一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410650564.X	申请日：	2014.11.14
公开号：	CN104450890A	公开日：	2015.03.25
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20150325\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
发明人：	曹哲明
地址：	214081江苏省无锡市山水东路9号
优先权：
专利代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司11002	代理人：	王文君
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明提供了一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，具体为：1)利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组；2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位基因是否同时存在甲基化和去甲基化。

权利要求书

权利要求书
1.  一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
1)设置酶切组和对照组：
以限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA作为酶切组；
以未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA作为对照组；
2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；
3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位基因是否同时存在甲基化和去甲基化。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态具体为：
对照组和酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；
对照组有扩增产物，而酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域扩增的正向引物和反向引物如SEQ ID No.1～SEQ ID No.14所示。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)扩增反应的程序为：94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。

5.  根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中人工接头的核苷酸序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增的引物如SEQ ID No.17～SEQ ID No.21所示。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增分为两步：
第一步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl模板，2.5μl10×PCRbuffer，10pmol第一步扩增引物，1.5μl dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl；
第二步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl第一步PCR产物，2.5μl10×PCR buffer，10pmol第二步扩增引物，1.5μl dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl。

8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于，第一步扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。

9.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于，第二步扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，66℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。

10.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一步扩增引物为SEQ ID No.17及该区域正向引物，各5pmol；所述第二步扩增引物为SEQ ID No.18～SEQ ID No.21中的一条及该区域正向引物，各5pmol。

说明书

说明书一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法
技术领域
本发明涉及基因甲基化检测，具体地说，涉及一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法。
背景技术
黄鳝广泛分布于中国、美洲和大洋洲等国家和地区，是我国重要的淡水经济鱼类。黄鳝是一种具有天然单向性逆转特性的动物，自幼体到第一次性成熟为雌体，产卵后变为雌雄间体并最终变为雄体，所以该物种被鱼类育种学家当作性别决定机制研究的重要材料。芳香化酶是细胞色素P450家族中重要的一员，可催化某些雄激素(如睾酮和雄烯二酮)转化为雌激素(雌酮和雌二醇)，是体内合成雌激素的重要酶。所以芳香化酶P450基因一直是作为黄鳝相关研究的目标基因。
DNA甲基化是核酸的一种重要的修饰。DNA甲基化能关闭基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达，从而控制基因表达，因此与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，广泛分布于真核生物的基因组中。最新关于人类基因组甲基化研究表明大部分细胞表现出稳定的甲基化模式，70–80％的CpG处于甲基化状态。他们认为尽管理论上每个CpG可以改变它们的甲基化状态，但是他们认为只有部分CpG具有调控功能，可以改变甲基化状态。M.Kulis等认为尽管DNA甲基化和基因表达关联性不高，但是他们确信基因内部CpG二核甘酸的甲基化和去甲基化和表达是相关联的。
芳香化酶P450基因在黄鳝中发现有两种类型：性腺型芳香化酶P450和脑型芳香化酶P450。俞菊华等从新鲜的卵巢中分离出黄鳝性腺型芳香化酶P450，并指出该基因也可在脑中表达(俞菊华等，黄鳝P-450芳香化酶基因的克隆及序列分析，水生生物学报，2005，29(5)：550-556)。李伟等分离了黄鳝脑型芳香化酶P450，发现该基因较高的表达于脑和精巢中，较低的在皮肤中表达，而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达(李伟等，黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析，水产科学，2009，8：458-461)。
但是，在黄鳝芳香化酶P450基因甲基化状态的研究中，黄鳝二倍体芳香化酶P450基因的两个等位基因存在三种情况：两个都去甲基化；两个都甲基化；一个去甲基化一个甲基化。然而，现有的MSRE-PCR技术可以分辨前两种情况，还无法鉴定一个去甲基化一个甲基化的情况。因此，目前还无法检测不同黄鳝组织的芳香化酶P450基因内部不同区域的是否处于甲基化状态，若存在甲基化，也无法检测这些甲基化区域是否处于杂合状态。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，所述方法包括如下具体步骤：
1)设置酶切组和对照组：
利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；
未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组；
2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；初步分辨出纯合的去甲基化区域与纯合/杂合的甲基化区域；
3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位基因是否同时存在甲基化和去甲基化。凡是有扩增产物的就是存在去甲基化的隐性基因，没有扩增产物就是甲基化纯合区域。
进一步地，所述步骤2)具体为：设计黄鳝针对芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，分别对未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切酶处理的酶切组的基因组DNA进行不同区域的分段扩增，通过分析二者扩增结果，初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态：
未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切酶处理的酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；
未经限制性内切酶处理的对照组有扩增产物，而经限制性内切酶处理的酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。
更进一步地，所述步骤2)中针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物如SEQ ID No.1～SEQ ID No.14所示。
进一步地，所述步骤2)扩增反应的程序为：94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。
进一步地，所述步骤3)中人工接头的核苷酸序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示。
进一步地，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增的引物如SEQ ID No.17～SEQ ID No.21所示。
进一步地，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增分为两步：
第一步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl模板，2.5μl10×PCR buffer，10pmol第一步扩增引物，1.5μl dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl；
第二步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl第一步PCR产物，2.5 μl10×PCR buffer，10pmol第二步扩增引物，1.5μl dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl。
第一步扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。
第二步扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，66℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。
所述第一步扩增引物为SEQ ID No.17及该区域正向引物，各5pmol；所述第二步扩增引物为SEQ ID No.18～SEQ ID No.21中的一条及该区域正向引物，各5pmol。
本发明的有益效果在于：
本发明解决了黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态检测的问题，该方法可以成功检测不同黄鳝组织的芳香化酶P450基因内部不同区域的是否处于甲基化状态，同时检测这些甲基化区域是否处于杂合状态。该方法的优点是仅通过几对引物就可以简单检测黄鳝芳香化酶P450基因甲基化状态，尤其是甲基化杂合状态检测技术发现了黄鳝两个芳香化酶P450基因大部分处于杂合状态。
附图说明
图1为本发明实施例1中性腺型芳香化酶P450基因区域3的甲基化扩增图；
其中，Aa：肝；Bb：卵巢；Cc：血液；Dd：肾；Ee：精巢；大写表示酶切组，小写是对照组。
图2为本发明实施例1中芳香化酶P450表观等位基因扩增结果；
其中，M：marker，L：肝，K：肾，左图是性腺型型芳香化酶P450区域3的第二步扩增结果，右图是性腺型芳香化酶P450区域1的第二步扩结果；从左到右分别是第二步扩增引物G，C，T，A。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组。
利用表1中所述扩增引物对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；同时设计人工接头和HpaII处理的基因组DNA连接，根据接头序列设计合适引物进行扩增，验证这些甲基化区域是否同时存在甲基化和去甲基化并存(半甲基化)。
具体步骤如下：
第一步：两种芳香化酶P450的去甲基化和甲基化分辨
表1脑型和性腺型芳香化酶P450基因不同区域扩增引物

酶切体系为20μL(Temple，10μL；10×HpaII Buffer，2μL；HpaII，2μL，ddH2O，6μL)将，于37℃环境中酶切4h。扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl模板，2.5μl10×PCR buffer，5pmol正向引物，5pmol反向引物，1.5μl dNTPs(2.5mmol)，2U taq DNA聚合酶，加水至 25μl。扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。在1.0％的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。
由于各区域没有明显差异，且后续实验步骤原理相同，因此以性腺型芳香化酶P450区域3为例，进行说明。性腺型芳香化酶P450区域3的扩增结果见图1。
芳香化酶P450基因甲基化的初步分辨方法为：
未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切酶处理的酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；
未经限制性内切酶处理的对照组有扩增产物，而经限制性内切酶处理的酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。
从图1可以看出，血液和肾脏酶切组没有扩增结果而对照组有扩增结果，说明区域3在血液和肾脏处于去甲基化状态。其余组织两组都有扩增结果，处于甲基化状态。
第二步：两种芳香化酶P450的甲基化杂合还是纯合分辨
从理论上来说一个二倍体如果同时存在甲基化和去甲基化的表观等位基因，通过酶切，扩增肯定能检测出甲基化的片段，所以我们不知道上述检测到甲基化阳性的样品是否同时存在去甲基化等位基因。为了对甲基化阳性的样品进行深入研究，探讨这些样品是否存在去甲基化的等位基因。设计一个人工接头和HpaII酶切过的基因组片段连接，同时根据接头序列设计了一个第一步扩增引物，由于CCGG下游存在四个可能的碱基，我们设计第二步扩增引物(第一步扩增引物向下延生cgg加一个选择性碱基)，对加接头的样品进行两步扩增，并对扩增结果进行了测序分析。
其中，所述酶切片段通过以下步骤得到：HpaII酶切基因组DNA4个小时，然后95℃处理10分钟，然后用2倍体积乙醇沉淀，12000转5分钟，弃上清液，然后吹干乙醇，再用双蒸水溶解。
由于黄鳝是二倍体，为了研究上一步证明有甲基化的区域是否存在去甲基化的隐性基因，我们设计了如下方法：
将总体积20μl的酶切产物加50μl 100％乙醇沉淀，12000转离心10分钟，弃去上清，室温吹干乙醇。加入双蒸水14μl，10x的T4连接酶切缓冲液2μl，T4连接酶2μl，接头序列2μl(50mm的接头)，混匀，16℃保温4小时。(接头序列：5-cgagtcggctggctcctcaattgtatc-3；5-tcagccgaccgaggagttaacatag-3)
第一步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl模板，2.5μl10×PCR buffer，10pmol第一步扩增引物(caattgaggagccagccgact和正向引物各5pmol)，1.5μl dNTPs(2.5mmol)，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl。扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。
第二步扩增反应总体积为25μl，包括1.0μl第一步PCR产物，2.5μl10×PCR buffer，10pmol第二步扩增引物(四个引物(ttgaggagccagccgactcggt；ttgaggagccagccgactcgga；ttgaggagccagccgactcggc；ttgaggagccagccgactcggg)中的一个加正向引物各5pmol)，1.5μl dNTPs(2.5mmol)，2U taqDNA聚合酶，加水至25μl。扩增反应的程序为：首先进行94℃变性2min；然后94℃变性30s，66℃复性45s，72℃延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。在1.0％的琼脂糖凝胶上检测扩增产物(见图2)。凡是有扩增产物的就是存在去甲基化的隐性基因，没有扩增产物就是甲基化纯合区域。
由图2可知，区域1扩增结果发现只有很弱一些扩增条带片段大小也不正确。区域3扩增结果发现第二步引物(选择性碱基是G)有明显扩增条带，由于肾在上面的试验中证明了是处于去甲基化状态的，而肝处于甲基化状态，它们同时扩出一个大小相同的亮带。我们为了验证扩增结果是不是芳香化酶P450片段，对该扩增条带进行了克隆测序，结果也证实是芳香化酶P450的酶切片段。选择性碱基是A的引物也有一个扩增片段可能是由于G和A都是嘌呤，发生了小概率错误配对产生扩增。
通过上述方法分析了黄鳝血、肝、肾、肌肉、卵巢、精巢和退化卵巢的芳香化酶的甲基化状态，见表2。从表2中看出两种芳香化酶P450的大部分CCGG区域是处于甲基化状态。
表2两种芳香化酶P450的甲基化分析结果

进一步地，通过上述方法对于这些区域是否处于甲基化杂合状态再进行研究，结果见表3。
表3两种类型芳香化酶的表观等位基因扩增结果

其中：+表示有扩增结果，—表示没有扩增结果，空白是去甲基化的区域。从表3中看出大部分在血液中存在去甲基化的区域在其他组织都存在去甲基化的等位基因，大部分在血液中处于甲基化的区域没有找到去甲基化的等位基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

资源描述

《一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410650564.X(22)申请日 2014.11.14C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人中国水产科学研究院淡水渔业研究中心地址 214081 江苏省无锡市山水东路9号(72)发明人曹哲明(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人王文君(54) 发明名称一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法(57) 摘要本发明提供了一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，具体为：1)利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；未经限制性。

2、内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组；2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位基因是否同时存在甲基化和去甲基化。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表5页附图1页(10)申请公布号 CN 104450890 A(43)申请公布日 2015.0。

3、3.25CN 104450890 A1/1页21.一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：1)设置酶切组和对照组：以限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA作为酶切组；以未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA作为对照组；2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位。

4、基因是否同时存在甲基化和去甲基化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态具体为：对照组和酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；对照组有扩增产物，而酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域扩增的正向引物和反向引物如SEQ ID No.1SEQ ID No.14所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)扩增反应的程序为：94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min，反应进行35个。

5、循环，最后72延伸10min。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中人工接头的核苷酸序列如SEQ ID No.15SEQ ID No.16所示。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增的引物如SEQ ID No.17SEQ ID No.21所示。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增分为两步：第一步扩增反应总体积为25l，包括1.0l模板，2.5l10PCRbuffer，10pmol第一步扩增引物，1.5l dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25l；第二步扩增反应总体积为25l，包括1.0l第。

6、一步PCR产物，2.5l10PCR buffer，10pmol第二步扩增引物，1.5l dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25l。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，第一步扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，第二步扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，66复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一步扩增引物为。

7、SEQ ID No.17及该区域正向引物，各5pmol；所述第二步扩增引物为SEQ ID No.18SEQ ID No.21中的一条及该区域正向引物，各5pmol。权利要求书CN 104450890 A1/7页3一种检测黄鳝芳香化酶 P450 基因等位基因甲基化状态的方法技术领域0001 本发明涉及基因甲基化检测，具体地说，涉及一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法。背景技术0002 黄鳝广泛分布于中国、美洲和大洋洲等国家和地区，是我国重要的淡水经济鱼类。黄鳝是一种具有天然单向性逆转特性的动物，自幼体到第一次性成熟为雌体，产卵后变为雌雄间体并最终变为雄体，所以该物种被。

8、鱼类育种学家当作性别决定机制研究的重要材料。芳香化酶是细胞色素P450家族中重要的一员，可催化某些雄激素(如睾酮和雄烯二酮)转化为雌激素(雌酮和雌二醇)，是体内合成雌激素的重要酶。所以芳香化酶P450基因一直是作为黄鳝相关研究的目标基因。0003 DNA甲基化是核酸的一种重要的修饰。DNA甲基化能关闭基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达，从而控制基因表达，因此与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，广泛分布于真核生物的基因组中。最新关于人类基因组甲基化研究表明大部分细胞表现出稳定的甲基化模式，7080。

9、的CpG处于甲基化状态。他们认为尽管理论上每个CpG可以改变它们的甲基化状态，但是他们认为只有部分CpG具有调控功能，可以改变甲基化状态。M.Kulis等认为尽管DNA甲基化和基因表达关联性不高，但是他们确信基因内部CpG二核甘酸的甲基化和去甲基化和表达是相关联的。0004 芳香化酶P450基因在黄鳝中发现有两种类型：性腺型芳香化酶P450和脑型芳香化酶P450。俞菊华等从新鲜的卵巢中分离出黄鳝性腺型芳香化酶P450，并指出该基因也可在脑中表达(俞菊华等，黄鳝P-450芳香化酶基因的克隆及序列分析，水生生物学报，2005，29(5)：550-556)。李伟等分离了黄鳝脑型芳香化酶P450，发现。

10、该基因较高的表达于脑和精巢中，较低的在皮肤中表达，而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达(李伟等，黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析，水产科学，2009，8：458-461)。0005 但是，在黄鳝芳香化酶P450基因甲基化状态的研究中，黄鳝二倍体芳香化酶P450基因的两个等位基因存在三种情况：两个都去甲基化；两个都甲基化；一个去甲基化一个甲基化。然而，现有的MSRE-PCR技术可以分辨前两种情况，还无法鉴定一个去甲基化一个甲基化的情况。因此，目前还无法检测不同黄鳝组织的芳香化酶P450基因内部不同区域的是否处于甲基化状态，若存在甲基化，也无法检测这些甲基化。

11、区域是否处于杂合状态。发明内容0006 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法。说明书CN 104450890 A2/7页40007 为了实现本发明目的，本发明提供一种检测黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态的方法，所述方法包括如下具体步骤：0008 1)设置酶切组和对照组：0009 利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；0010 未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组；0011 2)设计针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，对酶切组和对照组分别。

12、进行不同区域的扩增，根据两组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；初步分辨出纯合的去甲基化区域与纯合/杂合的甲基化区域；0012 3)设计人工接头和步骤2)中甲基化阳性的酶切组的酶切片段连接，根据接头序列设计引物对甲基化区域进行扩增，检测步骤2)中初步分辨出的甲基化区域的等位基因是否同时存在甲基化和去甲基化。凡是有扩增产物的就是存在去甲基化的隐性基因，没有扩增产物就是甲基化纯合区域。0013 进一步地，所述步骤2)具体为：设计黄鳝针对芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物，分别对未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切酶处理的酶切组的基因组DNA进行不同区域的分段扩增，。

13、通过分析二者扩增结果，初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态：0014 未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切酶处理的酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；0015 未经限制性内切酶处理的对照组有扩增产物，而经限制性内切酶处理的酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。0016 更进一步地，所述步骤2)中针对黄鳝芳香化酶P450基因不同区域的扩增引物如SEQ ID No.1SEQ ID No.14所示。0017 进一步地，所述步骤2)扩增反应的程序为：94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min，反应进行35个循环，最后72延伸10min。0018 进一。

14、步地，所述步骤3)中人工接头的核苷酸序列如SEQ ID No.15SEQ ID No.16所示。0019 进一步地，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增的引物如SEQ ID No.17SEQ ID No.21所示。0020 进一步地，所述步骤3)中对甲基化区域进行扩增分为两步：0021 第一步扩增反应总体积为25l，包括1.0l模板，2.5l10PCR buffer，10pmol第一步扩增引物，1.5l dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25l；0022 第二步扩增反应总体积为25l，包括1.0l第一步PCR产物，2.5l10PCR buffer，10pmol第二步扩增引物，1.5l 。

15、dNTPs，2U taqDNA聚合酶，加水至25l。0023 第一步扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。0024 第二步扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，66复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。0025 所述第一步扩增引物为SEQ ID No.17及该区域正向引物，各5pmol；所述第二步说明书CN 104450890 A3/7页5扩增引物为SEQ ID No.18SEQ ID No.21中的一条及该区。

16、域正向引物，各5pmol。0026 本发明的有益效果在于：0027 本发明解决了黄鳝芳香化酶P450基因等位基因甲基化状态检测的问题，该方法可以成功检测不同黄鳝组织的芳香化酶P450基因内部不同区域的是否处于甲基化状态，同时检测这些甲基化区域是否处于杂合状态。该方法的优点是仅通过几对引物就可以简单检测黄鳝芳香化酶P450基因甲基化状态，尤其是甲基化杂合状态检测技术发现了黄鳝两个芳香化酶P450基因大部分处于杂合状态。附图说明0028 图1为本发明实施例1中性腺型芳香化酶P450基因区域3的甲基化扩增图；0029 其中，Aa：肝；Bb：卵巢；Cc：血液；Dd：肾；Ee：精巢；大写表示酶切组，小写。

17、是对照组。0030 图2为本发明实施例1中芳香化酶P450表观等位基因扩增结果；0031 其中，M：marker，L：肝，K：肾，左图是性腺型型芳香化酶P450区域3的第二步扩增结果，右图是性腺型芳香化酶P450区域1的第二步扩结果；从左到右分别是第二步扩增引物G，C，T，A。具体实施方式0032 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0033 实施例10034 利用对甲基化比较敏感的限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为酶切组；未经限制性内切酶HpaII处理的黄鳝基因组DNA，作为对照组。0035 利用表1中所述扩增引物对酶切组和对照组分别进行不同区域的扩增，根据两。

18、组扩增结果初步分辨芳香化酶P450基因的不同区域的甲基化状态；同时设计人工接头和HpaII处理的基因组DNA连接，根据接头序列设计合适引物进行扩增，验证这些甲基化区域是否同时存在甲基化和去甲基化并存(半甲基化)。0036 具体步骤如下：0037 第一步：两种芳香化酶P450的去甲基化和甲基化分辨0038 表1脑型和性腺型芳香化酶P450基因不同区域扩增引物0039 说明书CN 104450890 A4/7页60040 酶切体系为20L(Temple，10L；10HpaII Buffer，2L；HpaII，2L，ddH2O，6L)将，于37环境中酶切4h。扩增反应总体积为25l，包括1.0l。

19、模板，2.5l10PCR buffer，5pmol正向引物，5pmol反向引物，1.5l dNTPs(2.5mmol)，2U taq DNA聚合酶，加水至25l。扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min，反应进行35个循环，最后72延伸10min。在1.0的琼脂糖凝胶上检测扩增产物。0041 由于各区域没有明显差异，且后续实验步骤原理相同，因此以性腺型芳香化酶P450区域3为例，进行说明。性腺型芳香化酶P450区域3的扩增结果见图1。0042 芳香化酶P450基因甲基化的初步分辨方法为：0043 未经限制性内切酶处理的对照组和经限制性内切。

20、酶处理的酶切组都有扩增产物的区域为甲基化区域；0044 未经限制性内切酶处理的对照组有扩增产物，而经限制性内切酶处理的酶切组没有扩增产物的区域为去甲基化区域。0045 从图1可以看出，血液和肾脏酶切组没有扩增结果而对照组有扩增结果，说明区域3在血液和肾脏处于去甲基化状态。其余组织两组都有扩增结果，处于甲基化状态。0046 第二步：两种芳香化酶P450的甲基化杂合还是纯合分辨0047 从理论上来说一个二倍体如果同时存在甲基化和去甲基化的表观等位基因，通过酶切，扩增肯定能检测出甲基化的片段，所以我们不知道上述检测到甲基化阳性的样品是否同时存在去甲基化等位基因。为了对甲基化阳性的样品进行深入研究，探。

21、讨这些样品是否存在去甲基化的等位基因。设计一个人工接头和HpaII酶切过的基因组片段连接，同时根据接头序列设计了一个第一步扩增引物，由于CCGG下游存在四个可能的碱基，我们设计第二步扩增引物(第一步扩增引物向下延生cgg加一个选择性碱基)，对加接头的样品进行两步扩增，并对扩增结果进行了测序分析。0048 其中，所述酶切片段通过以下步骤得到：HpaII酶切基因组DNA4个小时，然后95处理10分钟，然后用2倍体积乙醇沉淀，12000转5分钟，弃上清液，然后吹干乙醇，再用双蒸水溶解。说明书CN 104450890 A5/7页70049 由于黄鳝是二倍体，为了研究上一步证明有甲基化的区域是否存在。

22、去甲基化的隐性基因，我们设计了如下方法：0050 将总体积20l的酶切产物加50l 100乙醇沉淀，12000转离心10分钟，弃去上清，室温吹干乙醇。加入双蒸水14l，10x的T4连接酶切缓冲液2l，T4连接酶2l，接头序列2l(50mm的接头)，混匀，16保温4小时。(接头序列：5-cgagtcggctggctcctcaattgtatc-3；5-tcagccgaccgaggagttaacatag-3)0051 第一步扩增反应总体积为25l，包括1.0l模板，2.5l10PCR buffer，10pmol第一步扩增引物(caattgaggagccagccgact和正向引物各5pmol)，1.5。

23、l dNTPs(2.5mmol)，2U taqDNA聚合酶，加水至25l。扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，58复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。0052 第二步扩增反应总体积为25l，包括1.0l第一步PCR产物，2.5l10PCR buffer，10pmol第二步扩增引物(四个引物(ttgaggagccagccgactcggt；ttgaggagccagccgactcgga；ttgaggagccagccgactcggc；ttgaggagccagccgactcggg)中的一个加正向引物各5pmol)，1.5l dNT。

24、Ps(2.5mmol)，2U taqDNA聚合酶，加水至25l。扩增反应的程序为：首先进行94变性2min；然后94变性30s，66复性45s，72延伸1min 30s，反应进行35个循环，最后72延伸10min。在1.0的琼脂糖凝胶上检测扩增产物(见图2)。凡是有扩增产物的就是存在去甲基化的隐性基因，没有扩增产物就是甲基化纯合区域。0053 由图2可知，区域1扩增结果发现只有很弱一些扩增条带片段大小也不正确。区域3扩增结果发现第二步引物(选择性碱基是G)有明显扩增条带，由于肾在上面的试验中证明了是处于去甲基化状态的，而肝处于甲基化状态，它们同时扩出一个大小相同的亮带。我们为了验证扩增结果是不。

25、是芳香化酶P450片段，对该扩增条带进行了克隆测序，结果也证实是芳香化酶P450的酶切片段。选择性碱基是A的引物也有一个扩增片段可能是由于G和A都是嘌呤，发生了小概率错误配对产生扩增。0054 通过上述方法分析了黄鳝血、肝、肾、肌肉、卵巢、精巢和退化卵巢的芳香化酶的甲基化状态，见表2。从表2中看出两种芳香化酶P450的大部分CCGG区域是处于甲基化状态。0055 表2两种芳香化酶P450的甲基化分析结果0056 说明书CN 104450890 A6/7页80057 进一步地，通过上述方法对于这些区域是否处于甲基化杂合状态再进行研究，结果见表3。0058 表3两种类型芳香化酶的表观等位基因扩。

26、增结果0059 0060 0061 其中：+表示有扩增结果，表示没有扩增结果，空白是去甲基化的区域。从表3中看出大部分在血液中存在去甲基化的区域在其他组织都存在去甲基化的等位基因，大部说明书CN 104450890 A7/7页9分在血液中处于甲基化的区域没有找到去甲基化的等位基因。0062 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN 104450890 A1/5页100001 0002 序列表CN 104450890 A10。

展开阅读全文