编码重组的来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa抗原的核酸，和 它们的应用 本申请要求2001年7月6日提交的美国临时申请号60/303,670的利益，该申请的内容因此通过参考结合于本申请。
贯穿本申请，在括号中参考了各种出版物。在说明书的结尾紧接着权利要求之前可以发现以字母顺序列出的这些出版物的完整引用。这些出版物它们的全部公开内容因此通过参考结合于本申请以便更充分地描述本发明所属领域的状况。
【发明背景】
在鸡中导致被称为“球虫病”的疾病地生物属于顶复门(phylumApicomplexa)，孢子纲，球虫亚纲，真球虫目(order Eucoccidia)，艾美球虫亚目(suborder Eimeriorina)，艾美球虫科(family Eimeriidae)，艾美球虫属(genus Eimeria)。在艾美球虫属内存在许多的种，其中几种在鸡中是致病的。对于鸡产业主要关注的物种是柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)，巨型艾美球虫(Eimeria maxima)，堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)，扁嘴艾美球虫(Eimeria necatrix)和布氏艾美球虫(Eimeria brunetti)。
在过去的几十年中，球虫病已经成为鸡产业中的主要经济问题，主要是由于鸡场的过度拥挤和寄生虫抗药性的发展。在干草地面上的拥挤条件下饲养鸡为艾美球虫属寄生虫的生长和传播提供了最适的条件。在该情形下，卫生控制是不可能的，农民必须依靠抑球虫剂药物的效力。然而，必须将药物一直保持在饲料中，必须使用穿梭计划(shuttle program)以避免艾美球虫属的耐药品系出现，并且某些药物具有昂贵的副作用。另外，这些抑球虫剂还具有抗菌效果并因此被认为是进料(in-feed)抗生素。最近欧盟已经决定在鸡产业中禁止使用包括抗球虫药的所有进料抗生素。因此，未来控制球虫病的唯一可行方法是通过疫苗开发。
艾美球虫属寄生虫在肠道的粘膜中经历复杂的生活周期。除了缺乏节肢动物媒介，该生活周期与其它血孢子虫寄生虫(即疟原虫属，巴贝虫属等)非常相似。卵囊在干草地面上形成孢子，产生4个孢囊，每个包含2个子孢子(因此属于孢子纲)。卵囊被鸡摄食，孢囊通过砂囊的机械研磨释放。然后，由于在肠内蛋白水解酶消化孢囊壁，子孢子从孢囊释放。然后可移动的子孢子侵入淋巴细胞并继续侵入上皮细胞，在那里开始无性生殖周期。寄生虫经历2-4个复制和分裂周期(每个物种具有确定的分裂数)，导致大量子裂殖子的产生。在裂殖子产生的末循环之后开始性周期，产生大配子母细胞(雌性)和小配子母细胞。大配子母细胞其特征在于成壁体(wall forming bodies)的产生，而小配子母细胞包含涉及小配子的形成的组分，小配子从胞内寄生虫的表面出芽。
小配子是有鞭毛的并负责大配子的受精。形成合子，其通过成壁体的融合和细胞核的浓缩成熟为卵囊。卵囊分泌在粪便中，从而完成循环。
在过去几年中，已经使用源于巨型艾美球虫的性(配子母细胞)阶段的天然抗原来免疫产卵的母鸡。子代鸡因此通过母体免疫(保护性母体抗体)接种。在巨型艾美球虫的配子母细胞中先前已经鉴定3种主要的保护性抗原，其具有250，82和56kDa的分子量(欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225)。欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225因此通过参考结合到本发明中以便更充分地描述本发明所属领域的状况。已经显示这些抗原在艾美球虫属的物种之间是很保守的(Wallach 1995)并且可以交叉保护免遭在肉用仔鸡中导致球虫病的3种主要物种-巨型艾美球虫，柔嫩艾美球虫和堆型艾美球虫的侵袭。新近，显示在地面围栏试验(floor pen trials)中，源自用这些天然配子母细胞抗原接种的母鸡的小鸡在野外条件下被保护免遭艾美球虫属侵袭(Wallach 1996)。该保护的作用为将卵囊释放的峰值降低到对肉用仔鸡的性能不导致任何破坏作用的水平。基于上述结果得出结论，这些抗原对鸡的球虫病有效并有可能用于防止包括火鸡，鹅，羊，牛，猪和鱼的其它家畜的球虫病。
这3种抗原特征还在于分子水平。进行无细胞翻译实验以鉴定编码它们的RNA分子(Mencher等)。通过免疫筛选在表达载体λzap中制备的cDNA文库来克隆编码这些抗原的cDNA分子(4，美国专利号5,932,225)。通过该方法，克隆和部分测序了编码250kDa抗原的基因。在美国专利号5,932,225和5,496,550中部分测序了克隆pEM 250/14。本申请的图8a复制美国专利号5,932,225和5,496,550的图11，其描绘了克隆pEM 250/14开始的293个核苷酸的DNA序列。本申请的图8b复制美国专利号5,932,225和5,496,550的图12，其显示了克隆pEM 250/14最后的196个核苷酸的DNA序列。此外，在美国专利号5,932,225和5,496,550中，克隆和测序了推定的编码56和82kDa抗原的基因。
随后，Fried等将整个pEM 250/14克隆测序并发现抗原具有230kDa的分子量而不是以前所认为的250kDa。Fried等发现230kDa基因包含高度重复的基序并且贯穿整个基因包含这些重复(Fried等)。使用pATH质粒载体在细菌中表达该克隆，显示它被在感染巨型艾美球虫14天后采取的恢复期的鸡血清识别。最后，显示该基因只在大配子母细胞阶段表达，并通过免疫荧光发现位于大配子的成壁体中(Fried等)。
通过使用针对56kDa抗原的多克隆抗体以及单克隆抗体筛选文库还获得编码56和82kDa抗原的cDNA克隆。先前显示该单克隆抗体给幼鸡提供被动免疫(Wallach 1990)。获得并分析几个克隆。发现克隆中的一个编码10kDa的小抗原，因此不是所需克隆。发现另一个克隆只包含可读框(ORF)的一小部分，并通过RNA印迹法显示与对于56和82kDa抗原差不多期望大小的两条mRNA杂交。因此得出结论这是所需克隆。然后筛选基因组文库以获得全长克隆。然而，由于在该克隆中高度重复的GCA基序，不可能特异性地分离全长克隆。由于这些重复导致克隆全长cDNA分子的尝试也不成功。最后，可能由于它们的异常序列在细菌中表达部分cDNA克隆的尝试也失败了，未获得合理的基因表达水平。先前已经显示56和82kDa抗原是糖基化的(美国专利号5,932,225)。这是基于它们与大豆凝集素的强烈反应性。因此，可能需要糖基化作用以便获得这些基因的良好表达和基因产物的正确构象。
除了56，82和230kDa抗原以外，从高度纯化的卵囊壁的级分中获得的14kDa抗原已经被提议作为防止球虫病的疫苗的可能候选物(Eschenbacher等)。然而，该假说没有被研究。
几个实验室已经正在研究针对球虫病的亚单位疫苗。这些研究人员大部分已经将它们的努力集中在生活周期的胞外无性繁殖阶段，特别是子孢子和裂殖子阶段，其被认为是最易受免疫攻击。在先前的研究中发现来自柔嫩艾美球虫的子孢子提取物可以在肉仔鸡中诱导针对该寄生虫的保护以防攻击感染达7周龄(Karkhanis等)。使用针对来源于柔嫩艾美球虫子孢子的抗原的单克隆抗体进行的工作导致25,000分子量抗原的鉴定，其被克隆和测序(欧洲专利公开号0 164 176，1985年12月11日)。鉴定了其它几个子孢子基因并且检验它们的重组抗原或转化细菌本身的保护性免疫(Danforth等)。结果显示这些重组体只能提供针对艾美球虫属攻击感染的相对低水平的保护，并不一定防止显著病变的出现。
也已经检验使用来源于裂殖子阶段的抗原的疫苗(欧洲专利公开号0135 073)。使用这些抗原来免疫幼肉仔鸡，再次发现提供的保护是相对低的(Danforth等)。
在1993年，发现在保护性母体免疫和针对巨型艾美球虫230kDa裂殖子(与配子母细胞相对)抗原的母体抗体的出现之间存在相关性(Smith等)。该保护经常是在90％以上并发现即使当母体抗体水平相对低(尽管与230kDa蛋白质的反应性仍然强烈)的时候也存在。还发现从SDS-PAGE凝胶切割的极少量的天然230kDa裂殖子抗原可以在子代鸡中诱导针对巨型艾美球虫感染的显著(60％)水平的保护性母体免疫。另外，蛋白质印迹显示该蛋白质在巨型艾美球虫的裂殖子和子孢子中都表达，并且在艾美球虫属的物种之间也很保守。
然而，从寄生虫它本身大规模地分离巨型艾美球虫裂殖子的230kDa抗原是非常困难的。因此，需要克隆和重组表达该抗原。这将能够生产用于接种的抗原和检验它诱导保护性免疫的最适浓度。
发明概述
本发明提供分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或者编码该多肽的同源物的核苷酸序列。
本发明另外提供生产重组的来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽的方法，其包含培养转化细胞和分离重组的来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，所述转化细胞包含分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或者编码该多肽的同源物的核苷酸序列。
本发明还提供针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉活性抗原的微生物的疫苗，其包含分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或者编码该多肽的同源物的核苷酸序列。
本发明还提供另外包含从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的56kDa，82kDa或230kDa蛋白质或其混合物的上述疫苗。
本发明还提供针对球虫病的疫苗，其包含重组的250kDa抗原。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉活性抗原的微生物的感染的方法，其包含向受试者施用上述疫苗中任何一种的步骤。
本发明还提供分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码具有SEQ.ID.NO26所示氨基酸序列、来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码该多肽的同源物的核苷酸序列。
附图简述
图1使用来源于母体免疫试验的血清和卵黄，巨型艾美球虫形成孢子的卵囊的粗提物的蛋白质印迹。泳道1-感染巨型艾美球虫的母鸡的12日龄孵化小鸡(hatchling)的血清，其也暴露于攻击感染；泳道2-来自感染巨型艾美球虫的母鸡的3日龄孵化小鸡的血清；泳道3-来自使用SDS-PAGE剪切块(cutout)250kDa裂殖子蛋白质条带免疫的母鸡的卵黄；泳道4-来自用裂殖子粗提物免疫的母鸡的血清。用图左边的箭头显示250kDa条带。
图2使用各种浓度的NaCl，来自DEAE-sephacel柱的形成孢子的卵囊的洗脱图(OD 280)。
图3离子交换分级的形成孢子的卵囊提取物的银染色(3a)和蛋白质印迹(3b)分析。使用来源于用裂殖子粗提物免疫的母鸡的血清进行蛋白质印迹。在左边显示250kDa蛋白质条带。
图4来自DEAE柱的形成孢子的卵囊提取物级分的蛋白质印迹分析，其是用来自通过活体感染(live infection)免疫的母鸡3日龄的子代鸡的血清检测。用于洗脱的NaCl浓度在印迹的底部显示，用箭头显示250kDa蛋白质条带。
图5来源于PCR的扩增的cDNA产物，PCR使用对编码250kDa抗原的基因的3’和5’末端特异的基因特异性引物。泳道1显示DNA标记带，泳道2显示7 KB PCR产物的条带。
图6 250kDa cDNA克隆的完整DNA序列。显示编码序列，它的互补序列和氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.1-3)。
图7A&7B 250kDa cDNA巨型艾美球虫克隆与来自专利WO90/00403.7A)的同源DNA序列的多重序列对比，DNA序列对比显示60％的同源性(SEQ.ID.Nos.4-5.7B)，蛋白质序列对比显示59％的同源性(SEQ.ID.NOs.6-7)。
图8a描述克隆pEM 250/14开始的293个核苷酸的DNA序列。显示编码序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.11-12)。图8b描述克隆pEM250/14最后的196个核苷酸的DNA序列。显示编码序列和它的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.13-14)。
图9在5％聚丙烯酰胺凝胶上所分离巨型艾美球虫形成孢子的卵囊的粗提物的蛋白质印迹分析，其使用选择的来自母体免疫试验的血清和卵黄(Smith等，1995)。泳道1，来自感染巨型艾美球虫的母鸡的3日龄孵化小鸡的血清；泳道2，在孵化小鸡感染巨型艾美球虫之后，感染巨型艾美球虫的母鸡的12日龄孵化小鸡的血清；泳道3，来自用裂殖子粗提物免疫的母鸡的血清；泳道4，来自用250kDa裂殖子蛋白质条带的SDS-PAGE剪切块免疫的母鸡的卵黄；泳道5，来自未感染的对照组的血清。
图10巨型艾美球虫形成孢子的卵囊粗提物的DEAE离子交换层析。将大约1.0mg提取物加入柱子并用在40mM Tris.HCL pH8.0中的0.0-1MNaCL的分级梯度以0.7mL/min的流速洗脱。手动收集级分，级分大小为10-15mL。
图11离子交换分级的巨型艾美球虫形成孢子的卵囊提取物的银染色(a)和蛋白质印迹分析(b)。将15μl的每个级分加样在平行的7.5％SDS-PAGE凝胶上并在还原条件下电泳。用来源于使用裂殖子粗提物免疫的母鸡的血清免疫检测蛋白质印迹。(*柱流通(flow-through)(未结合的蛋白质级分)。)
图12富集免疫显性蛋白质并且在还原条件下的5％SDS-PAGE凝胶上电泳的离子交换层析级分的银染色(a)和蛋白质印迹分析(b)。用保护性母体抗血清免疫检测蛋白质印迹，该抗血清收获自在孵化小鸡感染巨型艾美球虫之后在孵化小鸡感染巨型艾美球虫之后，感染巨型艾美球虫的母鸡的12日龄孵化小鸡。(*分子量标记(2μL))
图13富集免疫显性蛋白质的离子交换层析级分的Superdex 200凝胶过滤层析。合并用0.3-0.4M NaCL从10mg形成孢子的卵囊粗提物洗脱的IEX级分，并浓缩至15μL的样品体积。将样品加样到柱上并以50μL/min的流速洗脱。如所示自动收集50μL大小的级分。
图14在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离的凝胶过滤层析级分的银染色。在还原条件下电泳来自级分7-15中每一个的10μL样品。泳道1，分子量标记(Amersham Rainbow MWM，2μL)；泳道2，级分7；泳道3，级分8；泳道4，级分9；泳道5，级分10；泳道6，级分11；泳道7，级分12；泳道8，级分13；泳道9，级分14；泳道10，级分15。箭头显示免疫显性蛋白质。
图15 Triton X-114分级的裂殖子的蛋白质印迹分析，所述裂殖子用来自使用巨型艾美球虫的裂殖子粗提物免疫的母鸡的血清来免疫检测。如所示在非离子型去污剂EX-114中分配纯化的裂殖子。泳道1，TX-114水溶性级分；泳道2，TX-114去污剂可溶性级分；泳道3，TX-114去污剂不溶性级分。(*柱流通(未结合的蛋白质级分)。)
图16来源于无性和有性发育阶段的巨型艾美球虫的抗原粗提物的蛋白质印迹分析。在还原条件下在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳10μg如上所述制备的每种提取物的样品。泳道1，形成孢子的卵囊提取物；泳道2，裂殖子提取物；泳道3，配子母细胞提取物。使用来自感染裂殖子粗提物的母鸡的血清来免疫检测蛋白质印迹。
图17巨型艾美球虫Houghton品系和巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的澳大利亚品系的形成孢子的卵囊粗提物的蛋白质印迹分析，其使用来自感染来源于巨型艾美球虫Houghton品系的裂殖子粗提物的母鸡的血清来免疫检测。将10μg每种提取物的样品加样到7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并在还原条件下电泳。A，泳道1，Houghton巨型艾美球虫；泳道2，澳大利亚巨型艾美球虫。B，泳道1，澳大利亚巨型艾美球虫；泳道2，澳大利亚柔嫩艾美球虫。
图18在还原和非还原条件下在7.5％(A)和5％(B)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离的免疫显性蛋白质的蛋白质印迹分析。在样品缓冲液中含有或不含2-β-巯基乙醇的情况下电泳富集免疫显性蛋白质的离子交换层析级分。A：泳道1，不含β-ME；泳道2，2.5％β-ME；泳道3，3.75％β-ME；泳道4，5％β-ME；泳道5，7.5％β-ME；泳道6，10％β-ME。B：泳道1，不含β-ME；泳道2，2.5％β-ME。用来自感染裂殖子粗提物的母鸡的抗血清来免疫检测蛋白质印迹。
图19从巨型艾美球虫形成孢子的卵囊中分离出的并通过在1％非变性琼脂糖凝胶上电泳分离的总RNA，泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；泳道2，2.5μg形成孢子的卵囊RNA。显示28S和18S核糖体RNA条带。
图20巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的胰蛋白酶肽#1和来自柔嫩艾美球虫的EtMIC4和表面抗原5401的所选基序之间的相似性。在基于EmIP的胰蛋白酶肽#1设计简并PCR引物中考虑保守半胱氨酸残基(以黑体字显示)。记录基序的号码指它们各自在EtMIC4/5401氨基酸序列内部的位置。(SEQ.ID NOS.15-19)
图21使用简并引物FP008来3’RACE扩增巨型艾美球虫的形成孢子的卵囊的cDNA。在1％琼脂糖凝胶上分离反应样品和分子量标记。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；泳道2，10μL 100bp的DNA序列梯。
图22与使用引物FP008产生的3’RACE PCR产物的翻译序列共享同源性的蛋白质序列。通过NCBI提交445bp的查询以进行针对所有非冗余蛋白质数据库的BLASTX分析。列出10个最高分并显示最有意义分数的对比。(SEQ.ID NO.20)
图23编码EmIP的中间cDNA产物的产生和在0.8％琼脂糖凝胶上分离。用简并引物FP004和基因特异性引物RP016的扩增产生微弱可见的，大约6kb的适当大小的条带(A，泳道2)。凝胶纯化条带，并通过使用简并引物FP006和基因特异性引物RP015的巢式PCR反应表征。扩增大约6kb的期望大小的条带(B，泳道2)，并用箭头显示。A：泳道1和B：泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；A：标记2和B：泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；A：泳道2和B：泳道2，10μL如所示的PCR反应产物。
图24编码EmIP的CDNA的5’末端的扩增。在5’RACE反应中与AP1一起使用基因特异性引物RP019和RP020(分别泳道2和3)。在泳道3中可见的500-600bp的产物进一步通过使用引物RP019和AP2的巢式PCR反应表征(泳道4)。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；泳道2，3和4，10μL如所示的PCR反应产物。在0.8％的琼脂糖凝胶上分析样品。
图25用引物AP2和RP019产生的5’PCR产物的部分DNA序列和预测的氨基酸序列。推定的起始甲硫氨酸是以黑体字显示在位置231处，上游符合读框的TAG密码子在位置186处。给通过Edman测序预测的成熟蛋白质的N-末端序列加上方框。(SEQ.ID.NOS.21-23)
图26编码完整的成熟巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的cDNA的产生。分别从5’和3’RACE序列设计的基因特异性引物FP015和RP023扩增约7kb的单一PCR产物(泳道2)。泳道1，1μgλDNA/HindIII标记；泳道2，10μL如所示的PCR反应产物。在0.8％的琼脂糖凝胶上分离样品。
图27用于克隆巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的cDNA的PCR策略的图解概要。该图描述产生不同cDNA片段的顺序。底部的横条表示全长cDNA。带箭头的线条表示通过指示的引物对扩增的重叠的cDNA区域(也通过在括号中相应的bp数显示)
图28使用巨型艾美球虫免疫显性蛋白质推定的cDNA编码区的BLASTN相似性搜索。列出5个最高的分数并且显示具有最有意义的分数-EtMIC4的mRNA-的对比。(SEQ.ID NO.24)
图29巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的核苷酸和预测的氨基酸序列。(SEQ.ID NOS.25-26)序列来源于编码完整的成熟蛋白和重叠5’和3’RACE产物的cDNA克隆。在预测的信号序列下划线并给成熟蛋白质的N-末端氨基酸序列加上方框。
图30 CLUSTALW(4.1)对比，其显示存在于巨型艾美球虫免疫显性蛋白质内的预测的TSP-1样结构域。以50％同一性的截止确定共有序列，其显示WXXW和RXR基序(加下划线)。高度保守的半胱氨酸以黑体字显示。
图31存在于巨型艾美球虫免疫显性蛋白质内、预测的EGF-系样结构域的CLUSTALW(4.1)对比。以75％同一性的截止确定共有序列，以黑体字显示高度保守半胱氨酸残基。
图32在预测的巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的多肽序列内的低复杂性区域A：突出低复杂性区域1的简并重复基序的CLUSTALW(4.1)对比。共有序列显示保守的同一性，通过‘.’显示的残基之间的相似性。B：低复杂性区域2，其显示高频率的谷氨酸，甘氨酸和脯氨酸残基。
图33 EmIP和其它属于顶复虫(apicomplexan)微丝蛋白质TRAP家族的蛋白质的跨膜和胞质尾区的对比。在推定的跨膜区域下划线，保守酪氨酸和色氨酸残基以黑体显示。序列是来源于下列生物：巨型艾美球虫(EmIP，EmIP100)；柔嫩艾美球虫(EtMIC4，EtMICl/Etp100)；隐孢子虫(Cryptosporidum parvum)(cpTRAPC1，CpGP900)；Neospara caninum(NcTRAP)；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(PfTRAP PFCTRP)；伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)(PbTRAP)；晨疟原虫(Plasmodiumrelictum)(PrTRAP)；诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)(PkDBP)；鼠肉孢子虫(Sarcocystis muris)(Sm70)；鼠弓形体(Toxoplasma gondii)(TgMIC2，TgMIC6，TgMIC7，TgMIC8，TgMIC9，TgAMAl)。(SEQ.ID NOS.27-41)
图34显示主要结构特征的巨型艾美球虫的免疫显性蛋白质的图示。
图35与巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的预测氨基酸序列共享同源性的蛋白质序列。通过NCBI提交表示成熟蛋白质的序列以进行针对所有非冗余蛋白质数据库的BLASTP分析。列出20个具有最高显著性的对比。
图36在使用GAP程序对比后显示EmIP和EtMIC4氨基酸序列之间的相似性的GAPSHOW图。顶部未断开的线表示EmIP(2360个残基)，底部未断开的线表示EtMIC4(2189个残基)。相似性是通过中间的垂直线表示。较小的垂直线(在EmIP下和在EtMIC4上)表示在对比中插入的缺口。
图37贯穿巨型艾美球虫的发育阶段免疫显性蛋白质的检测。使用对EmIP和HSP70特异性的引物将裂殖子或配子母细胞的信使RNA进行RT-PCR。随后将RT反应产物用作模板，使用对EmIP或HSP70的基因特异性引物进行标准PCR反应。泳道1，100bp DNA序列梯(1μg)；泳道2，使用EmIP引物扩增的形成孢子的卵囊cDNA(阳性对照，2μL)；泳道3，用EmIP引物扩增的裂殖子RT反应产物(10μL)，泳道5，用HSP70引物扩增的裂殖子RT反应产物(阳性对照，10μL)；泳道6，用HSP70引物扩增的配子母细胞RT反应产物(阳性对照，10μL)；泳道7，用EmIP引物扩增的裂殖子无RT反应产物(阴性对照，10μL)；泳道8，用EmIP引物扩增的配子母细胞无RT反应产物(阴性对照，10μL)；泳道9，用EmIP引物扩增的无模板反应产物(阴性对照，10μL)。
图38限制酶消化巨型艾美球虫基因组DNA的DNA印迹分析。用各种限制性内切酶消化大约2.5μg DNA样品并如所示在0.9％的琼脂糖上分离。泳道1，BglII；泳道2，EcoRI；泳道3，HindIII；泳道4，NcoI；泳道5，NdeI；泳道6，NsiI。使用EmIP基因特异性引物FP015和RP033产生的32P标记的1590bp cDNA片段进行杂交。
图39编码巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的基因的内含子-外显子结构的PCR分析。使用基因特异性引物对从cDNA和基因组DNA扩增相应的基因片段。在0.8％琼脂糖凝胶上分离来自每个反应的10μL样品。泳道1，1μgλDNA/EcoRI+HindIII标记；泳道2和3，分别用引物对FPA015/RP033扩增的cDNA和基因组DNA；泳道4和5，分别用引物对FP021/RP030扩增的cDNA和基因组DNA；泳道6和7，分别用引物对FP010/RP023扩增的cDNA和基因组DNA；泳道10，1μg 100bp DNA序列梯。
图40通过引物FP010和RP023产生的部分基因组DNA序列。在扩增的基因片段内检测到的2个内含子以下划线表示。
图41显示为了设计简并引物CP003和CP004所选区域(黑体字)的EmIP和EtMIC4氨基酸序列的ClustalW(4.1)对比。相同的残基用“*”标记，相似的残基用“.”标记。
图42通过PCR和DNA印迹分析在艾美球虫属的澳大利亚品系中EmIP同源的检测。使用简并引物CP003和CP004，如上所述从基因组DNA样品产生PCR产物。在0.8％琼脂糖凝胶上分离反应样品(10μL)；泳道2，堆型艾美球虫，泳道3，布氏艾美球虫；泳道4，巨型艾美球虫；泳道5，缓艾美球虫；泳道6，扁嘴艾美球虫；泳道7，早熟艾美球虫；泳道8，柔嫩艾美球虫。(泳道1，1μg100bp序列梯)。通过DNA杂交检测产物，其使用Houghton品系的巨型艾美球虫基因组DNA探针，该探针是使用引物CP003和CP004产生的。将膜曝露于X光片10(A)和30(B)分钟的时间。
图43A&B重组形式的56kDa和82kDa配子母细胞抗原的鸡免疫原性试验的ELISA结果。所有的血清样品在1∶1000的稀释度下检验。A)包被抗原：检验抗APGA血清的APGA；纯化以检验取自用PBS，FIA和两剂量r56免疫的鸡的血清的r56。B)包被抗原：检验抗APGA血清的APGA；r82纯化的蛋白质，以检验取自用PBS，FIA和两剂量r82免疫的鸡的血清。
图44来自250kDa无性繁殖阶段的蛋白质的表达蛋白质片段的DNA和编码的氨基酸序列。
图45 250kDa无性繁殖阶段蛋白质的重组片段的小鼠免疫原性试验。显示对于3次连续放血每组的平均值，显示标准误差条线。所有的血清样品在1∶1000的稀释度下检验。包被抗原是来自阳性对照APGA组的血清的100ng APGA，或阴性对照PBS和PBS/FIA组的100ng重组蛋白质和2个重组蛋白质剂量(r0.5μg和r5μg)。
图46 250kDa无性繁殖阶段蛋白质的重组片段的鸡免疫原性试验。显示对于3次连续放血的每组的平均值，显示标准误差条线。所有的血清样品在1∶1000的稀释度下检验。包被抗原是来自阳性对照APGA组的血清的100ng APGA，或阴性对照PBS和PBS/FIA组的100ng重组蛋白质和2个重组蛋白质剂量(1μg和r10μg)。
发明详述
本发明提供分离的核酸或核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
先前认为，来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的抗原是230kDa的抗原。然而，我们随后的研究已经显示该抗原实际上是巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa抗原。
在一个实施方案中，多肽具有图7b所示的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有大于59％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少70％的同一性。
在一个附加的实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少75％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少93％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
在一个附加实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID.NO.6所示序列的多肽具有至少99％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如图7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)具有大于60％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在还有另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核酸是DNA分子。
在还有另一个实施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在一个附加的实施方案中，核酸具有如图7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)。
在另一个实施方案中，核酸是RNA分子。
在一个实施方案中，将分离的核酸有效地连接到RNA转录的启动子上。
本发明还包括一种包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的载体，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体包含具有图7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一个实施方案中，载体是质粒。
在另一个实施方案中，质粒包含具有图7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在一个附加的实施方案中，质粒包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在还有另一个实施方案中，质粒是命名为230.1质粒的质粒(澳大利亚政府分析实验室保藏号NM01/22396)。
本发明还包含宿主细胞，其包含载体，所述载体包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含具有图7a所示的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.4)的核酸。
在另一个实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞；植物细胞；昆虫细胞；和哺乳动物细胞。
本发明另外提供包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，转化细胞是在细菌中命名为230.1的转化细胞(澳大利亚政府分析实验室保藏号NM01/22397)。
在2001年6月26日将编码250kDa抗原的本质粒保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22396。在2001年6月26日将用250kDa抗原转化的细菌细胞保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22397。两个保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物存放的国际认可的布达佩斯条约进行。
在一个附加的实施方案中，转化细胞另外包含来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或所述多肽的同源物。
本发明另外包含一种生产重组的来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽的方法，其包含培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞和分离重组的来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。本发明也包含通过该方法生产的重组多肽。
本发明还提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一个实施方案中，分离的核酸是质粒。
另外，本发明提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含重组的来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，该重组多肽是通过培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞和分离重组的来源于巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽来生产的，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸和本发明的重组多肽的混合物组成。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸，本发明的重组多肽和包含本发明的分离的核酸的质粒的混合物组成。
在一个附加的实施方案中，疫苗另外包含第二种抗原。
在一个实施方案中，第二种抗原选自编码来自巨型艾美球虫的抗原的核酸，包含该核酸的质粒，和由该核酸编码的多肽。
在一个实施方案中，第二种抗原是从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的56kDa蛋白质。
在一个实施方案中，第二种抗原是从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的82kDa蛋白质。
在一个实施方案中，第二种抗原是从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的230kDa蛋白质。
在另一个实施方案中，疫苗另外包含从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的56kDa蛋白质和82kDa蛋白质。
在另一个实施方案中，疫苗另外包含从巨型艾美球虫的配子母细胞中分离的56kDa蛋白质，82kDa蛋白质和230kDa蛋白质。
在美国专利号5,932,225和5,496,550中描述了巨型艾美球虫的配子母细胞蛋白质的提取和表征，这些专利的内容因此通过参考结合到本申请中。简要地，每只鸡感染10,000卵囊，然后在感染几天后将其处死。切除肠并通过在以上参考专利的实施例1中描述的两种方法之中的一种提取配子母细胞。然后使用各种去污剂从配子母细胞中提取蛋白质，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验提取的蛋白质。蛋白质具有10-300kDa的分子量，5种主要的代谢标记的蛋白质分子量为约82kDa，73kDa，56kDa，和35kDa。然后通过无细胞翻译产物的ELISA，免疫荧光，蛋白印迹和免疫沉淀来分析蛋白质。蛋白印迹在鸡血清中在82，56和43kDa处检测到3条主要条带，并在250，116，78，52和36kDa处检测到次要的条带。克隆部分250kDa蛋白质并同样测序。Fried等随后克隆和测序了整个250kDa配子母细胞蛋白质。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用本发明的疫苗的步骤。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在一个附加的实施方案中，鸟类物种是鸡。
在一个实施方案中，施用步骤包含将疫苗喷雾到受试者的鼻孔中。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
在另一个实施方案中，施用是在卵内(in ovo)进行。
在另一个实施方案中，施用是针对卵的气囊，因此使胚胎与疫苗接触。
本发明还提供给予鸟类物种的新生受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的母体免疫(抗体)的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便由此在新生的受试者中通过母体免疫给予保护以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的步骤。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供一种减少在鸟类物种新生受试者的粪便中艾美球虫属卵囊排出量的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便诱导免疫应答和将母体抗体传递给新生儿以使来自新生儿的卵囊排出量减小的步骤。
在另外的实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用活疫苗的步骤，所述活疫苗包含表达来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽的活的非毒性微生物或活病毒。
在一个实施方案中，活病毒是痘病毒。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者给料植物的步骤，所述植物的细胞表达来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽。
在一个实施方案中，植物是小麦。
在另一个实施方案中，植物是玉米。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用包含分离的核酸或核酸的互补序列的质粒的步骤，所述分离的核酸包含编码来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽，或编码所述多肽的同源物的核苷酸。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还包含来自鸟类物种的受精卵，其具有用本发明的疫苗接种的气囊，所述疫苗能够在孵化前或孵化后立即在胚胎中诱导抗有毒力形式的柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的免疫应答。
在一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
本发明还提供分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有大于59％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少70％的同一性。
在一个附加的实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少75％的同一性。
在还有另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少90％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少93％的同一性。
在另一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少95％的同一性。
在一个附加的实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，多肽的同源物与具有如SEQ.ID NO.26所示序列的多肽具有至少99％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有大于60％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在还有另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少93％的同一性。
在一个附加的实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
在另一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性。
在一个实施方案中，核苷酸序列与如SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性。
在另一个实施方案中，核酸是DNA分子。
在还有另一个实施方案中，DNA分子是cDNA分子。
在一个附加的实施方案中，核酸具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，核酸是RNA分子。
在一个实施方案中，将分离的核酸有效地连接到RNA转录启动子上。
本发明还包括一种包含分离的核酸或核酸的互补序列的载体，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在另一个实施方案中，载体是质粒。
在另一个实施方案中，质粒包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在一个附加的实施方案中，质粒包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
本发明还包含宿主细胞，其包含载体，所述载体包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含具有如SEQ.ID.NO.25所示的核苷酸序列的核酸。
在另一个实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞；植物细胞；昆虫细胞；和哺乳动物细胞。
本发明又提供了转化细胞，其包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码具有SEQ.ID.NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在一个附加的实施方案中，转化细胞另外包含具有如SEQ.ID NO.26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物。
本发明另外提供生产重组的来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的多肽的方法，其包含培养包含分离的核酸的转化细胞和分离重组的来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。本发明也包含通过该方法生产的重组多肽。
本发明还提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述核酸包含编码具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在疫苗的一个实施方案中，分离的核酸是质粒。
另外，本发明提供一种针对柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗，其包含重组的来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的多肽，该多肽是通过培养包含分离的核酸或所述核酸的互补序列的转化细胞和分离重组的来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的多肽来生产的，所述分离的核酸包含编码具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分，或编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，疫苗由本发明的分离的核酸和本发明的重组多肽的混合物组成。
在一个附加的实施方案中，疫苗另外包含第二种抗原。
在一个实施方案中，第二种抗原选自编码来自巨型艾美球虫的抗原的核酸，包含该核酸的质粒，和由该核酸编码的多肽。
本发明还提供免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用本发明的疫苗的步骤。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
在一个实施方案中，施用步骤包含将疫苗喷雾到受试者的鼻孔中。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
在另一个实施方案中，施用是在卵内进行。
在另一个实施方案中，施用是针对卵的气囊，因此使胚胎与疫苗接触。
本发明还提供一种给予鸟类物种的新生受试者以母体免疫(抗体)以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便由此在新生的受试者中通过母体免疫给予保护以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的步骤。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供一种减少鸟类物种的新生受试者的粪便中艾美球虫属卵囊排出量的方法，其包含在产受精卵之前适当的时间向受试者的母体施用本发明的疫苗，以便诱导免疫应答和将母体抗体传递给新生儿以使来自新生儿的卵囊排出量减小的步骤。
在另外的实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供一种免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用活疫苗的步骤，所述活疫苗包含表达具有如SEQ.ID NO 26所示的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫子孢子/裂殖子250kDa多肽的免疫显性部分的活的非毒性微生物或活病毒。
在一个实施方案中，活病毒是痘病毒。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还提供一种免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者给料植物的步骤，所述植物的细胞表达来自巨型艾美球虫的子孢子/裂殖子的250kDa多肽的免疫显性部分。
在一个实施方案中，植物是小麦。
在另一个实施方案中，植物是玉米。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
本发明还提供一种免疫受试者以抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物感染的方法，其包含向受试者施用包含具有如SEQ.ID.NO.25所示核苷酸序列的核酸的质粒的步骤。
在一个实施方案中，受试者是选自牛，羊，猪和鱼的物种。
在另一个实施方案中，受试者是鸟类物种。
在另一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，火鸡，鹅，鸭，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，施用包含静脉内，肌内或腹膜内注射。
本发明还包含来自鸟类物种的受精卵，其具有用本发明的疫苗接种的气囊，所述疫苗能够在孵化前或孵化后即刻在胚胎中诱导抗有毒力形式的柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的免疫应答。
在一个实施方案中，鸟类物种选自鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡，鹌鹑和鸽子。
在另一个实施方案中，鸟类物种是鸡。
本发明提供来自巨型艾美球虫的250kDa子孢子/裂殖子抗原的重组克隆和测序。
从纯化的巨型艾美球虫子孢子中分离250kDa抗原，其存在于形成孢子的卵囊中(参见上述生活周期)。分离方法涉及从形成孢子的卵囊中提取蛋白质和在DEAE-sephacel阴离子交换柱上分离提取的蛋白质。接着进行峰级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹以鉴定250kDa的抗原。此外，使用来源于接种的母鸡和子代小鸡的保护性母体抗血清以证实纯化的抗原的同一性。最后，从PVDF薄膜滤器上分离250kDa蛋白质以进行蛋白质测序和克隆。
将250kDa抗原的氨基末端和胰蛋白酶肽消化产物进行测序。使用来自胰蛋白酶消化的序列来设计简并PCR寡核苷酸引物。将引物用于RACE(cDNA末端快速扩增)PCR以扩增部分基因的产物。从这些产物的序列，设计基因特异性引物并将其用于RACE PCR以确定mRNA的3’和5’末端。然后使用针对5’和3’末端设计的基因特异性引物通过PCR扩增编码抗原的全长7kb cDNA克隆。该克隆被完全测序，并且当与天然蛋白质N-末端的氨基酸序列相比时显示其5’末端包含正确的DNA序列。因此，该核酸序列编码保护性的250kDa子孢子/裂殖子抗原并且现在可以用来生产用于接种鸡以抗球虫病的重组抗原。
本发明核酸的同源物是编码与核酸编码的多肽具有基本上相同生物活性的多肽的核酸。在此使用的术语“同源物”指互补性的程度。可能存在部分同源或完全同源(即，同一性)。部分互补序列是至少部分抑制相同的序列与目标核酸杂交的序列；使用功能术语(functional term)“基本上同源”来表示。使用在低严格条件下的杂交试验(DNA印迹或RNA印迹，溶液杂交等)可以检验完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制。在低严格条件下，基本上同源的序列或探针将竞争和抑制完全同源的序列或探针与靶序列的结合(即杂交)。这不是说低严格条件是这样的以致允许非特异性的结合；低严格条件要求两个序列的彼此结合是特异性(即选择性的)的相互作用。通过使用甚至缺少部分程度的互补性(例如小于30％同一性)的第二种靶序列可以检验非特异性结合的缺乏；在不存在非特异性结合时，探针将不与第二种非互补的靶序列杂交。
如在本领域已知，可以使用众多等价条件以包含低或高严格条件。考虑因素如序列的长度和性质(DNA，RNA，碱基组成)，目标的性质(DNA，RNA，碱基组成，存在溶液中或固定等)，和盐的浓度以及其它组分(例如，甲酰胺，葡聚糖硫酸酯和/或聚乙二醇的存在或缺乏)，并且可以改变杂交液以产生与上面列出的条件不同但相当的低或高严格条件。
本发明的目的是提供编码来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa抗原的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。具体例举的编码序列在图6中与推断的氨基酸序列一起给出。关于例举的氨基酸序列的所有同义编码序列都在本发明的范围内。
本发明另一个目的是提供功能上等价的编码和蛋白质序列，包括来源于艾美球虫属其它物种的等价序列。来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的功能上等价的250kDa抗原的编码序列，与具体鉴定的编码序列理想地是大约50％至大约80％的核苷酸序列同源性(同一性)，并且编码序列与具体例举的编码序列理想地是大约95％至大约100％相同。
特别严格的杂交条件提供给来自其它物种的编码序列同源物的鉴定和变体序列的鉴定，其中那些同源物和/或变体序列具有至少(包括在内)50-85％，85-100％的核苷酸序列同一性，90-100％，或95-100％的核苷酸序列同一性。每个整数和每个指定范围的每个子集规定为在本发明的范围内。
本发明的编码序列和方法包括在除了巨型艾美球虫以外的物种中的同源编码序列。使用本文公开的序列和本领域众所周知的实验技术，可以使用方法从其它生物分离相应的编码序列(例如，从cDNA)，所述生物包括但不限于其它物种例如在本发明方法中有用的柔嫩艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫和布氏艾美球虫。
特别包括在本发明中的是来源于除了在此例举的那些的其它物种的序列，其序列与公开的序列在严格条件下杂交。严格条件指在本领域对于给定的探针长度和核苷酸组成所理解的条件，能够在严格条件下杂交意指在标准条件下(即高温和/或低盐含量)与被试核苷酸序列，或它的互补链退火，标准条件往往不利于无关序列的退火。
“高严格条件”意指65-68℃，0.1xSSC和0.1％SDS(显示大约95-100％的核苷酸序列同一性/相似性)的杂交和漂洗条件。在Sambrook等(1989)Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.中进一步描述杂交试验和条件。如这里使用，适中(中等的)严格的条件是50-65℃，1xSSC和0.1％SDS的杂交和漂洗条件(其中阳性杂交结果反映大约80-95％核苷酸序列的同一性)。低严格条件典型地是40-50℃，6xSSC和0.1％SDS的杂交和漂洗条件(反映大约50-80％核苷酸序列同一性)。
本发明多肽的同源物是具有与多肽基本上相同的氨基酸序列和生物活性的多肽。因此，同源物可以通过添加，缺失，或替换一个或多个非必需氨基酸残基而不同于本发明的多肽，条件是产生的多肽保留多肽的生物活性。使用确定的和众所周知的方法，本领域的技术人员可以容易地确定可以添加，缺失，或替换(包括该替换可以用哪个氨基酸进行)哪个氨基酸残基，所述方法包括例如设计和制备DNA序列，所述DNA序列编码本多肽的多肽同源物的细菌表达，通过定点诱变技术修饰cDNA和基因组序列，构建重组多肽和表达载体，细菌表达多肽，和通过常规生物化学测定测量多肽的生物化学活性的常规方法。
同源物的实例是包含少于在本多肽中规定的所有残基的缺失同源物，其中用其它残基替代一个或多个规定残基的替换同源物，和其中将一个和多个氨基酸残基加入到多肽的添加同源物。所有的这些同源物共有本发明多肽的生物活性。
在此将“基本上相同的多肽”限定为包含在多肽的氨基酸序列的N-末端缺失，添加或替换少于4个氨基酸。另外，在序列中可以存在不消除多肽的生物活性的缺失，添加或替换。这类修饰对于本领域的技术人员是已知的。例如，根据由例如Lehninger，生物化学，第2版，Worth出版社，纽约(1975)；Creighton，Protein Structure，A Practical Approach，牛津大学的IRL出版社，牛津，英国(1989)；和Dayhoff，Atlas of Protein Sequenceand Structure 1972，Naional Biomedical Research Foundation，Maryland(1972)描述的同源或等价基团，替换可以包含高达10个残基。
在此使用的术语“生物活性的”指具有天然存在分子的结构，调节，或生物化学功能的多肽。同样，“免疫活性的”指天然，重组，或合成的多肽，或其任何寡肽部分，以在动物或细胞中诱导特异性免疫应答和与特异性抗体结合的能力。
“基本上相同的生物活性”指与天然存在的分子相同的生物活性，在程度或水平上可能稍微不同，其仍可以被熟练的技术人员认为是相同的生物活性。
在此使用的术语“部分”，与多肽结合(如在“给定多肽的一部分”)指该多肽的片段。片段可以在四(4)个氨基酸残基到减去一个氨基酸的整个氨基酸序列的范围内变化。
在此使用的术语“部分”，与核酸结合(如在“给定核酸的一部分”)指该核酸的片段。片段可以在十二(12)个核苷酸残基到减去一个核苷酸的整个核酸序列的范围内变化。
在此使用的“缺失”指氨基酸或核苷酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸或核苷酸残基。
在此使用的“插入”或“添加”指氨基酸或核苷酸序列的改变，与天然存在的分子相比，其分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基的增加。
在此使用的“替换”指分别用不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。
本发明提供来源于巨型艾美球虫的形成孢子的卵囊、免疫显性和高度保护性的250kDa抗原的重组克隆和测序。
据显示抗原与来源于保护的母鸡和小鸡的血清反应，基因的序列是基于由保护性血清识别的蛋白质的氨基酸序列。基因在发育的子孢子和裂殖子阶段强烈表达，并且已被预测在宿主细胞的侵入中起作用。因此，该抗原可以用于抗球虫病的疫苗。
本发明还提供抗球虫病的疫苗，其包含重组250kDa抗原。
本发明还提供分离的核酸，其具有SEQ.ID NO.25所示的核苷酸序列。
本发明还提供重组多肽，其中氨基酸序列通过SEQ.ID NO.26显示。
通过下列实施例进一步举例说明本发明，所述实施例决不应该被认为是进一步限制。本领域的技术人员将容易地理解，讨论的具体方法和结果只是本发明的举例说明，在其后接着的权利要求中更充分地描述本发明。
实验细节
实施例1
从形成孢子的卵囊纯化250kDa子孢子抗原
如先前所述(Wagenbach)制备巨型艾美球虫形成孢子的卵囊。充分洗涤100×106个形成孢子的卵囊，然后重悬浮于等体积的40mM Tris.HClpH8.0中，覆盖玻璃珠并通过涡旋5分钟破裂。然后使用液氮/40℃水浴将匀浆进行3个循环的冷冻-熔化，接着在13,000xg下离心10分钟。去除上清液，转移至微量浓缩器(Centricon 100，Amicon)并通过在9900xg下4℃离心30分钟浓缩。用Bradford方法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析5μg粗提物样品，其结果在图1中显示。可以看出，来源于用巨型艾美球虫或裂殖子粗提物活体感染的母鸡或它们子代小鸡的血清，与存在于形成孢子的卵囊中的250kDa蛋白质条带反应。另外，从泳道3可以看出，来源于用裂殖子250kDa剪切块蛋白质条带(先前在我们的母体免疫试验中使用(Smith等))免疫的母鸡的卵的卵黄，也与250kDa蛋白质反应。
使用DEAE-sephacel(Pharmacia，Sweden)阴离子交换树脂填充1cm×20cm柱并在40mM Tris.HCl pH8.0中以0.7ml/min的流速平衡。将1.5mg形成孢子的卵囊蛋白质粗提物加样到柱上，并随后用在40mM Tris pH8.0中的0-1 M NaCl的分级梯度洗脱蛋白质。使用设置在280nm的UV检测器和图表记录器监测洗脱物，结果在图2中显示。按照发现的峰收集并合并级分，如上所述浓缩和离心。
通过SDS PAGE和蛋白质印迹分析在用于洗脱的各种NaCl浓度下获得的合并级分(图3)。可以看出，通过凝胶的银染色或通过与针对裂殖子粗提物产生的鸡抗血清的反应性，250kDa抗原条带在0.3-0.5M NaCl级分中出现。来源于通过活体感染免疫的母鸡的被保护的3日龄子代小鸡的抗血清也识别这个相同的条带。
实施例2
来自250kDa抗原的N-末端以及内部胰蛋白酶肽的氨基酸测序
合并用0.3-0.5M NaCl洗脱的离子交换纯化的级分，并通过SDS-PAGE分离蛋白质(图4)。在电泳后，将蛋白质转移PVDF膜上，其然后用考马斯亮蓝染色。切除相当于免疫显性250kDa蛋白质的条带并将N-末端测序。为了测序内部肽，将250kDa蛋白质条带进行胰蛋白酶消化并随后通过质谱序列分析产生的肽。
序列分析的结果如下：
N-末端：EVNNELSK(C)ESGWTPW(SEQ.ID.NO.8)
胰蛋白酶肽1 QWTAWTE(SEQ.ID.NO.9)
胰蛋白酶肽2 EL/IVNWF(SEQ.ID.NO.10)
实施例3
编码250kDa抗原的基因的RACE PCR克隆和测序
按照制造厂商的方案使用TRIzol试剂从形成孢子的卵囊中提取总RNA。按照制造厂商的说明书使用Dynal mRNA试剂盒从总RNA中分离mRNA。然后使用Marathon RACE试剂盒(Clonetech)将mRNA用于cDNA的构建。从N末端和胰蛋白酶肽序列设计简并PCR引物并用于5’和3’RACE PCR实验。克隆和测序产生的条带并将获得的序列用于设计新的基因特异性引物。然后与简并引物一起使用基因特异性引物以精确地确定cDNA的5’和3’末端。然后设计基因特异性引物以扩增全长7kb cDNA。结果在图5中显示，其中可以显现7KB cDNA条带。
从250kDa cDNA克隆获得的DNA序列数据在图6中表示。可以看出，序列包含从碱基对数231(ATG)起始和在碱基对7310处的终止密码子终止的氨基末端。序列的总长为7987个碱基。该序列编码2359个氨基酸的蛋白质，预测的分子量为249kDa。
在2001年6月26日将编码250kDa抗原的本质粒保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22396。在2001年6月26日将用250kDa抗原转化的细菌细胞保藏在澳大利亚政府分析实验室，Pymble，澳大利亚，保藏号为NM01/22397。两个保藏都是按照用于专利程序目的的关于微生物存放的国际认可的布达佩斯条约进行。
从图7中可以看出，发现巨型艾美球虫250kDa基因的序列与来源于柔嫩艾美球虫的命名为GX5401和GX5401 FL的基因序列(WO 90/00403)共享同源性。将恢复期的鸡血清用于筛选文库，从柔嫩艾美球虫形成孢子的卵囊中制备的cDNA文库中选择柔嫩艾美球虫克隆GX5401。使用GX5401 cDNA克隆作为探针，从基因组文库克隆柔嫩艾美球虫的全长基因GX5401FL。该基因具有6,567个碱基的可读框并且编码具有预测的大约250kDa的分子量的蛋白质。在将巨型艾美球虫250kDa克隆的全长序列与柔嫩艾美球虫的序列比较中(图7a和7b)，发现总体上对于DNA和氨基酸序列分别有60％和59％的同源性。这个水平的同源性是相对低的，因此该新克隆的巨型艾美球虫基因显著区别于柔嫩艾美球虫克隆。因为本巨型艾美球虫克隆也被保护性母体抗体强烈识别，因此为生产抗鸡的球虫病的新重组疫苗提供基础。
实施例4
来源于巨型艾美球虫的免疫显性无性繁殖阶段的蛋白质的纯化和蛋白质印迹分析
材料
为方便起见，将以下列出的化学试剂，生物试剂和混杂材料以供应商的名字分组。
化学试剂
除非另外说明，贯穿本研究使用的所有化学品是分析级。
Amresco(美国)；氯仿，柠檬酸(水合三钠)，乙酸，柠檬酸EDTA，NaHCO3，苯酚，SDS，Tris硼酸盐EDTA缓冲液(10x原液：0.89M Tris，0.89M硼酸盐，0.02M EDTA)
British Drug Houses Chemicals(英国)；乙酸，乙醇，甘氨酸，HCl，异丙醇，KCl KH2PO4，甲醇，MgCl2，MgSO4，NaCl，Na2HPO4，NaOH
Progen Industries Ltd.(澳大利亚)；X-gal
Sigma Chemical Company(美国)；2-巯基乙醇，BCIP/NBT缓冲底物片，EtBr，甘油，IPTG，HBS，异戊醇，PMSF，Tris
生物试剂
Biotech International Ltd.(澳大利亚)；2mM dNTP溶液
Clontech(美国)；Advantage2Taq聚合酶和10x反应缓冲液
DIFCO Laboratories(美国)；细菌学琼脂，胰蛋白酶，胰蛋白胨，酵母提取物
Fluka Chemical Corp(美国)；牛磺胆酸
ICN(美国)；青霉素10,000I.U./mL和链霉素10,000μg/mL抗生素混合物
New England Biolabs(美国)；限制性内切核酸酶和10x反应缓冲液
PerkinElmer Life Sciences，Inc.(美国)；32P-dCTP
Pierce Chemical Company(美国)；BSA
Progen Industries Ltd.(澳大利亚)；DNA级琼脂糖，氨苄青霉素，蛋白酶K
Promega(美国)；T4 DNA连接酶和2x连接缓冲液
Roche；DNA酶(不含RNA酶)，RNA酶抑制剂
混杂材料
BioRad；Econo-柱(低压色谱柱)
Amersham Pharmacia Biotech(瑞典)；DEAE sephacel，Hybond-N+核酸转移膜，Percoll
Pall corporation(美国)；PVDF蛋白质转移膜
Sigma Chemical Company(U.S.A)；玻璃珠
溶液和生长培养基
变性溶液；0.5M NaCl，0.5M NaOH
杂交液；0.263M Na2HPO4 pH7.2，1％BSA，1mM EDTA，7％SDS
LB培养基；1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物
LB琼脂；含有0.24％MgSO4，1.5％琼脂的LB培养基，中和液；0.5M Tris-Cl pH7.4，2.5M NaCl
PBS 1x；137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mMKH2PO4，pH7.4
SDS电泳缓冲液；0.151％Tris，7.2％甘氨酸，0.5％SDS
SOB培养基；0.05％NaCl，2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物
SOC培养基；含有20mM葡萄糖，10mM MgCl2，10mM MgSO4的SOB
SSC 20x；3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0
TBE电泳缓冲液；0.89M Tris，0.89M硼酸盐，0.02M EDTA
TE缓冲液；10mM Tris-Cl pH8.0，1mM EDTA
转移溶液；1M NaCl，含有1M柠檬酸的0.1M柠檬酸钠，pH7.0商品试剂盒
DynabeadsmRNA DIRECT试剂盒(DYNAL，挪威)
GenEluteTM质粒小量制备试剂盒(Sigma，美国)
MarathonTM cDNA扩增试剂盒(CLONTECH，美国)
OmniscriptTM RT Kit(QIAGEN，美国)
pGEM-T Easy Vector System(Promega，美国)
蛋白酶抑制剂混合物P8465(Sigma，美国)
QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，美国)
QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，美国)
随机引物DNA标记试剂盒(Roche)
银染色试剂盒，PlusOne(Amersham Pharmacia Biotech，瑞典)
寄生虫
在整个本研究中使用巨型艾美球虫的Houghton品系。形成孢子的卵囊最初由国家兽医研究所提供，乌普萨拉，瑞典。将巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的澳大利亚品系用于比较实验，形成孢子的卵囊是由MedichickPty.Ltd.，提供，维多利亚，澳大利亚。
宿主品系
贯穿本研究使用家养鸡的澳大利亚品系。鸟是由Barter和Sons Pty.Ltd.，N.S.W.，澳大利亚作为日龄的小公鸡提供。
方法
寄生虫制备
形成孢子的卵囊
按照修改的由Shirley(1995)描述的方法，在宿主品系中每3-4个月将巨型艾美球虫常规传代。在3-4周龄，通过使用5×103个形成孢子的卵囊口服接种感染鸟，并从第6天至第9天pi每天收集粪便。在收集当天，将粪便转移至4L桶中并以4份水对1份粪便的比率加入自来水。在工业强度的掺合机中搅匀淤浆，并将产生的均浆滤过1mm-规格的不锈钢实验室用筛。在2000xg下将滤液离心10分钟并丢弃上清液。通过剧烈振荡将包含卵囊的沉淀重悬浮在饱和NaCl溶液中并在750xg下离心10分钟。然后将包含漂浮的卵囊的上清液连续滤过17μm和10μm的polymon筛孔，用无菌移液管从筛孔的表面收集卵囊。为了最大化产率，将仍包含卵囊的沉淀重悬浮在新鲜的饱和NaCl溶液中并重复方法达5次。通过反复在水中稀释和在1500xg下离心5分钟将如此收集的卵囊立即洗去NaCl。然后将卵囊重悬浮在2％重铬酸钾中并通过在振荡水浴中于28℃下温育72小时形成孢子。在孢子形成后，将培养物保存在4℃。
在分离程序的过程中，polymon筛孔的使用利于巨型艾美球虫卵囊相对大的尺寸(18μm×30μm)。卵囊不能通过10μm网孔并被立即回收，并且是小体积的，在下游步骤中容易操作。
卵囊的次氯酸钠处理
在制备感染剂量过程中和在粗制抗原的制备之前用次氯酸钠清洗保存在4℃重铬酸钾中的卵囊。通过反复水洗和在1500xg下离心5分钟从卵囊培养物中去除重铬酸钾。将沉淀的卵囊重悬浮在水中，加入等体积的12.5％w/v次氯酸钠(终浓度6.25％w/v)并且将悬浮液放置冰上10分钟。在750xg离心10分钟后，将包含清洁的卵囊的上清液滤过10μm的polymon网孔，用无菌移液管从网孔的表面收集卵囊。通过反复用水洗涤和在1500xg下离心5分钟立即去除次氯酸钠。如果用于感染，将卵囊重悬浮在水中，或者重悬浮在适当的缓冲液中以制备粗制抗原。
裂殖子
在3-4周龄通过使用2×105个形成孢子的卵囊口服接种感染小鸡，并在感染后93小时处死。切除肠，立即在冰预冷的PBS pH7.4中漂洗，然后切成长度约为3cm的块。将块加入包含0.025％胰蛋白酶，1％牛磺胆酸(Fluka)，10mM MgCl2，200单位/mL青霉素和200μg/mL链霉素的Hanks平衡盐溶液pH7.4(Sigma)的溶液中，并在40℃温育20-30分钟。在整个温育期间用显微镜监视裂殖子的释放。然后将溶液连续滤过1000μm和250μm不锈钢实验室用筛并最后通过17μm polymon网孔，用来去除较大的肠碎片。将产生的滤液在1000xg下离心10分钟，丢弃上清液并将包含裂殖子的沉淀重悬浮在等体积的包含10mM MgCl2的冰预冷的HBSS中。
为了去除较小碎片，基于Fernando等的方法(1984)将裂殖子在不连续的Percoll(Pharmacia)梯度上分层。通过加入各2ml等渗Percoll原液(9份Percoll对1份10×PBS)，接着70％原液(7份等渗原液对3份1×PBS)，然后50％原液(5份等渗原液对5份1×PBS)和最后裂殖子悬浮液来制备梯度。在10000xg下将梯度离心10分钟并从70％-50％边界吸取裂殖子。用1×PBS洗涤收集的裂殖子并通过在1000xg下离心10分钟沉淀。沉淀保存在-80℃。
SDS-PAGE
按照Laemmli(1970)的方法，使用Bio-Rad电泳单元在预制的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad或Gradipore)上分离蛋白质。用4x样品缓冲液(1x＝62mM Tris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝)稀释所有的蛋白质样品，对于在还原条件下分析的那些样品，(将β-巯基乙醇加至2.5％的终浓度(除非另外说明)。在100℃下将样品和分子量标记(Bio-Rad LMW)加热4分钟，立即放置冰上至冷却，然后在13,000xg下离心1分钟以去除不溶性物质。然后将样品和标记加样至浸没在1x电泳缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3)中的凝胶上并在125V下电泳约90分钟。
蛋白质印迹
使用Pharmacia NovaBlot电泳转移试剂盒和Multiphor II电泳单元进行从聚丙烯酰胺凝胶到PVDF膜的蛋白质的转移。系统应用半干的，不连续缓冲液技术，其使用浸泡在电极缓冲液中和堆积在石墨电极板之间的滤纸。
为转移作准备，用蒸馏水将阳极和阴极板饱和，用纸巾去除多余水份。通过将6层浸泡在阳极溶液1(0.3M Tris pH10.4，20％v/v甲醇)的滤纸放置在阳极上，然后是浸泡在阳极溶液2(25mM Tris pH10.4，20％v/v甲醇)中的3层滤纸和PVDF膜来装配每个转移单元。在PAGE后，将凝胶放置在组套上并用9层浸泡在阴极溶液(4mM 6-氨基正己酸pH7.6，20％v/v甲醇)中的滤纸覆盖。所有的滤纸和PVDF膜被预先切割成凝胶大小。通过加入阴极板和然后放入Multiphor碱中完成转移单元。在0.8mA/cm2凝胶表面积下进行转移。包括在凝胶上的有色分子量标记用作证实成功转移的对照。
蛋白质印迹的免疫检测
在蛋白质的电泳转移后，伴随搅拌在室温下在PBS/5％SMP溶液中将PVDF膜封闭1小时。在封闭后，将膜浸没于在PBS/5％SMP中稀释至适当浓度的第一抗体并在室温下振荡温育2小时。然后在PBS/0.03％吐温20中将膜洗涤3次，每次10分钟。然后以在PBS/5％SMP中1/1000的浓度加入第二抗体-偶联兔抗鸡IgG的碱性磷酸酶，并在振荡下室温温育1小时。在第二抗体温育后，如上洗涤膜并使用BCIP/NET(SIGMA FASTBCIP/NBT片剂)检测。
粗制抗原的制备
形成孢子的卵囊
通过反复在1500xg下离心5分钟和水洗从卵囊中去除重铬酸钾。将清洁的沉淀重悬浮在等体积的40mM Tris.HCl pH8.0中并按照制造厂商的说明书加入蛋白酶抑制剂(Sigma)。用饱和量的玻璃珠(Sigma)覆盖悬浮液并通过涡旋5分钟破裂。通过显微镜检查证实卵囊的破裂。然后使用液氮/40℃水浴将匀浆进行3个循环的冷冻-熔化，接着在13,000xg下4℃离心10分钟。去除上清液，转移至微量浓缩器(Centricon 100，Amicon)并通过在900xg下4℃离心30分钟浓缩。提取物保存在-80℃。
裂殖子和配子母细胞
将纯化的裂殖子或配子母细胞的沉淀重悬浮在包含10mM PMSF的40mM Tris.HCl pH8.0中，并进行如上所述的3个循环的冷冻熔化。使用设置在25W和70％输出量的Cole-Parmer超声匀浆器在冰上超声处理悬浮液20秒，并在13000xg下4℃离心产生的均浆10分钟。保留上清液并保存在-80℃。
蛋白质浓度测定
基于Bradford染料结合方法，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒来测定贯穿本研究中使用的所有抗原粗提取物和其它蛋白质样品的蛋白质浓度。
蛋白质显色
通过考马斯亮蓝或银染色来检测通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的蛋白质。对于考马斯亮蓝染色，在振荡下将凝胶浸没在0.2％考马斯亮蓝R250(Sigma)，50％甲醇和10％冰醋酸中30分钟。然后在振荡下在12％乙醇/7％冰醋酸中将凝胶脱色直至蛋白质条带变得可见并且背景几乎透明。按照制造厂商的说明书使用Amersham Pharmacia银染色试剂盒进行银染色。
通过考马斯亮蓝染色检测为了N-末端测序的目的转移至PVDF的蛋白质。如上所述将膜染色2分钟并脱色直至蛋白质条带可见。
蛋白质纯化程序
离子交换层析
通过DEAE离子交换层析分离来自形成孢子的卵囊粗提物的蛋白质。将约5ml DEAE sephacel(Amersham Pharmacia Biotech)阴离子交换树脂加至1cm(内径)×20cm(长)，低压层析柱(Econo-column，Bio-Rad)，并在40mM Tris.HCl pH8.0中以0.7ml/min的流速平衡2小时。通过在13000xg下4℃离心10分钟澄清如上所述制备的粗制抗原，并加样到柱上。随后使用在40mM Tris pH8.0中的0-1M NaCl的分级梯度以0.7ml/min的流速进行蛋白质洗脱。通过设置在280nm并且与Activon Omniscribe系列D5000图表记录器连接的Gilson 112 UV/Vis线内(in-line)检测器来监视洗脱物。与递增的NaCl浓度对应手动收集级分。在洗脱后，将所有的级分转移至Centricon 100微量浓缩器(Amicon)并且在900xg下4℃离心1小时，产生大约60μL的存留体积。为了将级分脱盐，用40mM Tris.HCl将存留物稀释至2ml的体积并如上所述离心。在离心/缓冲液交换后丢弃滤液并将存留物保存在-20℃。
大小排阻层析
在离子交换层析后，使用装备有Superdex 200 PC凝胶过滤柱(Pharmacia Biotech)的SMART HPLC系统，通过大小排阻层析进一步分离包含免疫显性蛋白质的所选级分。将柱在40mM Tris.HCl pH8.0中以50μL/min的流速平衡2小时。将蛋白质级分注于柱上并以如上所述的流速洗脱。使用SMART系统软件在280nm和214nm的双波长下监视洗脱物，在洗脱期的过程中自动收集100μL的级分。
N-末端测序
如上所述通过离子交换层析纯化形成孢子的卵囊的粗提物，合并富集免疫显性蛋白质的级分并通过离心超滤浓缩至60μL的体积。将19μL的样品等分试样加样至5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的3个相邻的孔中，并将3μL等分试样加样至第4个孔。在还原条件下电泳后，通过蛋白质印迹将分离的蛋白质转移至PVDF。然后从膜上剪下包含来自3μL样品等分试样的蛋白质的PVDF条，并用抗粗制裂殖子血清免疫检测以作为免疫显性蛋白质显示的对照。如上所述用考马斯亮蓝将剩余的膜块染色，用解剖刀片切除包含免疫显性蛋白质的膜条带。在测序前将膜块保存在-20℃。随后在澳大利亚蛋白质组分析机构(悉尼)和Biotech Australia Pty.Ltd.(悉尼)使用Applied Biosystems 494 Procise Protein Sequencing System进行蛋白质样品的自动Edman降解。
胰蛋白酶肽测序
如上所述在还原条件下在5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离浓缩的包含免疫显性蛋白质的离子交换层析级分。在电泳后用考马斯亮蓝将凝胶染色并用解剖刀片切割包含免疫显性蛋白质的凝胶区域。将凝胶条立即转移至澳大利亚蛋白质组分析机构并将样品在37℃下进行16小时的胰蛋白酶消化，接着使用ZipTip将产生的肽浓缩和脱盐。然后分离样品肽并使用Micromass Q-TOF质谱仪通过ESI-TOF MS/MS分析所选的肽。
Triton X-114分级分离
基于Bordier(1981)的方法，在非离子型去污剂Triton X-114中将纯化的裂殖子分级。将大约107个纯化的裂殖子重悬浮在250μL 0.5％ TX-114在PBS中的溶液，其包含10mM PMSF和0.002％溴酚蓝。在冰上温育30分钟后，在13000xg下将悬浮液离心10分钟，分离成去污剂不溶性沉淀和TX-114上清液。将上清液级分转移至在PBS中包含6％蔗糖和0.06％TX-114的蔗糖缓冲垫(sucrose cushion)之上，并在37℃下温育3分钟。然后在13000xg下室温离心3分钟，强迫分离成上层水相和下层富含去污剂相。去除水相并将去污剂相稀释在冰冷的PBS中至250μL的初始裂解液体积。将水相和去污剂相以及去污剂不溶性沉淀保持在冰上直至通过SDS-PAGE分离。
RNA提取
按照改编自Johnston等(1998)所描述的方法，使用TRIzol试剂(LifeTechnologies)从形成孢子的卵囊中分离总RNA。通过在1500xg下离心5分钟在10mL聚丙烯管中沉淀大约2.5×107个清洁的形成孢子的卵囊。向沉淀加入等体积的玻璃珠(Sigma)和1mL冰冷的PBS pH7.4，将混合物在4℃下涡旋4×1周期，任选地在冰上温育1分钟。将产生的均浆转移至无菌的10mL管中并加入等体积(3.75mL)的TRIzol试剂。通过反转混合溶液并在室温下温育5分钟以使核苷酸复合体完全解离。然后为了去除不溶性物质(即子孢子和卵囊壳)将悬浮液在11,000xg下4℃离心10分钟。去除上清液，转移至无菌的10mL管并加入0.75mL氯仿(2mL氯仿/1mL TRIzol试剂)。在剧烈振荡15秒后，将混合物在室温下温育3分钟，然后在10,000xg下4℃离心15分钟以强迫分离成下层酚-氯仿相和包含纯化的RNA的上层水相。将水相转移至无菌10mL管中，加入1.875mL异丙醇(0.5mL/1 mL TRIzol试剂)以沉淀RNA，然后通过反转混合溶液。在室温下温育10分钟后，通过在11,000xg下4℃离心10分钟沉淀RNA。去除上清液并通过简短涡旋在4mL 75％ EtOH中洗涤沉淀。通过进一步在7,000xg下4℃离心5分钟回收沉淀，在去除75％ EtOH后，在真空罩中简短地干燥10分钟。然后将部分干燥的沉淀重悬浮在200μLDEPC处理的ddH2O中，并保存在-80℃。
使用DynabeadsmRNA DIRECT试剂盒(DYNAL Pty.Ltd.)，在对制造厂商说明书较小改变的情况下，从形成孢子的卵囊的总RNA中，或直接从裂殖子和配子母细胞中纯化Poly(A)+RNA。简要地，在1.5mL无菌聚丙烯管中将来源于形成孢子的卵囊的总RNA，或者裂殖子或配子母细胞的沉淀与裂解/结合缓冲液(Dynal)混合，并与DynabeadsOligo(dT)25聚苯乙烯磁珠合并。通过温和反转4分钟混合悬浮液，然后将管放置在Dynal磁性粒子浓缩器(MPC)中2分钟。去除上清液并且在MPC中浓缩前通过反复吸取在洗涤缓冲液A(Dynal)中洗涤珠子1分钟。使用洗涤缓冲液A第二次重复洗涤程序，用洗涤缓冲液B(Dynal)重复两次。在最后洗涤后，通过加入10mM Tris-HCl pH8.0并在65℃下加热2分钟从珠中洗脱mRNA。然后将管转移至MPC 1分钟并将包含mRNA的上清液转移至无菌的1.5mL管，之后保存在-80℃。
核酸浓度和纯度的测定
使用Pharmacia GeneQuant分光光度计测定260nm的吸光度来测定贯穿本研究使用的纯化的DNA或RNA样品的浓度。通过测量A260/280比率评估样品的纯度，接受具有1.6-2.0比率的样品。
EtOH沉淀核酸
通过EtOH沉淀将DNA或RNA的稀释液常规浓缩。向每个样品中加入0.1体积的3M乙酸钠pH5.2和2.5体积的EtOH，通过反转混合溶液。在冰上温育30分钟后，将样品在13,000xg下4℃离心45分钟并随后去除和丢弃上清液。用70％ EtOH洗涤沉淀并通过进一步在13,000xg下4℃离心5分钟回收。在真空罩中干燥沉淀并重悬浮于适当体积的用于DNA样品的ddH2O(非基因组的)，或用于RNA样品的DEPC处理的ddH2O。
cDNA文库构建
如上所述从总RNA分离巨型艾美球虫的形成孢子的卵囊的信使RNA。将估计的1μg mRNA与MarathonTM cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)一起使用，以制备连接物连接的、准备好的RACE PCR双链cDNA。对制造厂商的说明书未进行程序修改。将文库保存在-20℃。
PCR
使用PTC-200 Peltier热循环仪DNA Engine(MJ Research)进行RCR反应。所有反应是50μL的体积，其使用1μL 50×Advantage 2 PolymeraseMix(CLONTECH)-推荐与MarathonTM cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)一起使用的高保真度的聚合酶混合物。寡核苷酸引物是由Sigma GenosysAustralia Pty.Ltd.合成，制备10μM的工作原液，并且对于基因特异性引物以0.2μM的浓度使用，或者对于简并引物使用0.4μM。对于使用cDNA作为模板的反应，每个反应使用相当于大约0.5ng的5μL cDNA，关于基因组DNA模板，5μL 10ng/μL的工作原液。第二轮或巢式PCR实验使用1μL第一轮PCR反应产物或凝胶纯化的PCR产物作为模板，而涉及从质粒DNA扩增的反应使用相当于大约5-10ng的1μL标准Miniprep(SIGMA)制剂。对于预测大小小于5kb的产物的扩增，每个反应加入5μL 2mMdNTP溶液(Biotech International Ltd.)，并且对于大于5kb的产物的扩增增至10μL。所有的反应包含5μL 10×Advantage 2PCR缓冲液(CLONTECH)和无菌ddH2O至50μL，为了最佳扩增，从MarathonTMcDNA扩增试剂盒用户手册(CLONTECH)中推荐的程序修改使用降落式(touchdown)和常规的PCR的循环参数。
PCR纯化
在直接测序或连接于测序或表达载体中之前，按照制造厂商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，美国)纯化PCR产物。将纯化的DNA常规地回收于30μL无菌ddH2O中并保存在-20℃。
凝胶提取
将PCR产物常规凝胶纯化以为第二轮或巢式PCR反应提供模板，或者在一些情形中在直接测序前。通过琼脂糖凝胶电泳分离产物并使用清洁的解剖刀片切割适当的DNA片段。按照制造厂商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)从凝胶切片中纯化DNA，并常规回收于30μL的无菌ddH2O中。将纯化的DNA保存在-20℃。
连接
为了测序的目的，将PCR产物克隆于pGEM-T Easy载体(Promega)中。如上所述纯化扩增的DNA并将8.5μL加入连接混合物，其包含0.5μLpGEM-TEasy载体，10μL 2x连接缓冲液，和1μL T4连接酶。通过吸取(pipetting)将溶液混合，并且在转化到感受态细胞之前在4℃下温育O/N。
将载体pTrcHis B(Invitrogen)用于表达研究并且在下面详细描述表达构建体的发展。将纯化的编码待表达多肽的插入片段DNA(7μL)加入连接混合物，其包含2μL消化的pTrcHis B载体，10μL 2x连接缓冲液和1μL T4连接酶(Promega)。如上所述还制备只含载体的对照连接，但用ddH2O替代插入片段DNA。通过吸取将连接反应物混合并在4℃下温育O/N。
感受态细胞制备
从DH5-α或TOP10大肠杆菌菌株的冷冻甘油原液中，将小部分划线在LB培养基平板上并在4℃下温育O/N。次日，选择单克隆，转移至100mL SOB培养基并在设置为200rpm的旋转振荡器中在37℃下温育。在培养物的OD600达到大约0.5时，通过在2,500xg下4℃离心10分钟收集细胞并重悬浮在10mL冰预冷的50mM CaCl2中。将细胞保持在冰上30分钟，在2,500xg下4℃离心5分钟，并温和地重悬浮于4mL冰预冷的50mM CaCl2中。在冰上温育1小时后，将感受态细胞分成90μL的等分试样并保存在-80℃。
转化
用20μL连接反应物中的10μL，或1μL(大约5-10ng)来自标准小量制备(Sigma)质粒制剂的质粒常规转化等分试样的感受态细胞(90μL)。在温和混合后，将溶液在冰上温育20分钟，在42℃的水浴中热激90秒并回到冰上1分钟。然后加入SOC培养基(900μL)并且通过反转将溶液混合，之后在设置为200rpm的旋转振荡器中37℃温育1小时。然后将适当量的混合物涂布在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下温育O/N。为了转化来源于pGEM-T Easy载体的重组质粒，用20μL的50mg/ml Xgal和100μL的100mM IPTG预先涂布在平板上以允许通过颜色筛选直接鉴定重组克隆。在O/N温育后，选择最少3个推定包含重组质粒的细菌克隆，培养O/N并用于如下所述的质粒制备。通过使用1μL质粒作为模板和载体或插入片段特异性引物的PCR扩增，确定DNA插入片段的存在和大小，并随后通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。
质粒制备
将细菌单克隆用于接种4mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，将培养物在旋转振荡器中37℃振荡(200rpm)温育O/N。次日按照制造厂商的说明书使用GenEluteTM质粒小量制备试剂盒(Sigma)从1.5mLO/N培养物中收获质粒。将纯化的质粒回收在100μL无菌ddH2O中并保存在-20℃。
DNA测序
使用双脱氧染料-终止剂化学和ABI自动测序仪，在悉尼大学PrinceAlfred大分子分析中心(SUPAMAC，悉尼)进行DNA测序。在含有20pmol适当的引物和ddH2O至16μL终体积的混合物中，每个反应提供大约每300bp 10ng纯化的PCR产物，或3μg质粒。
通过使用质粒模板和载体或基因特异性引物的PCR常规地产生用于测序的DNA。对于克隆到pGEM-T Easy载体中的PCR产物的扩增，以下列程序一起使用M13正向和反相引物：94℃ 1min；94℃30秒，55℃1分钟和72℃3分钟，30个循环。设计具有高Tms(＞72℃)的基因特异性引物，并用于使用更严格程序的扩增中，其与上述类似但使用68℃的退火温度。
编码免疫显性蛋白质的cDNA的PCR产生
用MarathonTM cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)连接物引物1(AP1)和从免疫显性蛋白质的N-末端和胰蛋白酶肽的蛋白质序列设计的简并引物，使用连接物连接的双链cDNA进行3′RACE PCR。用下列降落(touchdown)程序产生RACE产物：94℃ 1min；94℃30秒和65℃3分钟，5个循环；94℃30秒，60℃30秒和72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，55℃1分钟，72℃3分钟35个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应物的等分试样(10μL)并切除适当的条带，纯化并克隆于如上所述的pGEM-T Easy载体中。
从3′RACE产物的序列，设计基因特异性引物并与基于N-末端蛋白质序列的简并引物一起使用，以从cDNA模板扩增中间的DNA片段(在5’和3’末端之间)。以下列降落(touchdown)程序产生PCR产物：94℃ 1min；94℃30秒，65℃30秒和72℃7分钟，5个循环；94℃30秒，60℃30秒和72℃7分钟，5个循环；94℃30秒，55℃1分钟和72℃7分钟35个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应物的等分试样(10μL)并将适当的条带切除和凝胶纯化。然后将纯化的第一轮DNA用作模板与巢式引物进行下列程序扩增：94℃1分钟；94℃30秒，55℃1分钟和72℃8分钟，30个循环。在琼脂糖凝胶电泳后，凝胶纯化适当的PCR产物，并克隆于pGEM-T Easy载体中并随后测序。
使用cDNA作为模板，用AP1和从推定的中间DNA片段序列的5’区域设计的基因特异性引物进行5′RACE。以下列降落(touchdown)程序产生PCR产物：94℃ 1min；94℃30秒和72℃4分钟，5个循环；94℃30秒，70℃4分钟，5个循环；94℃20秒和68℃4分钟，30个循环。为了表征产物，将来源于5′RACE反应物的1μL样品用作模板，与巢式连接物引物2(AP2，CLONTECH)和巢式基因特异性引物以下列程序扩增：94℃1分钟；94℃30秒，65℃1分钟和72℃4分钟，30个循环。如上所述将适当的PCR产物凝胶纯化，克隆和测序。
从由5′和3′RACE产物获得的序列，设计基因特异性引物并与cDNA模板一起使用以下列程序产生全长cDNA：94℃1分钟；94℃20秒和72℃10分钟，30个循环。如上所述凝胶纯化和克隆DNA产物。编码免疫显性蛋白质的克隆的测序
使用引物-步行策略，从cDNA的5′末端向下游和从3′末端向上游移动，将包含编码全长成熟免疫显性蛋白质的cDNA的克隆测序。使用最少3个克隆来产生正向和反向的共有序列。通过将5′和3′RACE产物测序获得cDNA的极端5′和3′末端的序列。
RT-PCR
从包含大约106个寄生虫的细胞沉淀中分离来源于纯化的裂殖子和配子母细胞的信使RNA，并回收至10μL 10mM Tris-HCl pH8.0之中。使用OmniscriptTM RT试剂盒(QIAGEN)，用1μL每个mRNA制剂和特异于EmTFP250和组成型表达的巨型艾美球虫HSP70的引物进行逆转录。在缺乏逆转录酶的情况下也进行用作阴性对照的假逆转录反应。在37℃扩增所有的RT反应物1小时并随后用作标准PCR的模板。将对于EmTFP250的基因特异性引物和1μL每个RT反应产物和阴性对照一起用于使用下列程序的扩增：94℃1分钟；94℃30秒和72℃4分钟，30个循环。另外将EmTFP250引物还用于使用1μL质粒制剂和不含模板的对照、使用如上所述程序的PCR，所述质粒制剂包含形成孢子的卵囊的编码EmTFP250的cDNA。以较低Tms设计对于HSP70特异性的引物并与1μL来自各个RT的反应产物和下列程序一起使用：94℃1分钟；94℃30秒，55℃1分钟和72℃3分钟，30个循环。
基因组DNA纯化
将包含大约5×105个纯化的配子母细胞的细胞沉淀温和地重悬浮在2mL PBS和40μL 10％N-十二烷基肌氨酸之中，并在37℃下温育20分钟。加入不含DNA酶的RNA酶(20μL)并将溶液在37℃下另外温育20分钟，接着加入20μL 20mg/mL的蛋白酶K并在37℃下温育30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)并通过反转将溶液混合，之后在5,000xg下离心以强迫分离成有机相和水溶性相。移开包含基因组DNA的水相并如上所述用酚/氯仿/异戊醇重复萃取程序一次和用氯仿/异戊醇(24∶1)重复一次。在最后的萃取后，移开水相并如上所述DNA EtOH沉淀。在真空罩中干燥基因组DNA沉淀大约1小时，并使其重悬浮在4℃75μL TE缓冲液中O/N。将样品保存在4℃。
限制性酶切消化
为了DNA印迹法，在通过琼脂糖凝胶电泳之前用许多限制酶消化来自巨型艾美球虫的基因组DNA。将大约2.5μg的基因组DNA加入每个消化混合物中，其包含40U限制酶(2-4μL)，10μL适当的10x酶缓冲液，和ddH2O至100μL的终体积。将混合物在37℃下温育2小时，然后如上所述EtOH沉淀O/N。次日将干燥的沉淀重悬浮在20μL TE缓冲液中，在65℃下加热5分钟并简短地涡旋。加入另外10U适当的限制酶(0.5-1μL)，5μL 10x酶缓冲液和TE缓冲液至25μL，将混合物在37℃下温育1小时。为了评估消化的程度，将2μL每个样品在0.8％的琼脂糖凝胶上分离。产生从大约23kb至1kb的可见均匀条带的样品被接受用于进一步的分析。
在表达构建体的构建中，用BamHI和EcoRI限制酶双酶切PCR扩增的插入片段DNA和载体DNA。在通过琼脂糖凝胶电泳分析和随后凝胶纯化之前将混合物在37℃下温育1小时。
DNA印迹
如上所述通过琼脂糖凝胶电泳分离限制酶消化的基因组DNA或PCR产物。在用EtBr染色和随后照相后，将凝胶浸没在0.5M NaCl和0.5MNaOH的溶液中20分钟以使DNA变性，然后在ddH2O中漂洗，之后在2.5M NaCl和0.5M Tris-Cl pH7.4的溶液中进行中和20分钟。在ddH2O中漂洗之后，通过毛细管作用使用标准程序(Sambrook)将DNA转移至Hybond-N+核酸转移膜(Amersham)。在O/N转移后，使每个膜空气干燥10分钟，然后在80℃的真空烘箱中烘1小时。在与放射性标记DNA探针杂交之前将膜保存在热封的塑料袋中。
DNA探针制备
将来源于编码EmTFP250的cDNA的5′区域的1590bp DNA片段用来产生检测限制酶消化的巨型艾美球虫基因组DNA的探针。使用下列程序用EmTFP250基因特异性引物和EmTFP250质粒扩增探针DNA：94℃1分钟；94℃30秒，68℃1分钟和72℃3分钟30个循环。将根据EmTFP250/EtMIC4 DNA序列同源性设计的简并引物用来产生检测从来自澳大利亚艾美球虫属品系的基因组DNA扩增的PCR产物的622bp探针。使用下列降落(touchdown)程序从巨型艾美球虫的基因组DNA扩增探针DNA：94℃1分钟；94℃30秒，70℃30秒和72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，65℃30秒和72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，60℃1分钟和72℃3分钟，30个循环。
如上所述纯化PCR扩增的探针DNA，按照制造厂商的说明书使用随机引物DNA标记试剂盒(Roche)用32P-dCTP标记大约25ng。按照Sambrook的方法通过TCA沉淀测定探针的比活性，具有大于75％的掺入的探针被接受使用。
杂交
将每个尼龙膜放置在适当大小的杂交管(Hybaid)中并加入预热到65℃的杂交液。在65℃下预杂交2小时后，用预热到65℃的新鲜杂交液替换溶液。通过在100℃下加热10分钟使放射性标记的DNA探针变性，然后加入杂交管并允许在65℃下杂交16-20小时。在杂交后移开膜，并在65℃下在2×SSC和0.1％SDS中进行2×30分钟的洗涤，接着在65℃下在0.1％SSC和0.1％SDS中洗涤2×30分钟。然后用3 MM纸将膜吸干以去除多余的水份，覆盖在塑料包中并且放置于在两边包含增感屏的胶卷暗盒中。在曝露于X光片适当的时间后使用标准程序将膜显影。
通过PCR检查基因组组构
使用一系列对于编码EmTFP250的cDNA特异性的引物对，从包含EmTFP250 cDNA的质粒和从巨型艾美球虫基因组DNA扩增相应的片段。使用下列高严格程序：94℃1分钟；94℃20秒和72℃4分钟30个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并将适当的条带测序以便证实内含子的存在。
通过PCR和DNA杂交检测艾美球虫属的澳大利亚品系中的EmTFP250同源物
将根据EmTFP250和EtMIC4之间的序列同源性设计的一对简并PCR引物用于基因组DNA的扩增，所述基因组DNA分离自鸡的7种艾美球虫属寄生虫的澳大利亚品系。将来源于每个品系的大约50ngDNA与下列降落式(touchdown)PCR程序一起使用：94℃1分钟；94℃30秒，70℃30秒和72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，65℃30秒和72℃3分钟，5个循环；94℃30秒，60℃1分钟和72℃3分钟，30个循环。在0.8％的琼脂糖凝胶上分离来源于每个反应的10μL样品，随后染色并照相，然后通过DNA印迹转移至尼龙膜。如上所述使用以上的简并引物对从巨型艾美球虫Houghton品系的基因组DNA产生DNA探针，并与转移的DNA杂交。在杂交和洗涤程序后，将膜曝露于X光片10和30分钟的时间。
通过蛋白质印迹分析显示，通过故意的用巨型艾美球虫感染母鸡诱导的保护性母体抗体始终识别在巨型艾美球虫的粗提物中的一种高分子量，无性繁殖阶段的蛋白质。另外，发现用乳化的免疫显性蛋白质的SDS-PAGE剪切块的免疫在随后用巨型艾美球虫攻击的鸡中诱导显著的保护。(Smith等，1994)。
根据提示关于免疫显性蛋白质的保护能力的初步研究，以下介绍的工作的目的是两方面的：(1)部分纯化免疫显性蛋白质以便获得用于cDNA克隆中的下游应用的N-末端和肽序列数据和；(2)使用识别该蛋白质的抗血清以提供关于它的生物化学的基本信息，以及对它的阶段发育和跨越艾美球虫属的各种品系和物种的保守性的了解。
结果
粗制抗原的免疫检测
将大约5μg形成孢子的卵囊粗提物样品加样至5％聚丙烯酰胺分离胶(Bio-Rad)的分开的孔上，电泳并转移至PVDF。在转移后将PVDF切割成条，并用在先前母体免疫试验(Smith等，1995)期间收集的各种鸡血清和卵黄检测单个条带。以1/100的稀释度使用血清，以1/500的稀释度使用卵黄。
用于分析图9所示条带的所选免疫血清是从感染巨型艾美球虫的母鸡的3日龄孵化小鸡(泳道1)，用巨型艾美球虫攻击的类似的12日龄孵化小鸡(泳道2)，和用巨型艾美球虫的裂殖子粗提物免疫的母鸡(泳道3)中收获的。所有主要检测到的蛋白质条带具有大于230kDa的表观分子量。使用来源于230kDa条带的裂殖子剪切块实验的卵黄样品的分析也与相同大小的条带反应，尽管没有同样强烈(泳道4)。来自未感染的鸟的对照鸡血清不与提取物反应(泳道5)。
免疫显性蛋白质的纯化
离子交换层析
如上所述将大约1.5mg形成孢子的卵囊粗制抗原加样至DEAEsephacel离子交换柱上。根据表示使用递增的NaCl浓度洗脱的A280nm吸收峰(图10)手动收集级分。
通过离心超滤浓缩所有级分，对于每个产生大约60μl的保留体积。从每个级分中，将15μl渗余物加样至平行的7.5％SDS PAGE凝胶(Bio-Rad)上并在还原条件下电泳。在电泳后，将凝胶之一进行银染色(图11.A)，同时将第二块凝胶蛋白质印迹，并用来自用裂殖子粗提物感染的母鸡的血清检测转移的蛋白质(图11.B)。以在PBS中1/100的稀释度使用血清样品。
如通过银染和免疫印迹都可以看出，以大于230kDa的表观分子量迁移的免疫显性蛋白质主要出现在用0.3-0.5M NaCl洗脱的那些级分中。如通过银染色显示，在前面的级分中洗脱了污染的大部分，较小分子量的蛋白质，或者可能在超滤期间去除它们。
为了进一步分析部分纯化的包含免疫显性蛋白质的级分，将15μl用0.3-0.4M NaCl洗脱的那些级分中的每一个加样至平行的5％SDS-PAGE凝胶上(Bio-Rad)。在电泳后将凝胶之一银染(图12A)，另一个蛋白质印迹(图12B)。用在用巨型艾美球虫攻击孵化的小鸡后，从感染巨型艾美球虫的母鸡的12日龄孵化小鸡收集的血清免疫检测转移的蛋白质。以1/100的稀释度使用血清。
在富集免疫显性蛋白质和通过5％SDS-PAGE分离的那些级分中，蛋白质作为在250kDa之上迁移的单独的条带出现并与污染，共迁移的蛋白质分离(图12A)。与母体免疫相关的血清与高分子量蛋白质条带强烈反应(图12B)。
大小排阻层析
通过IEX层析分离大约10mg形成孢子的卵囊粗提物，并如上所述将收集的级分浓缩。合并用0.3-0.4M NaCI洗脱的级分并通过真空离心2小时将样品体积减少至15μL。将浓缩的样品注射到Superdex 200 PC凝胶过滤柱上，并如上所述洗脱和收集蛋白质级分。图13显示获得的A280nm洗脱图。对于级分7-15中的每一个，将5μL加样至7.5％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)的分离孔上并在还原条件下电泳。期望在级分15之后洗脱的级分不包含高分子量免疫显性蛋白质并不被分析。在电泳后，将凝胶进行银染色(图14)。
从图14可以看出，迁移至250kDa之上的免疫显性蛋白质通过级分7-15洗脱。尽管所有级分似乎明显比IEX纯化的前体级分透明，剩余一些较低分子量的污染蛋白质。
蛋白质测序
N-末端测序
通过离子交换层析纯化约10mg来源于巨型艾美球虫的Houghton品系的形成孢子的卵囊粗提物，如上所述通过SDS-PAGE进一步分离富集免疫显性蛋白质的浓缩级分。在将蛋白质转移至PVDF和通过考马斯亮蓝染色检测后，切除包含免疫显性蛋白质的膜片，随后在澳大利亚蛋白质组分析机构通过Edman降解法将蛋白质样品测序。另外，在Biotech Australia Pty.Ltd.将如上制备的和来源于大约1.0mg巨型艾美球虫澳大利亚品系的形成孢子的粗提物的蛋白质样品测序。
如表1所示的N-末端测序结果显示IEX层析，离心超滤和凝胶电泳的方法充分纯化了用于氨基末端分析目的的免疫显性蛋白质。从Houghton品系的样品大约13pmol蛋白质可供测序，而存在大约1pmol澳大利亚品系的样品。Houghton品系样品的序列要求16个循环，在第9循环处有一个空白，其可能显示在那个循环的半胱氨酸残基或修饰的氨基酸(例如糖基化)。澳大利亚品系的序列要求8个循环，与对Houghton品系序列预测的开始的8个残基完全匹配。
表1从巨型艾美球虫的Houghton和澳大利亚品系中分离的免疫显性蛋白质的N-末端测序结果。使用单字母氨基酸符号表示序列，N-末端在左边。巨型艾美球虫品系 N-末端序列 SEQ.ID NO.Houghton EVNNELSK-ES GWTPW 8澳大利亚 EVNNELSK 42
胰蛋白酶肽测序
通过IEX层析纯化大约10mg形成孢子的卵囊粗提物，合并富集免疫显性蛋白质的级分，如上所述通过离心超滤浓缩并通过SDS-PAGE分离。然后将包含免疫显性蛋白质的凝胶条从凝胶上切除，并递送至澳大利亚蛋白质组分析机构来胰蛋白酶消化，和随后通过质谱分析来序列分析产生的肽。对于类似地来源于大约10mg形成孢子的卵囊粗提物的第二个蛋白质样品，重复该程序。
对于2个胰蛋白酶肽产生预测序列并在表2中显示，然而，对调用的序列给予有限的置信度。可能由于蛋白质的结构，许多产生的肽具有相似的质量，使得难以区分它们和保证只有单个的肽进行MS/MS分析(Hains，APAF，个人通讯联络)。此外由于它们相同的分子量，该技术不区分亮氨酸和异亮氨酸(表示为[L/I])。
表2从巨型艾美球虫的Houghton品系分离的免疫显性蛋白质的胰蛋白酶肽测序结果。使用单字母氨基酸符号表示序列，每个肽的N-末端在左边。蛋白质样品# 肽序列SEQ.ID NO. 1 QWTAWTE 9 2 E[L/I]VNWF 10
序列分析
将关于免疫显性蛋白质的N-末端和胰蛋白酶肽产生的序列提交针对通过NCBI访问的所有非冗余数据库的BLASTP分析。使用Basic BLAST参数未获得对于序列有意义的对比，然而对于胰蛋白酶肽#1选择PAM-30矩阵和100的E值的高级BLAST搜索产生与来源于柔嫩艾美球虫的微丝蛋白质4(EtMIC4)的对比。针对专利数据库使用相同的搜索产生与来源于柔嫩艾美球虫的表面抗原5401-一种与EtMIC4几乎相同的蛋白质-的单个对比。N-末端序列和胰蛋白酶肽#2序列都不能与EtMIC4或表面抗原5401序列对比。
Triton X-114分级
为了确定免疫显性无性繁殖阶段的蛋白质主要是作为可溶性蛋白质存在于寄生虫内，还是作为整合膜蛋白，在去污剂TX-114中将巨型艾美球虫的裂殖子分级。如上所述溶解和分配大约107个裂殖子，保留水和去污剂可溶性级分和去污剂不溶性级分。用水将所有级分稀释至250μL体积(与初始的细胞裂解液体积相等)和4×SDS-PAGE将样品缓冲液减小至1x浓度。从每个样品中，将20μL加样至7.5％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)的分开的孔上并如上所述电泳。然后通过蛋白质印迹将分离的蛋白质转移至PVDF，并用以1/100稀释度使用的抗粗制裂殖子血清检测。
从图15可以看出，高分子量的免疫显性蛋白质主要分配于水溶性级分(泳道1)中，然而在TX-114去污剂可溶性相中微弱可见以相同表观分子量迁移的蛋白质条带(泳道2)。另外在去污剂不溶性级分中可见相同大小的蛋白质条带(泳道3)。
跨越发育阶段检测免疫显性蛋白质
如上所述制备来源于发育的无性和有性阶段的蛋白质提取物，并通过Western分析比较。将大约10μg来源于形成孢子的卵囊，裂殖子和配子母细胞粗提物的样品加样于7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的相邻的孔上，在还原条件下电泳并转移至PVDF。在转移后，用来源于感染裂殖子粗提物的母鸡的血清免疫检测膜。
如在图16中可以看出，在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中检测免疫显性蛋白质(泳道1和2)，但在配子母细胞粗提取物中未显示(泳道3)。该结果与早期的发现(Smith，1994)一致，显示免疫显性蛋白质局限于发育的无性繁殖阶段。
跨越艾美球虫属的品系和物种检测免疫显性蛋白质
为了研究免疫显性蛋白质的保守性，使用来自感染裂殖子粗提物的母鸡的血清，通过免疫印迹分析来比较来源于巨型艾美球虫的Houghton和澳大利亚品系，和来源于柔嫩艾美球虫的澳大利亚品系的形成卵囊的粗提物。如上所述，在还原条件下在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离大约10μg各个提取物，转移至PVDF并免疫检测。
从图17中，在来源于巨型艾美球虫的Houghton品系(A，泳道1)和澳大利亚品系(A，泳道2；B，泳道1)的提取物中观察到以约250kDa迁移的免疫显性蛋白质。另外，在柔嫩艾美球虫澳大利亚品系的提取物(B，泳道2)中血清主要检测到高分子量蛋白质条带，其迁移稍微快于在巨型艾美球虫的提取物中可见的免疫显性蛋白质条带。该结果提示跨越艾美球虫属品系和物种的免疫显性蛋白质的保守性程度，暗示功能上的意义。
SDS-PAGE表征
在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE分析富集高分子量免疫显性蛋白质的蛋白质样品。如上所述，通过离子交换层析纯化大约1.2mg形成孢子的卵囊的粗制抗原，合并包含免疫显性蛋白质的级分(0.3和0.4MNaCI级分)，并浓缩至60μL体积。将来自那些级分的等分试样(8μL)加样至7.5％(图18.A)和5％(图18.B)PAGE凝胶(Bio-Rad)上，并且在样品缓冲液中含有或不含2-β-巯基乙醇的情况下电泳。在电泳后，将凝胶蛋白质印迹并用以1/100的稀释度使用的抗-粗制裂殖子血清进行免疫检测。
如在图18.A中可以看出，在2.5-10％v/v浓度的2-β-巯基乙醇存在的情况下，当在7.5％凝胶上分析富集免疫显性的蛋白质时(泳道2-6)，检测到以约250kDa迁移的单一的主要条带。然而在非还原条件下，血清检测到比在还原样品中可见的免疫显性条带迁移稍快的高分子量双联体条带。另外，检测到以大约75kDa的表观分子量迁移的第二种免疫显性条带，其在还原的样品中未显示。
当与在5％凝胶上的分离(图18.B)相比时，在还原的样品(泳道2)中检测到以显著高于250kDa的表观分子量迁移的免疫显性条带。在非还原条件下，双联体条带更明显并且发现迁移显著地快于还原样品中的免疫显性条带。当在7.5％凝胶上分离时，在非还原样品中检测到的75kDa条带在5％聚丙烯酰胺上分离后未检测到，可能因为它已经迁移到凝胶底部之外。它在还原条件下分析的样品中不可见可能是因为在天然蛋白质中存在的表位在还原后丢失，或者天然形式是较小的二硫键结合的多肽的寡聚体，其迁移出凝胶之外。
结果提示高分子量免疫显性蛋白质是单体，链间的二硫键结合稳定天然蛋白质。在非还原条件下检测到的双联体条带可能说明蛋白质同分异构体的形式的存在。
讨论
已经描述为了蛋白质测序目的的高分子量，免疫显性蛋白质的纯化。通过离子交换层析将巨型艾美球虫形成孢子的卵囊提取物级分，通过离心超滤浓缩并进一步通过SDS-PAGE分离以为N-末端和胰蛋白酶肽测序提供足够纯度和数量的蛋白质。
为了研究在具有更高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质迁移，和选择用于检测的适当抗体，在还原条件下最初将形成孢子的卵囊提取物在5％聚丙烯酰胺凝胶上分离，用在先前的母体免疫试验(Smith等，1994)期间收获的各种血清和卵黄进行免疫印迹。血清和卵黄样品主要检测到单一的蛋白质条带，表观分子量显著大于250kDa，稍微大于先前从使用11％凝胶的SDS-PAGE预测的230kDa(Smith等，1994)。然而估值只能被认为是近似的，因为在一些情形下蛋白质可以以表观分子量不相称的增大而迁移，例如糖基化和磷酸化的蛋白质(Smith，1997；Dunn，1993)。
从在最初的免疫检测实验中使用的血清和卵黄样品中，选择来源于感染巨型艾美球虫裂殖子粗提物的母鸡的血清用于许多随后实验中的免疫印迹。尽管理想地，本应该在整个研究中使用母体保护性抗体，其来源于故意用活卵囊感染的母鸡，可以极有限量地获得该抗体，当可能时保存。重复母体免疫试验以获得抗体被认为太费时，并且不能排除在该实验中产生的抗血清不能检测相同免疫显性蛋白质的可能性。可以提供较大量的来源于感染裂殖子粗提物的母鸡的抗血清，并证明是强烈反应性的。尽管可以争论不同的抗体可能主要检测不同的蛋白质，结果显示这不太可能。该分子量的蛋白质在蛋白质组中相对稀少(Shirley等，1992)并且通过来自两个来源的抗血清检测的蛋白质的银染色未提示共迁移蛋白质的存在。
在选择和开发用于纯化免疫显性蛋白质的方法中考虑许多问题，首先是蛋白质的来源。先前的工作已经在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中检测到蛋白质，并且SDS-PAGE剪切块保护实验使用从裂殖子制备的蛋白质提取物。尽管根据与先前研究的联系，可能已经优选从裂殖子中获得蛋白质，证明难以获得用于方法开发和测序所需的大量裂殖子。据估计对于250kDa蛋白质和要求的对于N-末端测序所建议的10pmol最小量(McInerny，Biotech Australia和APAF，个人通讯联络)，将需要大约10μg纯化的蛋白质。保守地，如果免疫显性蛋白质表示1/1000的巨型艾美球虫蛋白质组，那么不考虑用于方法开发，仅对于N-末端测序需要10mg粗提物。在为了收获裂殖子的鸡的常规感染中，从20只鸟中每只鸟获得大约108个裂殖子，产生小于0.5mg的总蛋白质提取物。比较起来，从20只鸟的感染中获得大约1×108个卵囊，产生大约10mg的粗提物(结果未显示)。另外难以纯化裂殖子并且制剂总是包含一定程度的宿主组织和碎片污染，而更坚固的卵囊相对容易清洗和通过次氯酸钠处理灭菌。另外，通过与国家兽医研究所(乌普萨拉，瑞典)合作可以获得大量补充的形成孢子的卵囊。
尽管不能排除在形成孢子的卵囊和裂殖子提取物中检测到的免疫显性条带不表示相同的蛋白质，但它似乎不大可能。抗-裂殖子粗制抗体在形成孢子的卵囊和裂殖子的提取物中主要检测到大约250kDa的蛋白质，并且如上所述，该高分子量的蛋白质在蛋白质组内相对稀少。另外，来源于SDS-PAGE剪切实验的卵黄样品和来源于感染裂殖子粗提物的母鸡的血清，两者在形成孢子的卵囊粗提取物中都检测到相同表观分子量的蛋白质条带。
N-末端测序所需的蛋白质的数量需要开发产生富集免疫显性蛋白质的蛋白质级分的程序。尽管2-D电泳具有巨大的分离复杂蛋白质混合物的能力，但由于它固有的低蛋白质加样能力(Dunn，1997)，在本申请中认为它不是用于N-末端测序的适当技术。另外，在第一维上疏水的和高分子量蛋白质微弱地吸附在IEF凝胶上(个人通讯联络，APAF)。选择离子交换层析用于分离，其是适合于水溶性蛋白质的广泛使用的技术，具有高结合量并保持蛋白质的生物活性(Scopes，1994)。
在IEX层析后，在进一步分析之前必须脱盐和浓缩级分。选择具有100kDa的分子量截止的离心浓缩器用于本申请，产生另外的去除一些小分子量蛋白质的好处。然后在努力利用免疫显性蛋白质的高分子量和去除剩余的较低分子量蛋白质中尝试凝胶过滤层析。然而该技术最适合作为纯化中最后的精加工步骤，而不是作为对于相对复杂的蛋白质混合物的分离工具(Scopes，1994)。随后通过SDS-PAGE和银染色的分析未提示富集免疫显性蛋白质的IEX级分的显著的进一步分离，未进一步开发该方法。
N-末端和胰蛋白酶肽测序获得的结果显示，用于浓缩和分离免疫显性蛋白质的技术对于蛋白质测序的目的是足够的。将N-末端和胰蛋白酶序列进行Basic BLAST搜索，然而未产生有意义的对比。然后进行高级的BLAST搜索以便产生短序列对比，其使用适当的搜索矩阵(PAM-30)和增大的期望(E)值。产生胰蛋白酶肽1#和来源于柔嫩艾美球虫的微丝蛋白质4的对比，所述微丝蛋白质4是一种在微丝中和在寄生虫表面上表达的高分子量酸性蛋白质(Tomley等，2001)。尽管令人感兴趣，结果不能被认为是在统计上有意义的。在BLAST搜索中有意义的最大指标是表示从具有相同分数的数据库中预计的概率匹配数的E值(Wolfsberg和Madden，1999)。对于EtMIC4对比产生的43的E值提示匹配是由于偶然导致的强大的概率。
在阴离子交换层析过程中，免疫显性蛋白质在相对高的NaCl浓度下和在广泛的浓度范围内被洗脱下来，其显示蛋白质是酸性的并且提示电荷不均匀性的程度。该微观不均一性可以被认为是许多因素造成，所述因素包括稳定的备选构象异构体的存在，不同寡聚亚基的组合，或者不同程度的糖基化，磷酸化，甲基化或乙酰化(Righetti，1983)。来源于在还原条件下的SDS-PAGE分析的结果显示免疫显性蛋白质是由一条多肽链组成的单体，因此排除了不同寡聚体促使电荷不均匀性的可能性。然而当在非还原条件下分析时，高分子量免疫显性蛋白质作为双联体条带出现，可能提示稳定的构象异构体，或由有差别的翻译后修饰导致的同分异构体的存在。在2-β-巯基乙醇存在的条件下，构象异构体或变化的修饰对于表观分子量的影响于是被减小，其解释在还原条件下在分析后检测到单一的蛋白质条带。
实施例5
克隆cDNA和表征编码来源于巨型艾美球虫的免疫显性无性繁殖阶段的蛋白质的基因
在重组亚基疫苗的开发中，克隆编码所考虑的蛋白质的cDNA极为重要。cDNA克隆的成功主要取决于高质量cDNA文库的制备和适当的筛选程序的选择，所述筛选程序是由可提供的材料和信息决定。
已经报导了大量编码推定的保护性抗原的重组cDNA克隆，大多数已经通过用针对寄生虫粗提物或选择的表面或内部蛋白质产生的抗体筛选cDNA表达文库而被鉴定。该技术依赖于相对大量的优质抗体的可用性，所述抗体能够在变性条件下强烈识别所考虑的蛋白质(Sambrook)。主要是因为只可极有限量地提供该抗血清，不认为该方法适合于克隆编码巨型艾美球虫无性繁殖阶段的免疫显性蛋白质的cDNA。作为备选，考虑基于RACE PCR的策略，最初使用简并引物，其是基于对于免疫显性蛋白质的N-末端和胰蛋白酶肽(实施例5)产生的蛋白质序列而设计的。然后RACE产物的产生和测序将通过5′和3′基因特异性引物的使用而促进全长cDNA的扩增和克隆。
描述工作的目的是使用基于PCR的方法克隆和测序编码在实施例5中讨论的高分子量免疫显性蛋白质的cDNA。另外，随后的cDNA和相应基因的表征可以提供增加的蛋白质的结构和功能的理解，并且进一步举例说明它作为重组疫苗目标的潜力。
结果
RNA分离和cDNA文库构建
用玻璃珠将卵囊破裂和用TRIzol′试剂处理产生的均浆证明是用于从巨型艾美球虫形成孢子的卵囊中分离高质量的总RNA的适当方法。如上所述从大约2.5×107个形成孢子的卵囊中分离RNA，提供184μg RNA的产率，相当于7.36pg/卵囊。为了评估RNA制剂的完整性，在1％的非变性琼脂糖凝胶上分离2.5μg样品。如图19所示，不连续的rRNA条带和与18S rRNA条带相比更高亮度的28S rRNA条带显示高质量的样品。另外通过测量A260/280比率评估制剂的纯度，产生1.983的值，其属于1.7-2.0的可接受范围内。
如上所述将全部总RNA样品用于mRNA的制备，并将mRNA回收在8μL DEPC处理的ddH2O中。推定100％的回收和mRNA的相对分布在1-5％的总RNA之间，估计1.84-9.2μg的mRNA产率。cDNA文库构建需要1μg mRNA，将mRNA样品中的一半用于第一条链cDNA合成。还使用包括在MarathonTM cDNA扩增试剂盒中的1μg人胎盘聚腺苷酸化RNA进行阳性对照的cDNA合成，据报导典型地产生大约1μg的双链cDNA。
为了监测在构建文库过程中cDNA的合成和纯化，在第一条链的反应混合物中包括[α-32P]dCTP。在第二条链合成后，用900系列辐射微型监测仪(Mini Instruments Ltd.，英国)检查实验的双链cDNA产率，估计大约为阳性对照双链cDNA产率的1/10。因为样品产率显著小于所预计的，没有通过琼脂糖凝胶电泳评估形成孢子的卵囊双链cDNA的完整性。将整个双链cDNA样品用于连接物连接，并按照适合于PCR的浓度稀释。
为了保证cDNA连接物的连接成功和Marathon RACE方案适合于与PTC-200Peltier热循环仪一起使用，与对照引物和推荐的PCR程序一起使用对照双链cDNA进行对照PCR实验。在扩增后在1％的琼脂糖凝胶上分析样品。所有的5′和3′RACE以及内部对照反应都产生期望大小的DNA条带(结果未显示)。
克隆编码免疫显性蛋白质的cDNA
注释：为了方便，在表3中表示贯穿本部分涉及的简并和基因特异性引物的序列
基于从免疫显性蛋白质的N-末端和胰蛋白酶肽产生的序列设计许多简并PCR引物。另外，进一步研究EtMIC4和5401柔嫩艾美球虫表面抗原序列显示类似于来源于巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的胰蛋白酶肽#1的许多短的肽基序。如图20所示，所有柔嫩艾美球虫的基序在羧基末端包含保守的半胱氨酸残基。将该信息用于设计另外的简并引物，其基于胰蛋白酶肽#1并结合C-末端半胱氨酸。通过考虑在柔嫩艾美球虫的基因序列中报导的密码子使用(Ellis等，1993)降低引物内的简并性水平。
将基于胰蛋白酶肽#1的简并引物用于3′RACE PCR，并且如图21所示扩增许多产物。使用引物AP1和FP008产生大约2.2kb的主要条带，所述FP008是用适于C-末端半胱氨酸残基的3′TG设计的。将该条带克隆并部分测序，并提交针对所有通过NCBI访问的非冗余数据库进行BLASTX分析。分析显示与EtMIC4预测的氨基酸序列区域的高水平同源性(图22)。
正向和反向基因特异性引物是从3′DNA条带的序列设计的并与基于N-末端蛋白质序列的简并引物一起用于PCR。FP004(简并)和RP016(基因特异性)引物扩增许多产物，选择大约6kb的条带用于凝胶纯化(图23A)。为了进一步表征条带，将1μL纯化的产物用作使用FP006(简并)和RP015(基因特异性)引物的巢式PCR反应的模板。将大约6kb的扩增条带(图23B)凝胶纯化，克隆并部分测序。
从上面获得的序列的5′区域，设计基因特异性反向引物以扩增cDNA的5′末端。使用引物RP019和RP020(位于RP019的3′的31bp)进行分开的5′RACE反应，如图24所示，泳道2和3，两个反应都扩增500-600bp的相似大小的条带。为了进一步表征扩增产物，将1μL RP020 RACE反应用作使用AP2和RP019引物的巢式PCR反应的模板。反应产生500-600bp的期望大小的单一产物(图24，泳道4)。克隆条带，序列的翻译显示如通过Edman降解测定的成熟免疫显性蛋白质的N-末端蛋白质序列(图25)。
从5′和3′RACE产物的序列设计基因特异性引物以扩增推定编码完整的、成熟免疫显性蛋白质的cDNA。用引物FP015和RP023产生估计大约为7kb的单一条带(图26)，并如上所述克隆。在图27中表示PCR克隆策略的图解概述。
表3
用于克隆巨型艾美球虫免疫显性蛋白质的cDNA的寡聚核苷酸引物。
引物 序列(5’-3’)
AP1 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC
FP008 TGGACNGCNTGGACNGARTG
FP004 AARTGYGARTCNGGNTGGAC
RP016 CGTTGTTCGCCGGCTTGCTGCACTCCTC
FP006 GARTCNGGNTGGACNCC
RP015 GTTGCATTCGCTCCATGGGCCCCACTG
RP019 CTGTCCCACCACACACGACATATCGCC
RP020 CCTGCATGCCCTCACTTCCTGCACCTC
AP2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC
FP015 GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCG
RP023 GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCG
全长cDNA的序列分析
通过将推定编码整个成熟蛋白质的克隆和与此重叠的5′和3′RACEPCR产物测序产生全长cDNA序列。除了在cDNA的极端5′未端的大约50bp区域以外全都被测序，重复努力将该富含T的区域测序是不成功的。cDNA预测7122bp的可读框并且显示7080bp的编码区，680bp的3′非翻译区和大约280bp的5′非翻译区。针对所有通过NCBI访问的非冗余数据库的推定编码序列的BLASTN分析显示与EtMIC4的mRNA序列的高水平同源性(图28)。将EmIP和EtMIC4 cDNA编码序列配对的Clustal W(1.4)序列对比产生60％的同一性分数(对比未显示)。
预测的免疫显性蛋白质的一级结构
在图29中表示推定编码EmIP的全长cDNA和预测的翻译。第一个符合读框的ATG在从预测的ORF的开始下游43bp处出现，并且可能表示起始甲硫氨酸，条件是它编码在如通过Edman降解测定的成熟N-末端上游中出现的唯一符合读框的甲硫氨酸。此外将翻译序列通过ExPASY提交给SignalP 1.1版互联网服务器，显示典型的26个氨基酸的信号肽，从推定的起始甲硫氨酸开始并在成熟N-末端之前紧接着具有一个切割位点。
通ORF预测的成熟多肽包括2334个氨基酸，如通过程序ProtParam确定具有预测的大约246kDa的分子量和4.2的理论pI。多肽具有表示12.3％氨基酸含量的高频率的谷氨酸残基，和与147个带正电的残基(精氨酸和赖氨酸)相比总共440个带负电的残基(谷氨酸和天冬氨酸)，其解释了预测的负电荷。蛋白质还特别富含甘氨酸和半胱氨酸，其分别表示11.8％和10.6％的氨基酸组成。
为了搜索蛋白质内部的保守结构域，将多肽序列通过ExPASY服务器提交给SMART，ScanProsite和PROSCAN程序分析。预测蛋白质的大部分包含两种不同富含半胱氨酸的附着结构域的重复，其已知与细胞之间和细胞与胞外基质之间的重要的结合相互作用相关。第一组包括16个人血小板反应蛋白(TSP-1)的类型1重复的截短形式的重复，出现在残基27-194(4拷贝)，1517-1648(3拷贝)和1765-2143(9拷贝)(图30)。16个重复中的9个其特征在于WXXW基序，其类似于与蛋白聚糖和硫酸化糖脂结合直接相关的TSP-1 WSXW基序(Guo等，1992)。WXXW基序的下游，重复中的8个包含基本残基基序RXR，其与糖胺聚糖介导的细胞结合活性相关(Gantt等，1997)。
第二个附着结构域组构成大约57％的成熟蛋白质并包含31个表皮生长因子样(EGF-样)结构域家族的串联重复，其出现在残基195-1513之间(图31)。在真核生物的大量膜结合的和胞外蛋白质中已经鉴定了这些结构域，并且被认为主要涉及配体受体的相互作用。结构域的特有特征是存在6个高度保守的半胱氨酸残基。所有存在于免疫显性蛋白质中的EGF样重复提示为了它们的生物功能需要钙的EGF-CA钙结合结构域亚型的典型模式。
在TSP-1重复7和8之间(残基1649-1764)多肽包含2个富含谷氨酸和甘氨酸残基的低复杂，高度带负电荷的区域中的第一个。第一个区域其特征在于7个重复的基序GEVQPGTEEGAGVG SEQ.ID NO.的简并形式(图32A)。第二个区域出现在残基2144-2285之间的最后TSP-1重复之后，另外富含脯氨酸残基(图32B)。紧接着第二个低复杂度区域的下游是预测的跨膜区域(TM)和胞质尾区(CT)，其在顶复门(apicomplexa)微丝蛋白质的TRAP家族的成员中发现高度保守(图33)。胞质尾区区域其特征通常在于在TM附近保守的酪氨酸残基和靠近C-末端保守的色氨酸残基的存在。
蛋白质的结构特征在图34中用示意图显示。针对所有通过NCBI访问的非冗余数据库的预测多肽序列的BLASTP分析显示与EtMIC4的最高分对比，和与蛋白质的原纤蛋白家族成员的有意义分数(图35)。与EtMIC4的ClustalW(1.1)对比显示61％的氨基酸同一性分数，另外10％相似性(未显示全对比)。通过用GAP和GAPSHOW程序分析在图36中图解表示在氨基酸水平上EmIP和EtMIC4之间的总体相似性，其显示在由EGF样重复跨越的区域内特别高的保守程度。两个蛋白质在N-末端最不相似。
跨越发育阶段的免疫显性蛋白质的表达
注释：为了方便，贯穿本部分涉及的基因特异性引物的序列在表4中表示
为了证明显示EmIP局限于发育的无性繁殖阶段的早期发现，从裂殖子和配子母细胞中分离mRNA并使用EmIP基因特异性引物RP022进行RT-PCR。另外，引物CRP6(对于组成型表达的巨型艾美球虫HSP70特异)被包括在所有的RT反应内作为阳性对照。在缺乏逆转录酶的情形下还进行重复反应以证实产生的PCR条带不是从可能污染mRNA样品的基因组DNA扩增的。用1μL每个RT反应产物进行标准PCR反应，使用EmIP特异性引物FP010和RP023以产生1211bp期望大小的产物，和HSP70特异性引物CFP1和CRP3以产生具有336bp预测大小的条带。为了证实用EmIP引物扩增的产物的同一性，如上所述将1μL包含形成孢子的卵囊的编码EmIP的cDNA也用于使用FP010和RP023的扩增。还包括无模板对照以确保PCR试剂未被污染。
在PCR后，通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分析来自所有反应的样品。如在图37中可以看出，对EmIP特异性的引物从形成孢子的卵囊cDNA中扩增期望大小的条带(泳道2)，并在裂殖子中检测到对EmIP特异性的信使RNA(泳道3)。从配子母细胞的mRNA模板未产生对EmIP特异性的PCR产物(泳道4)，然而HSP70阳性对照引物从裂殖子(泳道5)和配子母细胞(泳道6)的mRNA中扩增期望大小的条带。在RT阴性对照中(泳道7和8)，或者在无模板对照中(泳道9)未产生扩增产物。结果证实免疫显性蛋白质存在于发育的无性繁殖阶段但在配子母细胞中不表达。
表4
在RT-PCR分析中用于基因特异性产物的扩增的寡聚核苷酸引物。
当适用时给出PCR产物的预测大小。
基因 引物 序列(5’-3’) 产物大小(bp)
EmIP RP022 CGAGCTCTTGGGGTGGAGATGCAACTG N/A
EmHSP70 CRP6 TGTTTATTAGCCTCATCCTCTGCC N/A
EmIP FP010 CAGTGGGGCCCATGGAGCGAATGCAAC 1211
RP023 GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCG
EmHSP70 CFP1 AGGATTAGAGACAGCAGGAGGAG 336
CRP3 CCTTGACTAAGTCTACCCTTATC
基因组组构
限制酶分析
在0.9％琼脂糖凝胶上分离限制酶切消化的巨型艾美球虫的基因组DNA并如上所述转移至尼龙膜。使用通过用EmIP特异性引物FP015(5′-GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCG-3′)和RP033(5′-GGCGCACTCGTCGATATCTTTGCATGC-3′)的PCR扩增产生的1590bp cDNA片段将膜杂交。如从图38中可以看出，用BglII(泳道1)，EcoRI(泳道2)，HindIII(泳道3)，NcoI(泳道4)，和NdeI(泳道5)消化产生单一的杂交条带，而由于在探针序列内存在切割位点用NsiI(泳道6)消化产生两条带，因此互补的基因组DNA。DNA印迹分析提示编码EmTFP250的基因是作为单拷贝存在于巨型艾美球虫的基因组内。
内含子-外显子结构
在用EmIP cDNA的PCR扩增中使用一组4对基因特异性引物以产生一系列覆盖编码成熟免疫显性蛋白质的cDNA的DNA片段(表5)。为了检测EmIP基因内部的内含子，还将引物对用于用巨型艾美球虫基因组DNA的扩增中以产生表示相应基因片段的DNA条带。在通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物后，通过在相应的cDNA片段上增加尺寸来鉴定推定的包含内含子序列的DNA条带。如图39所示，所有的引物对从基因组DNA中主要扩增单一的PCR产物，其尺寸大于cDNA对应物。从对所有引物对进行的单引物和无模板阴性对照中未产生产物(结果未显示)。
为了证实内含子的存在，将通过用引物FP010和RP023扩增产生的基因组DNA片段纯化和测序。序列分析分别显示2个推定的139bp和151bp的内含子，包含典型的真核供体/受体位点(图40)。通过引物对FP015/RP033，FP021/RP030和FP026/RP015扩增的基因组片段未被测序。跨越艾美球虫属的品系和物种的EmIP的保守性
使用Clustal W(1.4)多重序列对比程序将EmIP和EtMIC4的cDNA和蛋白质序列对比，基于高度保守区域(图41)设计简并PCR引物。将引物对CP003(5′-AAGACTTCGGCGARGGNGGNGTNTG-3′)和CP004(5′-GCCTCGCACTCRTCNACRTCNACRC与来源于巨型艾美球虫的Houghton品系的基因组DNA一起使用，以扩增具有622bp期望大小的DNA片段。产生适当大小的DNA产物并通过凝胶纯化和测序证实它的同一性。
表5
在内含子-外显子分析中用于从cDNA和基因组DNA扩增基因特异性产物的寡聚核苷酸引物对。显示了扩增cDNA的区域和预测的产物大小。引物对 序列(5’-3’)扩增的cDNA 区(bp) cDNA产物大小(bp)
FP015 GCTGCACTCTATGGCGGAACAGGAATCG 273-1865 1593
RP033 GGCGCACTCGTCGATATCTTTGCATGC
FP021 GCATGCAAAGATATCGACGAGTGCGCC 1839-4554 2716
RP030 CTGCTGTGCACTCATCGATGTCAACG
FP026 CGTTGACATCGATGAGTGCACAGCAG 4529-6209 1681
RP015 GTTGCATTCGCTCCATGGGCCCCACTG
FP010 CAGTGGGGCCCATGGAGCGAATGCAAC 6183-7394 1212
RP023 GCCTGTTTCGCCTTCGCATCCTTCG
为了评估EmIP的保守程度，将来源于鸡中艾美球虫属寄生虫的所有7个物种的澳大利亚分离物的基因组DNA与简并引物CP003和CP004一起用于PCR扩增。在使用堆型艾美球虫，巨型艾美球虫，扁嘴艾美球虫和柔嫩艾美球虫DNA产生的样品中在0.8％琼脂糖凝胶上分离的PCR产物的EtBr染色仅显示微弱的适当大小的条带(结果未显示)。为了进一步研究PCR产物，通过DNA印迹将DNA转移至尼龙膜并与用引物CP003和CP004产生的Houghton品系，巨型艾美球虫的基因组DNA杂交。
如图42A所示，在高严谨洗涤和将膜曝露于X光片10分钟后，在堆型艾美球虫，巨型艾美球虫，扁嘴艾美球虫和柔嫩艾美球虫的样品中检测到适当大小的杂交带(分别是泳道2，4，6和8)。在30分钟曝光后(图42B)，在布氏艾美球虫，缓艾美球虫和早熟艾美球虫的PCR产物(分别是泳道3，5和7)中也检测到相似大小的单一杂交带。结果提供在遍及导致鸡球虫病的艾美球虫属的品系和物种中EmIP基因是高度保守的进一步的证据。
实施例6
重组56kDa(r56)和82kDa(r82)配子母细胞抗原，和250kDa(r250)鸡的无性繁殖阶段的抗原的免疫和攻击试验
免疫
动物
鸡：
-84日龄(～12周)澳洲黑小公鸡
-保持含药(robenidene)食物
-所有小鸡被单独标记和记录
抗原
在37℃下在0.1mg/ml氨苄青霉素0.01M Mg2+SOB中培养在pTRCHisb表达系统中的重组蛋白质，并用1Mm IPTG诱导4小时。将蛋白质在Ni-琼脂糖柱上纯化，浓缩，脱盐，并与稳定剂(3％乳糖，1％谷氨酸单钠)一起冻干。使用Bradford测定测量所有抗原使用的蛋白质浓度。将M.Wallach提供的亲和纯化的配子母细胞抗原(APGA)制剂用作试验的阳性对照。
组和剂量
-每组使用9只鸡；总共9组；总共使用81只鸡。
-以下列抗原只在鸡的一侧每只鸟用0.5ml抗原/弗氏不完全抗原(FIA)混合物(0.25ml抗原/0.25ml FIA)将鸡肌内免疫：
组1 仅PBS
组2 佐剂(FIA)/PBS
组3 APGA(2.5g)
组4 r250蛋白质(1.0g)
组5 r250蛋白质(10.0g)
组6 r56蛋白质(0.5g)
组7 r56蛋白质(5.0g)
组8 r82蛋白质(0.5g)
组9 r82蛋白质(5.0g)
免疫程序
免疫1： 第1周
免疫2： 第3周
放血： 第6周
放血： 第8周
放血/处死： 第9周
分析
-采(～1.5-2ml/鸟)，分离血清并通过ELISA和免疫印迹检验
结果
放血的结果在图43中显示。
攻击
动物和寄生虫
-使用来自基于第1次放血的ELISA的结果，具有最高抗体效价的每组的5只鸡(148日龄；～4.5个月)；在PBS和FIA对照的情形中，使用具有最低抗体效价的鸡
-巨型艾美球虫(品系Houghton)；
-在攻击前1周从饲料中去除robenidene
组
下列各组和鸡是取自如上所述的免疫试验，并用于攻击实验中
组1仅PBS 鸡号码2，3，4，6，8
组2佐剂(FIA)/PBS 鸡号码12-16
组3APGA(2.5g) 鸡号码20，22，23，25，27
组5r250蛋白质(10.0g) 鸡号码37，39，41，44，45
组7r56蛋白质(5.0g) 鸡号码57，59，60，61，63
组9r82蛋白质(5.0g) 鸡号码74，75，76，79，80
攻击程序
去除Robenidene
第6天每只鸟用100个形成孢子的卵囊攻击
卵囊收获和计数程序
感染后第0天
感染后第1天
感染后第2天
感染后第3天
感染后第4天
检查另一物种污染的卵囊排出量
替换塑料片开始收集。
感染后第5天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第6天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第7天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第8天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第9天收集粪便，并将卵囊计数
感染后第10天收集粪便，并将卵囊计数
表6免疫和攻击试验I 组/天p.i. 累积的卵囊数(×106) 6 7 8 9 10 输出(％) 6 7 8 9 10 ％抑制 6 7 8 9 10 1.仅PBS 6.67 17.00 26.40 27.33 27.43 100 100 100 100 100 0 0 0 0 0 2.仅FIA 3.20 14.40 17.30 17.50 17.50 48 (100) 85 (100) 66 (100) 64 (100) 64 (100) 52 (0) 15 (0) 34 (0) 36 (0) 36 (0) 3.APGA (2.5μg) 2.77 9.35 13.48 13.58 13.61 42 (87) 55 (65) 51 (78) 50 (78) 50 (78) 58 (13) 45 (35) 49 (22) 50 (22) 50 (22) 5.r250 (10μg) 0.83 8.35 13.72 14.72 14.72 12 (26) 49 (58) 52 (79) 54 (84) 54 (84) 88 (74) 51 (42) 48 (21) 46 (16) 46 (16) 7.r56 (5μg) 0.33 4.53 7.20 8.16 8.53 5 (10) 27 (32) 27 (42) 30 (47) 31 (49) 95 (90) 73 (68) 73 (58) 70 (53) 69 (51) 9.r82 (5μg) 4.23 10.33 14.73 14.93 15.06 63 (132) 61 (72) 56 (85) 55 (85) 55 (86) 37 (0) 39 (28) 44 (15) 45 (15) 45 (14)
实施例7
250kDa无性繁殖阶段蛋白质的重组片段的表达
选择编码预测的跨膜结构域/胞质尾区和上游亲水结构域的250kDa蛋白质的区域用于表达研究(图44)。选择该区域是因为许多原因，如下所述：1)在许多顶复门的微丝蛋白质中已经鉴定了类似的3′亲水尾部区域并似乎对于该蛋白家族是独特的；2)在其它微丝蛋白质中该区域也被鉴定为免疫显性，主要是柔嫩艾美球虫微丝蛋白质1(EtMIC1)和表面抗原5401(EtMIC4)；3)从柔嫩艾美球虫5401抗原(EtMIC4)中表达类似的区域并发现提供针对柔嫩艾美球虫攻击的显著保护(Danforth等，1988)；4)蛋白质的其它区域主要包括EGF样和TSP-1样的结构域。发现这些结构域类型在真核生物中高度保守，因此必须考虑它们诱导自身免疫的可能性。另外因为该结构域类型的普遍，它们似乎不太可能负责诱导强烈的免疫应答。
设计PCR引物EP006(5′-TTGGATCCCGAATTGCACCCCATTCC-3′)和EP007(5′-TTGAATTCTGAATGTCGCCGCTGTCG-3′)以从编码250kDa蛋白质的cDNA克隆扩增选择的DNA区域。引物结合BamHI(EP006)和EcoRI(EP007)限制酶切位点以促进克隆于选择的表达载体中。将使用该引物随后产生的PCR产物凝胶纯化并通过测序证实它的同一性。
选择细菌表达载体pTrcHisB(Invitrogen)用于表达研究。用限制酶BamHI和EcoRI消化质粒载体DNA和凝胶纯化的cDNA插入片段，将消化的DNA片段凝胶纯化和连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5α中并接着铺平板和温育，选择产生的克隆，培养并用于质粒制备。通过DNA测序证实选择的重组体的同一性。
为表达作准备，将包含表达构建体的质粒DNA转化到大肠杆菌宿主表达菌株TOP10中。在铺平板和温育后，选择单个细菌克隆并用于建立LB培养基的O/N培养物。还建立仅有载体的阴性对照培养物。然后将每个培养物的等分试样转移至新鲜的LB培养基，并温育直至细胞到达对数中期，在该阶段加入1mM IPTG诱导阶段表达。在诱导后0，1，2，5和24小时从表达培养物和阴性对照培养物中取样，并离心将细菌细胞沉淀。然后将所有沉淀重悬浮在TE缓冲液中，超声处理并离心以将水溶性级分(上清液)从不溶性级分(沉淀)中分离。在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上分析所有级分并随后用考马斯亮蓝染色。当与阴性对照样品相比时，在可溶性级分中检测到过量表达的蛋白质，其迁移至刚好在45kDa标记之下。
使用抗体的可溶性级分的Western分析检测到相同表观分子量的蛋白质条带，所述抗体是与pTrcHis表达产物的6x组氨酸标记反应性的。表达蛋白质的预测大小大约是30kDa，稍微小于在SDS-PAGE凝胶上所观察到的。大小差异可能通过在表达蛋白质中高频率的脯氨酸残基来解释，已知其导致蛋白质以明显高的分子量迁移。
为免疫原性试验作准备，对制造厂商的推荐方案较小修改，使用Ni-NTA琼脂糖带镍(nickel-charged)树脂(QIAGEN)纯化表达的蛋白质。包含6×His标记的表达蛋白质与树脂结合并被洗脱缓冲液中增大浓度的咪唑替换。简短地，将细胞沉淀重悬浮在包含1mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)中。在冰上将悬浮液超声处理并离心沉淀不溶性物质。然后将包含可溶性的表达蛋白质的上清液与Ni-NTA树脂混合并加至一次性洗脱柱。使淤浆沉降然后用洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗涤，之后用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱。通过还原的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱级分的纯度。
免疫原性的细节是关于56kDa和82kDa试验的。对于小鼠试验，每只小鼠使用0.5μg和5μg剂量的重组蛋白质(6只鼠/组)。对于鸡试验，每只鸟使用1μg和10μg剂量(9只鸟/组)。对于从小鼠和鸡试验中收集的血清样品的ELISA结果分别在图45和46中表示。
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