一种酮类化合物及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种酮类化合物及其制备方法与应用，特别涉及一种酮类化合物，利用微生物转化制备该化合物的方法及以该化合物为活性成分的抗肿瘤药物。
背景技术
微生物转化具有底物特异性高，产物立体选择性强，反应条件温和、无污染等特点，目前已应用于多种药物如抗生素、维生素、甾体激素、氨基酸、芳基丙酸和前列腺素等的合成，也用于具有生理活性的新化合物的合成。具有式(II)结构的梣酮(fraxinellone)于1930年由H.Thoms和C.Dambergis从白鲜(Dictamnus albus)中分离得到(H.Thoms and Constantin Dambergis，Arch.Pharm.1930，268，39)，1969年P.Coggon等确定了该化合物的结构及绝对构型(P.Coggon，A.T.McPhail，R.Storer and D.W.Young，Chem.Commun.1969，828)。梣酮的药理活性报道很少，其中抗受精作用由于有效剂量与半数致死量之间差距太小而被认为没有实用价值(Won Sick Woo，Eun Bang Lee，Sam Sik Kang，Kuk Hyung Shinand Hyung Joon Chi，Planta Medica 1987，399)。T.S.Wu等和S.M.Yu等报道梣酮是Ca2+通道电压依赖性的阻断剂，有抗血小板凝集和血管舒张作用。1997年S.Kim等首次报道梣酮、白鲜碱、前茵芋碱(preskimmianine)对肺淋巴肿瘤L1210有抑制作用，但梣酮的效果不如前茵芋碱(S.W.Kim，W.H.Yeo，Y.S.Ko and S.K.Kim，Saengyak Hakhoechi 28，209)。此外Z.L.Liu等报道梣酮和白鲜碱对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和玉米象(Sitophilus zeamais)有拒食作用(赤拟谷盗是面粉厂的重要害虫，可使面粉霉变、结块；玉米象是重要的第一食性储粮害虫)。梣酮在白鲜皮中含量较高，结构中有多个官能团。
式(II)
发明创造内容
本发明的第一个目的是提供一种新的具有抗肿瘤活性的酮类化合物。
本发明所提供的酮类化合物为梣黑酮(fraxinigerllone)，其化学结构如式(I)所示：
式(I)
本发明的第二个目的是提供一种制备式(I)化合物的方法。
一种制备式(I)化合物的方法，是用黑曲霉(Aspergillus niger)转化梣酮，并自发酵液中提取梣黑酮(fraxinigerllone)。
黑曲霉(Aspergillus niger)可为AS 3.421等。可先将黑曲霉(Aspergillusniger)培养至对数生长期，再向处于对数生长期的黑曲霉发酵液中加入梣酮。所加入梣酮的量为50mg/L。
梣酮可先溶于与水互溶的有机溶剂，如丙酮、乙醇等，再经黑曲霉转化后得到产物。梣酮经处于对数生长期的黑曲霉在26-30℃发酵3-5天后，可自此发酵液中提取式(I)化合物，提取地具体步骤为：先除去菌体，去除菌体的菌液经乙酸乙酯萃取后，除去溶剂，再经柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，在石油醚-乙酸乙酯的组成比例为5∶1时得到梣黑酮(fraxinigerllone)。
本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤药物。
本发明所提供的抗肿瘤药物，以梣黑酮(fraxinigerllone)为活性成分。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明巧妙地利用黑曲霉的转化功能，创造性地以梣酮为底物，获得了一种新的具有抗肿瘤活的酮类化合物—梣黑酮，在制药等领域将得到广泛应用。
【附图说明】
图1为梣黑酮的1HNMR图谱
图2为梣黑酮的EI-MS图谱
图3为梣黑酮的13CNMR图谱
图4为梣黑酮的DEPT图谱
图5为梣黑酮的1H-1H COSY图谱
图6为梣黑酮的HMQC图谱
图7为梣黑酮的HMBC图谱
图8为梣酮和梣黑酮对EC9706细胞系的抑制曲线
图9为梣酮和梣黑酮对A549细胞系的抑制曲线
【具体实施方式】
实施例1、梣黑酮(fraxinigerllone)的制备
1)菌种活化
将黑曲霉(Aspergillus niger)AS 3.421菌种接种于含有蔗糖(30g)、NaNO3(3g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、KCl(0.5g)、K2HPO4·3H2O(1.3g)、FeSO4·7H2O(0.06g)、琼脂(20g)和蒸馏水1000ml的固体斜面上，在28℃，培养3天。
2)底物的转化
将黑曲霉(Aspergillus niger)AS 3.421从斜面接种到盛有50ml的无菌培养基(蔗糖(30g)、NaNO3(3g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、KCl(0.5g)、K2HPO4·3H2O(1.3g)、FeSO4·7H2O(0.06g)和蒸馏水1000ml)的250ml锥形瓶中，在28℃、180转/分振摇48小时后得到菌液(I)，菌液(I)再以5ml/瓶的接种量转接入盛有50ml无菌培养基的250ml锥形瓶中，振摇24小时(达至对数期)后加入梣酮的丙酮溶液(12.5mg梣酮/0.4ml丙酮/瓶)。在28℃、180转/分培养4天后，过滤菌体，滤液用乙酸乙酯萃取三次，合并滤液，减压蒸除溶剂，得到浸膏。
3)转化产物分离
将浸膏用硅胶柱层析分离(硅胶300-400目)，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，在石油醚-乙酸乙酯5∶1时得到淡黄色油状的梣黑酮(fraxinigerllone)。
4)梣黑酮(fraxinigerllone)的鉴定
通过波谱解析方法对上述得到的梣黑酮(fraxinigerllone)进行结构鉴定结果如图1-7所示，表明得到的产物结构正确，为式(I)化合物，其中如图1、3和4所示，将该化合物与梣酮的NMR谱相比较，表明梣黑酮的13CNMR谱中羰基(δ169.1)、C-3(δ82.4)的信号及1HNMR谱中3a-Me(δ0.90)、7-Me(δ2.13)的信号都与梣酮相符，说明C环和D环都没有发生变化；梣黑酮的13CNMR谱与梣酮相比多出一个酯羰基(δ171.7)和一个连氧仲碳(δ71.1)的信号，少了一个双取代双键的信号，说明呋喃环上的一个双键被氧化，EI-MS中m/z 248的分子离子峰确证以上基团的存在，符合以上推论的结构片段有两个，如式(III)和式(IV)：
式(III) 式(IV)
具有结构片段式(III)和式(IV)的化合物的1HNMR谱数据如表1所示：
表1、梣黑酮及其相关化合物的1HNMR数据
式(III)化合物 式(IV)化合物 梣黑酮
H-4’(3’) 7.10 5.58 7.59
H-5’ 4.86 4.94
将梣黑酮的1HNMR谱数据与以上结构片段类似物比较后确定梣黑酮应该拥有如式(IV)所示结构片段。根据2D-NMR谱(如图5、6、7所示)将式(IV)的碳氢进行归属和表2，认定该结构是一个新化合物，将其命名为梣黑酮(fraxinigerllone)。
表2、化合物梣黑酮的NMR数据
位号 δC δH(J) H-H COSY HMBC
1 169.1 - - -
3 82.4 4.75brd(1.9) H-4’，H-5’ 3a-Me
3a 42.7 - - 3a-Me
4 32.1 1.66-1.88m H-5，H-6 H-5，3a-Me
1.57dt(13.0，3.4)
5 18.3 1.66-1.88m H-4，H-6 H-4，H-6
6 32.1 2.28dd(19.6，6.6) H-4，H-5 H-5
2.19dd(10.4，7.0)
7 126.5 - H-6 H-6，7a-Me
7a 150.5 - H-6 H-6
2’ 171.7 - - H-4’
3’ 130.5 - - H-3，H-5’
4’ 148.0 7.59d(1.6) H-3，H-5’ H-3，H-5’
5’ 71.1 4.94t(1.9) H-3，H-4’ H-3，H-4’
3a-Me 20.8 0.90s - H-3
7-Me 18.6 2.13s - H-6
实施例2、梣黑酮(fraxinigerllone)抗肿瘤活性测试
应用食管癌细胞EC9706和肺癌细胞A549，采用MTT染色法(样品用无毒剂量的DMSO溶解)进行体外活性测试。以仅加入同等浓度的DMSO的细胞为对照，测定100μg/ml梣酮和87μg/ml梣黑酮对EC9706细胞系和A549细胞系的抑制效果。实验数据为6次重复的平均值。结果如表3、表4、图8和图9所示，表明新化合物梣黑酮(fraxinigerllone)对EC9706和A549有抑制效果，当其浓度为87μg/ml时三天抑制率分别达到19.92％和32.04％。
表3、梣酮和梣黑酮对EC9706细胞系的抑制效果
时间(天) 对照(OD490nm) 100μg/ml梣酮(OD490nm) 87μg/ml梣黑酮(OD490nm)
1 0.464±0.013 0.514±0.033 0.444±0.013
2 0.654±0.011 0.724±0.030 0.559±0.020
3 0.813±0.011 0.786±0.024 0.651±0.019*
注：*表示与对照相比P＜0.05
表4、梣酮和梣黑酮对A549细胞系的抑制效果
时间(天) 对照(OD490nm) 100μg/ml梣酮(OD490nm) 87μg/ml梣黑酮(OD490nm)
1 0.478±0.013 0.534±0.019 0.424±0.005
2 0.699±0.038 0.774±0.029 0.518±0.026
3 0.979±0.021 0.946±0.010 0.666±0.030**
注：**表示与对照相比P＜0.01