUGCATT UGCAGUUUCCGUCCGAAGGTT 13489.6 578-598
11 CUGCACCUGUAUUCCCAUCTT GAUGGGAAUACAGGUGCAGTT 13474.5 592-612
12 GUCUGUACAACAUCUUGAGTT CUCAAGAUGUUGUACAGACTT 13444.3 765-785
13 CAUCUUGAGUCCCUUUUUATT UAAAAAGGGACUCAAGAUGTT 13429.2 775-795
14 UUUUCUUUUGUCUUUGGGUTT ACCCAAAGACAAAAGAAAATT 13414.1 807-827
15 CUUCAUGGGAUAUGUAAUUTT AAUUACAUAUCCCAUGAAGTT 13414.1 873-893
16 CUUCCUGUAAACAGGCCUATT UAGGCCUGUUUACAGGAAGTT 13459.4 955-975
17 CAGGCCUAUUGAUUGGAAATT UUUCCAAUCAAUAGGCCUGTT 13444.3 966-986
18 UUGUGGGUCUUUUGGGNUUTT AANCCCAAAAGACCCACAATT 13451.4 998-1018
19 UGUGGNUAUCCUGCUUUAATT UUAAAGCAGGAUANCCACATT 13436.3 1036-1056
20 UGCCUUUAUAUGCAUGUAUTT AUACAUGCAUAUAAAGGCATT 13414.1 1055-1075
21 GCAGGCUUUCACUUUCUCGTT CGAGAAAGUGAAAGCCUGCTT 13474.5 1083-1103
22 CCUUUACCCCGUUGCCCGGTT CCGGGCAACGGGGUAAAGGTT 13519.8 1140-1160
23 CGGCCAGGUCUGUGCCAAGTT CUUGGCACAGACCUGGCCGTT 13519.8 1162-1182
24 GUGUUUGCUGACGCAACCCTT GGGUUGCGUCAGCAAACACTT 13489.6 1180-1200
25 CCCCCACUGGNUGGGGCUUTT AAGCCCCANCCAGUGGGGGTT 13526.9 1196-1216
26 CCUUUGUGGCUCCUCUGCCTT GGCAGAGGAGCCACAAAGGTT 13504.7 1244-1264
27 CUCCUAGCCGCUUGUUUUGTT CAAAACAAGCGGCUAGGAGTT 13474.5 1279-1299
28 UCCCGCGGACGACCCNUCUTT AGANGGGUCGUCCGCGGGATT 13526.9 1446-1466
29 GGUCUUACAUAAGAGGACUTT AGUCCUCUUAUGUAAGACCTT 13444.3 1646-1666
30 GAGGACUCUUGGACUCUCATT UGAGAGUCCAAGAGUCCUCTT 13474.5 1658-1678
31 UGUCAACGACCGACCUUGATT UCAAGGUCGGUCGUUGACATT 13474.5 1681-1701
32 CGACCGACCUUGAGGCAUATT UAUGCCUCAAGGUCGGUCGTT 13489.6 1687-1707
33 NGACUGGGAGGAGUUGGGGTT CCCCAACUCCUCCCAGUCNTT 13511.8 1727-1747
34 UUGGUCUGUUCACCAGCACTT GUGCUGGUGAACAGACCAATT 13474.5 1794-1814
35 CUUUUUCACCUCUGCCUAATT UUAGGCAGAGGUGAAAAAGTT 13444.3 1820-1840
36 UCAUCUCAUGUUCAUGUCCTT GGACAUGAACAUGAGAUGATT 13444.3 1839-1859
37 GCCUCCAAGCUGUGCCUUGTT CAAGGCACAGCUUGGAGGCTT 13504.7 1868-1888
38 GCUGUGCCUUGGGUGGCUUTT AAGCCACCCAAGGCACAGCTT 13504.7 1876-1896
39 GAAUUUGGAGCUUCUGUGGTT CCACAGAAGCUCCAAAUUCTT 13459.4 1922-1942
40 UUUGGAGCUUCUGUGGAGUTT ACUCCACAGAAGCUCCAAATT 13459.4 1925-1945
41 CAUUGUUCACCUCACCAUATT UAUGGUGAGGUGAACAAUGTT 13444.3 2039-2059
42 GCUAUUCUGUGUUGGGGUGTT CACCCCAACACAGAAUAGCTT 13474.5 2072-2092
43 UCUAGCCACCUGGGUGGGATT UCCCACCCAGGUGGCUAGATT 13504.7 2101-2121
44 UUAGUAGUCAGCUAUGUCATT UGACAUAGCUGACUACUAATT 13429.2 2150-2170
45 UAUGGGCCUAAAAAUCAGATT UCUGAUUUUUAGGCCCAUATT 13429.2 2176-2196
46 UCAGACAACUAUUGUGGUUTT AACCACAAUAGUUGUCUGATT 13429.2 2190-2210
47 CUAUUGUGGUUUCACAUUUTT AAAUGUGAAACCACAAUAGTT 13414.1 2198-2218
48 GAGAAACUGUUCUUGAGUATT UACUCAAGAACAGUUUCUCTT 13429.2 2235-2255
49 CUGUUCUUGAGUAUUUGGUTT ACCAAAUACUCAAGAACAGTT 13429.2 2241-2261
50 UGCCCCUAUCUUAUCAACATT UGUUGAUAAGAUAGGGGCATT 13444.3 2308-2328
51 CACUUCCGGAAACUACUGUTT ACAGUAGUUUCCGGAAGUGTT 13459.4 2325-2345
52 CUACUGUUGUUAGACGACGTT CGUCGUCUAACAACAGUAGTT 13459.4 2337-2357
53 GAAGAACUCCCUCGCCUCGTT CGAGGCGAGGGAGUUCUUCTT 13504.7 2373-2393
54 GAACUCCCUCGCCUCGCAGTT CUGCGAGGCGAGGGAGUUCTT 13519.8 2376-2396
55 GGUCUCAAUCGCCGCGUCGTT CGACGCGGCGAUUGAGACCTT 13519.8 2400-2420
56 UCGCCGCGUCGCAGAAGAUTT AUCUUCUGCGACGCGGCGATT 13504.7 2408-2428
57 GAUCUCAAUCUCGGGAAUCTT GAUUCCCGAGAUUGAGAUCTT 13459.4 2424-2444
58 UCUCGGGAAUCUCAAUGUUTT AACAUUGAGAUUCCCGAGATT 13444.3 2432-2452
59 UCUCAAUGUUAGUAUUCCUTT AGGAAUACUAACAUUGAGATT 13414.1 2441-2461
60 UGUUAGUAUUCCUUGGACUTT AGUCCAAGGAAUACUAACATT 13429.2 2447-2467
61 GGUGGGAAACUUUACGGGGTT CCCCGUAAAGUUUCCCACCTT 13489.6 2471-2491
62 CUUUACGGGGCUUUAUUCUTT AGAAUAAAGCCCCGUAAAGTT 13444.3 2480-2500
63 UUAAUUAUGCCUGCUAGGUTT ACCUAGCAGGCAUAAUUAATT 13429.2 2631-2651
64 UUAUGCCUGCUAGGUUUUATT UAAAACCUAGCAGGCAUAATT 13429.2 2635-2655
65 UAUUUGCCCUUGGAUAAAGTT CUUUAUCCAAGGGCAAAUATT 13429.2 2670-2690
66 CAAGAGCUACAGCAUGGGATT UCCCAUGCUGUAGCUCUUGTT 13474.5 2835-2855
67 GAGCUACAGCAUGGGAGGUTT ACCUCCCAUGCUGUAGCUCTT 13489.6 2838-2858
68 CCUCGANAAGGCAUGGGGATT UCCCCAUGCCUUNUCGAGGTT 13496.7 2869-2889
69 GGCAUGGGGACGAAUCUUUTT AAAGAUUCGUCCCCAUGCCTT 13474.5 2878-2898
70 UCUUUCUGUCCCCAAUCCUTT AGGAUUGGGGACAGAAAGATT 13459.4 2892-2912
71 CUCAGACAAUCCAGAUUGGTT CCAAUCUGGAUUGUCUGAGTT 13459.4 2958-2978
72 UCCAGAUUGGGACUUCAACTT GUUGAAGUCCCAAUCUGGATT 13459.4 2967-2987
73 UCGGCAGUCAGGAAGGCAGTT CUGCCUUCCUGACUGCCGATT 13504.7 3141-3161
74 GAGACACUCAUCCUCAGGCTT GCCUGAGGAUGAGUGUCUCTT 13489.6 3185-3205
75 CUGGAUCCUGCGCGGGACGTT CGUCCCGCGCAGGAUCCAGTT 13534.9 1398-1418
76 CUCCCUCGCCUCGCAGACGTT CGUCUGCGAGGCGAGGGAGTT 13534.9 2379-2399
77 UGAAAAAAGGAGACUAAAATT UUUUAGUCUCCUUUUUUCATT 13399 2612-2632
*：如果序列中有N，则取A、U、C、G四种核苷酸的平均分子量339.2来计算
#：攻击范围是指该核苷酸序列(I)在序列表第4号序列中的相对应位置。
对于以上所说的同源度的数值，以80％以上为更佳。本发明所说之同源度是指任何针对人类乙型肝炎病毒的SiRNA，其核苷酸序列和本发明所说的核苷酸序列(I)的正义链或反义链序列，在相应位置上的核苷酸相同率。
本发明所提供的有效抑制人类乙型肝炎病毒复制和蛋白表达的小干扰RNA分子还包括针对以上所提到的小干扰RNA分子(SiRNA)的序列的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小干扰RNA分子。
所述化学修饰包括主要包括以下三类：第一、对连接相邻两个核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。典型的磷酸二酯键的部份修饰是将磷酸双键上的氧置换成硫(硫化)或其它元素，或将磷酸单键上的氧变成氮(氮化)或其它元素和化学基团；对磷酸二酯键本身的全部取代，也包括对其本身或其部份以及和它相连的两个核糖的部份或全部改变，典型的例证是将磷酸二酯键和两个相邻的核糖变成肽键，使得核酸变成肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)；第二、对核苷中核糖的五元环进行改变或其侧链上的化学基团作修饰。改变核糖环的典型例证如将五元的核糖环变成六环的Morpholino环；对核糖侧链上的修饰主要是指将核糖2’位上OH变成其它元素(如卤素元素)，或用其它化学基团替代0H中的H(例如烷基)。第三、将核苷酸上的碱基环作整体的改变或侧链的修饰。
本发明所提供的攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)包括对其修饰所形成的SiRNA可以应用于制备预防或治疗人类乙型肝炎以及与乙型肝炎病毒感染相关的任何疾病的药物或制剂中的应用。
附图说明
图1、12种SiRNA对乙肝病毒抗原表达的作用。图示150nM的12种SiRNA作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞上清中HBsAg和HBeAg水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图2、12种SiRNA对细胞内乙肝病毒DNA水平的作用。图示150nM的12种SiRNA作用于HepG2.2.15细胞72小时后对细胞内乙肝病毒(HBV)DNA水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图3、不同浓度的三种SiRNA对HBsAg表达的作用。图示不同浓度的2号、4号、和6号分子作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞上清中HBsAg水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图4、不同浓度的三种SiRNA对HBeAg表达的作用。图示不同浓度的2号、4号、和6号分子作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞上清中HBeAg水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图5、不同浓度的三种SiRNA对细胞内乙肝病毒DNA水平的作用。图示不同浓度的2号、4号、和6号分子作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞内DNA水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图6、不同的SiRNA组合对HBsAg表达的作用。图示不同浓度的两种SiRNA组合(2号加6号、2号加4号再加6号)作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞上清中HBsAg水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图7、不同的SiRNA组合对HBeAg表达的作用。图示不同浓度的两种SiRNA组合(2号加6号、2号加4号再加6号)作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞上清中HBeAg水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
图8、不同的SiRNA组合对细胞内乙肝病毒DNA水平的作用。图示不同浓度的两种SiRNA组合(2号加6号、2号加4号再加6号)作用于HepG2.2.15细胞72小时后对其细胞内病毒DNA水平的影响。对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理。纵坐标表示SiRNA处理组的抗原水平占对照组的相对百分率。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
具体实施方式
实施例1 SiRNA的合成
SiRNA的合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司，比如美国Dharmacon公司，具体可通过www.dharmacon.com获知，所有的SiRNA分子都经过2位上脱保护、脱盐、纯化、和退火形成双链处理，然后溶于DEPC处理的蒸馏水中。其所采用的合成方法均为通用的方法，比如以下文献公开的方法：Scaringe SA，Wincott FE，and Caruthers MH.Novel RNA Synthesis MethodUsing 5′-Silyl-2′-Orthoester Protecting Groups.J Am Chem Soc 1998；120：11820-11821.
本发明提供的小干扰RNA分子(SiRNA)的制备方法也可采用现有的固相化学合成法。该方法可参见：Wincott f，DiRenzo A，Shaffer C，Grimm S，Tracz D，Workman C，Sweedler D，Gonzalez C，Scaringe S and Usman N.Synthesis，deprotection，analysis and purification of RNA and ribozymes.Nucleic AcidsRes.1995，23：2677-84。
以前表序号7的小干扰RNA分子(SiRNA)为例：整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐退火无菌消毒。
具体制备操作如下：
(1)、寡聚核糖核酸的合成：SiRNA的合成是在自动DNA/RNA合成仪(例如：Appl ied Biosystems EXPEDITE 8909)上进行，根据序号7的小干扰RNA分子SiRNA的核酸序列(正义链5’-GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT反义链5’-GACAAACGGGCAACAUACCTT)的次序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于SiRNA是由一段19聚的寡聚核糖核酸和一个2聚的脱氧胸苷酸组成。因此起始物为固相(CPG)连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷(1-2umol)。具体每一个循环合成可分为四步来完成(图1)。第一步是将与固相连接的胸苷上5’位的保护基在3％三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷亚磷酰胺偶联到已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯。偶合时间和偶合循环的次数均按仪器厂家提供程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如：羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺。从而达到封闭作用，用以减少整体副产物的产生。重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(1)脱保护：将合成好的固相SiRNA放入一个可以密封的小瓶，并与加入1毫升的甲胺水溶液(10M，50％乙醇)，静置在室温。两小时后，取出溶液，并将固相CPG再次用乙醇；水和乙腈的混合液淋洗，并将淋洗液和前面取出的溶液合并一处，将其溶剂抽干。在小瓶中继续加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)。将溶液在室温静置12个小时。脱去所有寡聚核糖核酸上的保护基(包括碱基，核苷磷酸和核苷2’位的硅烷化保护基)。再经过乙醇沉淀，产生SiRNA的粗产物。
(2)纯化分离：将SiRNA的粗产物溶解在2毫升的乙酸铵的水溶液中，然后经过反相C18高压液相色谱的分离。运用梯度淋洗的方法，收集SiRNA的主产物(淋洗液A：0.1M的乙酸铵；淋洗液b：20％的0.1M的乙酸铵和80％的乙腈)。将SiRNA的主产物的溶剂除去，并加入5毫升80％乙酸水溶液，在室温静置15分钟。然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的SiRNA(梯度淋洗，淋洗液A：0.025M的Tris-HCl，0.025M NaClpH＝8，5％乙腈；淋洗液b：0.025M的Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝8，5％乙腈)。
(3)脱盐退火无菌消毒：纯化的SiRNA经过透析，除去盐份，SiRNA的溶液进行过滤消毒和干燥结晶.然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸进行退火处理形成稳定的双股交链的SiRNA。其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲溶液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)。将此溶液加热到95℃，然后缓缓将此溶液冷却致室温(此过程应不少于一个小时)。最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以便随时可以使用。
经过纯化后的SiRNA的纯度和鉴定有两种比较常用的办法。其一用毛细管凝胶电泳法来鉴定SiRNA的纯度，该方法可参见Paulus A，Ohms JI.Analysis ofoligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr1990，507：113-123。
其二是用MALDI-TOF质谱来准确测量其分子量，从而确定SiRNA的化学结构组成。
本发明所说的所有SiRNA都可以根据其序列采用上述方法制备，鉴定方法同上。
实施例2 SiRNA的转染
1、乙肝病毒的细胞模型：乙肝的细胞模型用的是HepG2.2.15细胞株。此细胞株是1987年由Acs博士的实验室将AYW亚型乙肝病毒的全长转入HepG2而形成，它一直是体外用来筛选抗肝炎病毒药物的标准细胞。该细胞在体外用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基来培养并且定时用G418筛选来维持肝炎病毒的高表达。(Sells MA，Chen ML，Acs G.Production of hepatitis B particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.PNAS1987；84：1005-1009.)
2、SiRNA的转染：SiRNA转入HepG2.2.15细胞借助于Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine来进行，具体步骤按照说明书来进行。简述如下，5×104的HepG2.2.15细胞接种于24孔培养板上过夜，第二天被转入SiRNA，然后继续培养72小时。
3、细胞上清抗原的测定：HepG2.2.15细胞在SiRNA作用72小时后，其培养上清中的HBsAg和HBeAg的水平用ELISA法测定。测定所用的HBsAg和HbeAgELISA药合由华美生物工程公司(www.sabc.com.cn)制造，具体步骤按照药合的说明书进行。
4、细胞内乙肝病毒DNA量的检测：细胞内的乙肝病毒DNA量用实时PCR的技术来测定。具体方法简述如下：先用Qiagen公司(www.qiagen.com)生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit来提取HepG2.2.15细胞的总DNA，然后将其浓度调整到2ng/ul。乙肝病毒的DNA的量用Applied Biosystem制造的ABI7700定量PCR测定仪来检测。PCR所用的两条引物的序列分别是AGTGTGGATTCGCACTCC和GAGTTCTTCTTCTAGGGGACC，探针的序列是CCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTC。PCR的具体操作步骤均按照Applied Biosystem的说明书来进行(www.appliedbiosystems.com)。
实施例3 SiRNA对乙肝病毒细胞模型中病毒的复制和致病相关蛋白合成的抑制作用
1、乙肝病毒细胞模型的选择：本实施例采用乙肝病毒细胞模型为标准的HepG.2.2.15细胞株，该细胞株由肝癌细胞被乙肝病毒AYW亚型的全基因组转染后筛选形成。肝炎病毒可在此细胞株内稳定复制和繁殖，并可产生病毒的各种抗原蛋白。
2、SiRNA的选择：如上所述，乙肝病毒基因组共表达五种mRNA分子，每个mRNA分子都负责编码不同的蛋白，并且在基因组DNA分子上转录起始和终止的位置也各不相同。因此编码不同蛋白的编码区相对应于基因组DNA的位置各不相同，其中e抗原蛋白的编码区自1816到1902，C抗原自1903到2454，多聚酶自2309到1625，前S1蛋白自2850到3176，前S2蛋白自3177到156，S蛋白自157到837，X蛋白自1376到1840。为了有效地攻击编码这些不同蛋白的mRNA，本发明选择了12个针对各个不同编码区的SiRNA分子(见下表)，除了它们对前基因RNA分子和e抗原mRNA的可能共同作用以外，不同的分子作用的编码区不尽相同，其中1号和2号主要针对表面抗原的mRNA，4号和5号针对X蛋白，6号和7号针对e抗原，8号针对核心抗原，9到11号针对核心抗原和聚合酶。
序列SiRNA编 可能攻击的mRNA 主要作用
号 号 正义链 反义链 攻击位置 分子 的蛋白质
GGUAUGUUGCC GACAAACGGGCAA 2.1kb，2.4kb，3.5k
7 N1 CGUUUGUCTT CAUACCTT 458-478 b，C/pol S
GUCUGUACAAC CUCAAGAUGUUGU 2.1kb，2.4kb，3.5k
12 N2 AUCUUGAGTT ACAGACTT 765-785 b，C/pol S
GUGUUUGCUGA GGGUUGCGUCAGC 1180-120 2.1kb，2.4kb，3.5k
24 N3 CGCAACCCTT AAACACTT 0 b，C/pol P
CUGGAUCCUGC CGUCCCGCGCAGG 1398-141 0.7kb，2.1kb，2.4k
75 N4 GCGGGACGTT AUCCAGTT 8 b，3.5kb，C/pol X
UGUCAACGACC UCAAGGUCGGUCG 1681-170 0.7kb，2.1kb，2.4k
31 N5 GACCUUGATT UUGACATT 1 b，3.5kb，C/pol X
CUUUUUCACCU UUAGGCAGAGGUG 1820-184 0.7kb，2.1kb，2.4k
35 N6 CUGCCUAATT AAAAAGTT 0 b，3.5kb，C/pol E
GCUGUGCCUUG AAGCCACCCAAGG 1876-189 0.7kb，2.1kb，2.4k
38 N7 GGUGGCUUTT CACAGCTT 6 b，3.5kb，C/pol E
UUUGGAGCUUC ACUCCACAGAAGC 1925-194 0.7kb，2.1kb，2.4k
40 N8 UGUGGAGUTT UCCAAATT 5 b，3.5kb，C/pol C
UGCCCCUAUCU UGUUGAUAAGAUA 2308-232
50 N9 UAUCAACATT GGGGCATT 8 3.5kb，C/pol C，P
GGUCUCAAUCG CGACGCGGCGAUU 2400-242
55 N10 CCGCGUCGTT GAGACCTT 0 3.5kb，C/pol C，P
UCUCGGGAAUC AACAUUGAGAUUC 2432-245
58 N11 UCAAUGUUTT CCGAGATT 2 3.5kb，C/pol C，P
UUAAUUAUGCC ACCUAGCAGGCAU 2631-265
63 N12 UGCUAGGUTT AAUUAATT 1 3.5kb，C/pol P
*：S＝HBsAg，P＝多聚酶，X＝X蛋白质，E＝HBeAg，C＝核心抗原
3、12个SiRNA分子对病毒复制和蛋白表达的抑制作用：
A、浓度为150nM的12个种SiRNA对病毒抗原表达和DNA量的作用：
用150nM的12种SiRNA作用于HepG2.2.15三天后，观察它们对病毒的表面抗原和e抗原的影响发现，表面抗原和e抗原的表达主要被针对其本身的SiRNA分子抑制。针对表面抗原的1号、2号SiRNA分子中，以2号分子最为有效，其抑制率约为60％，同时还发现针对X蛋白的4号对HBsAg也有明显的抑制作用(图1)。e抗原主要被针对其本身的6号和7号分子抑制，约为50％(图2)。其它的分子对两类抗原都有部份抑制作用。
观察这些SiRNA对细胞内乙肝病毒DNA量的作用时发现，每个SiRNA分子对病毒DNA数量的抑制作用也各不相同，其中以2、6、7、和10号分子的抑制作用最强，分别为87％、88.5％、88％、和88.4％。1、4、8、11号对DNA病毒DNA的水平也有明显的抑制作用(图3)。
从这些SiRNA分子对病毒抗原和DNA的作用来看，凡是对病毒抗原有明显抑制作用的分子对病毒DNA也有明显的抑制作用。
B、2、4、6号SiRNA对病毒抗原表达和DNA量的作用的浓度效应：
根据上述SiRNA分子对乙肝病毒抗原表达和DNA量作用的结果，选择了对HBsAg抑制作用最强的2号分子，对HBeAg最强的6号分子，再加上对X蛋白的4号分子，来作它们的不同浓度对病毒抗原和DNA量的抑制效应。
用10nM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM的2、4、6号分子，作用于HepG2.2.15细胞三天后观察细胞上清液中的HBsAg的量时发现，2号分子对该抗原的抑制作用最强，并且10nM的抑制作用已经十分明显，和最大抑制效应相差甚小。当浓度在40到80nM时抑制作用达到最大，约为62％，进一步增加浓度其抑制作用不仅不增加反而有减弱之趋势。不同浓度的4号分子对HBsAg的作用模式和2号十分相似，但作用要比2号弱10％到20％。6号分子对HBsAg的士表达无明显抑制作用(图3)。
观察HBeAg的变化时发现，只有6号分子对该抗原有明显的抑制作用，和2号、4号分子对HBsAg的抑制模式相似的是，6号分子的最大抑制效应在低浓度时就出现，在80nM以上浓度时其抑制效应不增加而反而下降(图4)。
不同浓度的三种分子对病毒DNA量的作用模式不尽相同，2号分子的最大抑制效应在10nM就出现，6号分子则在20nM出现，它们两者的最大抑制可在高浓度时维持。而4号分子对病毒DNA的抑制作用则和它的浓度成正比，到320nM时达到最强(图5)。
C、2、4、6号SiRNA对病毒抗原表达和DNA量的作用的联合效应：
从上述结果可知，2号和6号SiRNA分子都对病毒DNA的产生有很好的抑制效应，但它们本身只对其相应的病毒抗原的表达有抑制作用。为此，本发明进一步观察了同时联合使用2号和6号，以及2号和6号再加上4号对病毒抗原表达和DNA产生的效果。结果发现，同时使用2号和6号分子可以抑制细胞两种抗原的表达，这种作用在它们各自的浓度为20nM时已达到最大，两者的联合使用对HBsAg的表达有迭加效应，比单用4号的最大效应还要增加10％，但这种迭加效应在HBeAg的表达上并不明显，进一步再加上4号分子可以进而增加对抗原的抑制效应，但幅度不时很大(图6、图7)。由于单个分子对DNA量的抑制作用已经达到80％到90％，因此两个分子对DNA产生的迭加效应不明显，再加上第三种分子也无济于事，我们的结果表明，40nM的2号分子加上40nM的6号分子对DNA产生的抑制率超过90％(图8)。
实施例4 SiRNA的修饰
如上所述，修饰的种类可分三大类并且每一类中有许多变化，因此它们各自的合成方法不尽一样。这里列举两种最为常见的SiRNA修饰方法。并且，下述的方法并不限制本发明所述的有关对SiRNA修饰的保护范围。
1、硫化
硫化是指将核苷磷酸二酯键上的一个氧原子转变成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯.由于整个SiRNA的其它组成结构没有变化，因此它的合成和实施例1的SiRNA合成过程基本一样。只需将合成过程中的氧化反应变成硫化反应，在此反应中加入适当的硫化试剂，例如3H-1，2-benzodithiol-3-one 1，1-dioxide(又称Beaucage试剂)。
2、核苷2’位羟基的修饰
核苷2’位羟基的修饰是指用各种饱和烷氧基或不饱和烷氧来取代核苷五员糖环上的2’位羟基.其中最常见的是用甲氧基来取代核苷2’位的羟基。SiRNA的核苷2’位甲氧基化的合成和实施例1的SiRNA的合成步骤基本一致，只需要在偶合反应中用2’-甲氧基核苷亚磷酰胺来取代2’-叔丁基二甲基硅氧基核苷亚磷酰胺即可。
序列表
<110>杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司
<120>攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)及其应用
<160>77
<210>1
<211>3215
<212>DNA
<213>Hepadnavirus
<220>
<221>misc_feature
<222>1...3215
<223>双链DNA，从已知乙肝病毒ADR亚型的全基因组DNA序列得到的乙肝病毒
ADR亚型基因组共同序列，所列为正链的序列
<400>1
aactccacaa cattccacca agctctgcta gaccccagag tgaggggcct atactttcct 60
gctggtggct ccagttccgg aacagtaaac cctgttccga ctactgcctc acccatatcg 120
tcaatcttct cgaggactgg ggaccctgca ccgaacatgg agaacacaac atcaggattc 180
ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggagc acccacgtgt 300
cctggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaatt 360
tgtcctggct atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctacttccag gaacatcaac taccagcacg ggaccatgca agacctgcac gattcctgct 540
caaggaacct ctatgtttcc ctcttgttgc tgtacaaaac cttcggacgg aaactgcact 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc 780
ttgagtccct ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc 840
ctaataaaac caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt 900
ggggtacttt accgcaagaa catattgtac taaaantcaa gcaatgtttt cgaaaactgc 960
ctgtaaatag acctattgat tggaaagtat gtcagagaat tgtgggtctt ttgggctttg 1020
ctgccccttt tacacaatgt ggctatcctg ccttaatgcc tttatatgca tgtatacaat 1080
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatatctga 1140
acctttaccc cgttgcccgg caacggtcag gtctctgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggatg gggcttggct attggccatc gccgcatgcg tggaaccttt gtggctcctc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagcag cttgttttgc tcgcagccgg tctggagcga 1320
aacttatcgg aacngacaac tctgttgtcc tctctcggaa atacacctcc tttccatggc 1380
tgctagggtg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtctac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc cgcggacgac ccgtctcggg gccgtttggg actctaccgt ccccttcttc 1500
atctgccgtt ccggccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggtccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaacgcc caccaggtct tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaagg actgggagga 1740
gttgggggag gagattaggt taangntctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
ctgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat 1920
aaagaatttg gagcttctgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttct 1980
attcgagatc tcctcgacac cgcctctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa 2040
cattgttcac ctcaccatac agcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttgatg 2100
aatctggcca cctgggtggg aagtaatttg gaagacccag catccaggga attagtagtc 2160
agctatgtca atgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc 2220
tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt 2280
cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact 2340
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtatccc 2460
ttggactcat aaggtgggaa actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520
tcctgagtgg caaactccct cctttcctca cattcattta caggaggaca ttattaatag 2580
atgtcaacaa tatgtgggcc ctcttacagt taatgaaaaa aggagattaa aattaattat 2640
gcctgctagg ttctatccta accttaccaa atatttgccc ttggacaaag gcattaaacc 2700
atattatcct gaacatgcag ttaatcatta cttcaaaact aggcattatt tacatactct 2760
gtggaaggct ggcattctat ataagagaga aactacacgc agcgcctcat tttgtgggtc 2820
accatattct tgggaacaag agctacagca tgggaggttg gtcttccaaa cctcgacaag 2880
gcatggggac gaatctttct gttcccaatc ctctgggatt ctttcccgat caccagttgg 2940
accctgcgtt cggagccaac tcaaacaatc cagattggga cttcaacccc aacaaggatc 3000
actggccaga ggcaaatcag gtaggagcgg gagcattcgg gccagggttc accccaccac 3060
acggcggtct tttggggtgg agccctcagg ctcagggcat attgacaaca gtgccagtag 3120
cacctcctcc tgcctccacc aatcggcagt caggaagaca gcctactccc atctctccac 3180
ctctaagaga cagtcatcct caggccatgc agtgg
<110>杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司
<120>攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)及其应用
<160>77
<210>2
<211>3215
<212>DNA
<213>Hepadnavirus
<220>
<221>misc_feature
<222>1...3215
<223>双链DNA，从已知乙肝病毒ADW亚型的全基因组DNA序列得到的乙肝病毒
ADW亚型基因组共同序列，所列为正链的序列
<400>2
ctccaccact ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggccctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaanccc tgntcagaat actgtctctg ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacna ccagcacngg accatgcaaa acctgcacna ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aaagatgggg atantccctt aacttcatgg gatatgtaat tggnagttgg 900
ggcacattnc cacaggaaca tattgtacta aaaatcaaac aatgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt ggggtttgct 1020
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aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca ntatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggagcaaaa 1320
cttatcggga ctgacaattc tgtcgtcctc tcccgcaaat atacatcntt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgc 1500
ctgccgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga aganccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaan gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcatatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct ngctttaatc 2520
ctnaatggca aactccttct tttcctgaca ttcatttgca ggaggacatt nttgatagat 2580
gtaagcaatt tgtgggnccc cttacagtaa atgaaaacag gagactaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcccaat gttactaaat atttgccctt agataaaggn atcaaacctt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacgag acattattta catactcttt 2760
ggaaggcggg natnttatat aaaagagagn cnacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatcct ctgggattct tncccgatca ncagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agacaatcca gattgggacc tcaacccnca caaggacaac 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac cccnccccat 3060
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ctaagagaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa
<110>杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司
<120>攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子(SiRNA)及其应用
<160>77
<210>3
<211>3182
<212>DNA
<213>Hepadnavirus
<220>
<221>misc_feature
<222>1...3182
<223>
双链DNA，从已知乙肝病毒AYW亚型的全基因组DNA序列得到的乙肝病毒AYW亚型基因组共同序列，所列为正链的序列
<400>3
aactccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttccga ctactgcctc tcccatatcg 120
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180
ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
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