提高鸡精液品质方法及其引物、试剂盒及其使用方法.pdf

一种鸡精液品质密切相关基因用引物，包括血管活性肠肽受体1（VIPR1）基因PCR扩增的上下游引物混合物、血管活性肠肽受体2（VIPR2）基因PCR扩增的上下游引物混合物、多巴胺受体2 （DAR2）基因PCR扩增的上下游引物混合物。提高鸡精液品质的方法：在育种筛选时，提取待测样本的鸡基因组DNA，基因序列经特异性引物扩增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择选择TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体。试剂盒包括VIPR1、VIP2和DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物，PCR所需试剂。试剂盒使用方法：PCR扩增SNP位点所在片段；PCR-SSCP检测；SSCP分析。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。

权利要求书
1.   鸡精液品质密切相关基因用引物，包括血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物、血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物、多巴胺受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物；
所述血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物中上游引物序列：5’- gctcccgcagatatatggaa -3’；下游引物序列 ：5’-tgggaggagacaaaacaaca-3’；
所述血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物的上游引物序列： 5’-gtgttcacttttgggcacct-3’；下游引物序列 ：R:5’-cagccaaaaacattggtgtg -3’ ；
所述多巴胺受体2DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列：5’-gttggggagtggaggttcag-3’；下游引物序列 ：5’-attgggctggagatggcaaa -3’。

2.   利用复合基因型提高鸡精液品质的方法，其特征是，提取待测样本的鸡基因组DNA，待测样本的鸡基因组DNA基因序列经权利要求1所述的鸡精液品质密切相关基因用引物进行PCR扩增SNP位点所在片段，扩增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段进行PCR-SSCP检测后，凝胶电泳后用银染显色，分别得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体，即在73352、36127、201和208处分别为T、G、T和A/G等位基因的个体。

3.   根据权利要求2所述的利用复合基因型提高鸡精液品质的方法，其特征是，所述PCR扩增SNP位点所在片段的反应体系20 μL：在PCR反应管中加入血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物或血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物或多巴胺受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物2.0 μL、PCR反应试剂3μL、50 ng/μL DNA模板1.0 μL，加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心。

4.   根据权利要求2所述的利用复合基因型提高鸡精液品质的方法，其特征是，所述PCR扩增的反应条件为先94℃ 变性5min；再经过35个循环，每个循环包括94℃30s、60℃ 15s、72℃ 30s；然后72℃ 延伸10 min、最后4℃保存。

5.   根据权利要求2所述的利用复合基因型提高鸡精液品质的方法，其特征是，所述PCR-SSCP检测包括：2 μL PCR 扩增产物加入 7 μL 上样缓冲液，98 ℃变性 10 min，然后冰浴 5 min；3 对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为 10 %，凝胶交联度为 29：1，电压都为 150V，过夜电泳。

6.   一种鸡精液品质三基因联合效应诊断试剂盒，包括盒体（1）和盒体内的衬垫（2），其特征是，所述衬垫（2）的孔腔内设有权利要求1所述的血管活性肠肽受体1 VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物P（3）、所述血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物P（4）、所述多巴胺受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物P（5）以及PCR反应试剂（6）、超纯水（7）、上样缓冲液（8）；所述PCR反应试剂（6）为10×buffer、dNTP 和Taq酶的混合物。

7.   鸡精液品质三基因联合效应诊断试剂盒的使用方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）PCR扩增SNP位点所在片段：采用20 μL反应体系：在PCR反应管中加入血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物或血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物或多巴胺受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物2.0 μL、PCR反应试剂3μL、50 ng/μL DNA模板1.0 μL，加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心；所述PCR反应试剂（6）为10×buffer、dNTP 和Taq酶的混合物；
（2）将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增：先94℃ 变性5min；再经过35个循环，每个循环包括94℃30s、60℃ 15s、72℃ 30s；然后72℃ 延伸10 min、最后4℃保存；
（3）PCR-SSCP检测: 2 μL PCR 扩增产物加入 7 μL 上样缓冲液，98 ℃变性 10 min，然后冰浴 5 min；3 对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为 10 %，凝胶交联度为 29：1，电压都为 150V，过夜电泳；
（4）目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择VIPR1、VIPR2和DAR2基因的基因型分别为TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体，即在73352、36127、201和208处分别为T、G、T和A/G等位基因的个体。

说明书提高鸡精液品质方法及其引物、试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及优质鸡精液品质密切相关基因诊断试剂盒及其使用方法，属于分子生物学技 术领域，应用于公鸡的早期筛选。
背景技术
人类对家禽生产性状从无意识到有意识选择已经历几千年的历史，而从表型选择到遗传 基础的研究和基因型选择这一过程仅是近几十年的事情。优秀的种公鸡是提高经济效益的关 键之一，一方面可降低生产成本，特别是种鸡的饲养成本。采取人工授精可使鸡的配种比例 提高3倍左右，可以减少3/4的种公鸡，这可以较大的降低成本，另一方面可大大提高优秀 种公鸡的利用率，提高生产效率和产品品质。当前对公鸡的选择依然采用常规选择，虽然常 规育种方法在家禽遗传改良中取得一定进展，但它对数量性状的选择要在个体生长发育到一 定时期，育种周期长，费用高。优质鸡精液品质性状为数量性状，仅以个体或亲属表型值进 行个体选择结果不十分可靠，因此，需要遗传标记进行辅助选择。随着人类基因组测序工作 的完成，SNP的筛选及检测正式成为研究者广泛关注的焦点。该技术具有特异性高、检测快 速、通用性强、适用范围广、成本低廉等特点，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾 病易感性分析与药物基因组学等的研究中发挥着越来越重要的作用。
经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有VIPR1、VIPR2和DAR2基因多态性 位点与鸡精液品质性状相关性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高鸡精液品质方法及其引物、试剂盒及其使用方法，本发明 方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。
本发明提供了一种鸡精液品质密切相关基因用引物，包括血管活性肠肽受体1(VIPR1) 基因PCR扩增的上下游引物混合物、血管活性肠肽受体2(VIPR2)基因PCR扩增的上下游 引物混合物、多巴胺受体2(DAR2)基因PCR扩增的上下游引物混合物；
所述血管活性肠肽受体1(VIPR1)基因PCR扩增的上下游引物混合物中上游引物序列：5’- gctcccgcagatatatggaa-3’；下游引物序列：5’-tgggaggagacaaaacaaca-3’；
所述血管活性肠肽受体2(VIPR2)基因PCR扩增的上下游引物混合物的上游引物序列： 5’-gtgttcacttttgggcacct-3’；下游引物序列：R:5’-cagccaaaaacattggtgtg-3’；
所述多巴胺受体2(DAR2)基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列： 5’-gttggggagtggaggttcag-3’；下游引物序列：5’-attgggctggagatggcaaa-3’。
本发明还提供了一种利用复合基因型提高鸡精液品质的方法，提取待测样本的鸡基因组 DNA，待测样本的鸡基因组DNA基因序列经权利要求1所述的鸡精液品质密切相关基因用 引物进行PCR扩增SNP位点所在片段，扩增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片 段先进行PCR-SSCP检测后，凝胶电泳后用银染显色，分别得到DNA的SSCP图谱，根据3 个图谱中的带型选择选择TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体，即在73352、36127、201和 208处分别为T、G、T和A/G等位基因的个体。
优选地，所述PCR扩增SNP位点所在片段的反应体系20μL：在PCR反应管中加入上 下游引物混合物2.0μL、PCR反应试剂3μL、50ng/μL DNA模板1.0μL，加超纯水至20μL， 充分混匀后短暂离心。
优选地，所述PCR扩增的反应条件为先94℃变性5min；再经过35个循环，每个循环 包括94℃30s、60℃15s、72℃30s；然后72℃延伸10min、最后4℃保存。
优选地，所述PCR-SSCP检测包括：2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃ 变性10min，然后冰浴5min；3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29： 1，电压都为150V，过夜电泳。
此外，本发明又提供了一种鸡精液品质三基因联合效应诊断试剂盒，包括盒体和盒体内 的衬垫，衬垫的孔腔内设有所述的血管活性肠肽受体1 VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混 合物P、血管活性肠肽受体2 VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物P、所述多巴胺受体 2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物P以及PCR反应试剂、超纯水、上样缓冲液；所 述PCR反应试剂为10×buffer、dNTP和Taq酶的混合物。
本发明进一步提供了鸡精液品质三基因联合效应诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)PCR扩增SNP位点所在片段：采用20μL反应体系：在PCR反应管中加入上 下游引物混合物2.0μL、PCR反应试剂3μL、50ng/μL DNA模板1.0μL，加超纯水至20μL， 充分混匀后短暂离心；
(2)将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增：先94℃变性5min；再经过35个循环， 每个循环包括94℃30s、60℃15s、72℃30s；然后72℃延伸10min、最后4℃保存。
(3)PCR-SSCP检测:2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min， 然后冰浴5min。3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29：1，电压都为 150V，过夜电泳；
(4)目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3 个图谱中的带型选择VIPR1、VIPR2和DAR2基因的基因型分别为TT/GG/OQ三基因复合基 因型的个体，即在73352、36127、201和208处分别为T、G、T和A/G等位基因的个体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，针对VIPR1、VIPR2和DAR2基因分别设计1对引物，VIPR1引物的扩增产物经 SSCP分析产生3种基因型(CC、CT和TT)，直接测序表明TT型与CC型相比在73352 bp 处发生了C→T突变；VIPR2引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型(AA、AG和GG)， GG型与AA型在36127 bp处发生了A→G突变；DAR2引物的扩增产物经SSCP分析产生 5种基因型(OO、OP、OQ、PP和PQ)，QQ型与OO型相比检测到在201处发生C→T突 变，PP型和OO型相比发现208处A→G突变。3个基因不同复合基因型与优质肉鸡鸡冠及 精液品质的相关分析表明，三个基因复合基因型TT/GG/OQ基因型组合的精液品质最好，精 液量显著高于TT/AA/PP、CC/AA/OO、CC/AA/OP和CT/AA/OO型个体(P<0.05)；精子密 度显著高于CT/AA/PP、CC/GG/OP、CC/AA/OO、CC/GG/OO和CT/AA/OO型个体(P<0.05)； 精子活力显著好于CT/AA/OO和CC/AA/OP型个体(P<0.05)；
第二，本发明利用血管活性肠肽受体1(VIPR1)、血管活性肠肽受体2(VIPR2)和多巴 胺受体2(DAR2)基因的复合基因型的检测提供一种准确性高、快速、价格低廉的基因分 型试剂盒。本发明试剂盒包括VIPR1、VIP2和DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物， PCR所需试剂。在育种筛选时，提取待测样本的鸡基因组DNA，基因序列经特异性引物扩增 得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到 DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择选择TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体。 本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。
附图说明
图1是VIPR1基因的SSCP图谱；图中1，2：CC型；3，4：CT型；5，6：TT型。
图2是VIPR1基因的测序图。
图3是VIPR2基因的SSCP图谱；图中2，3，5：AA型；4，6：GG型；1：AG型。
图4是VIPR-2基因的测序图；
图5是DAR2基因的SSCP图谱；图中1：QQ型；2：PP型；3：PQ型；4，5：OQ型；6， 8：OP型；7：OO型。
图6是DAR2基因的测序图。
具体实施方式
一种鸡精液品质密切相关基因用引物，包括血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的 上下游引物混合物、血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物、多巴胺 受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物。
血管活性肠肽受体1VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物中上游引物序列：5’- gctcccgcagatatatggaa-3’；下游引物序列：5’-tgggaggagacaaaacaaca-3’。
血管活性肠肽受体2VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物的上游引物序列： 5’-gtgttcacttttgggcacct-3’；下游引物序列：R:5’-cagccaaaaacattggtgtg-3’。
多巴胺受体2 DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列： 5’-gttggggagtggaggttcag-3’；下游引物序列：5’-attgggctggagatggcaaa-3’。
利用复合基因型提高鸡精液品质的方法：提取待测样本的鸡基因组DNA，待测样本的鸡 基因组DNA基因序列经权利要求1所述的鸡精液品质密切相关基因用引物进行PCR扩增 SNP位点所在片段，扩增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段进行PCR-SSCP检 测后，凝胶电泳后用银染显色，分别得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择选 择TT/GG/OQ三基因复合基因型的个体，即在73352、36127、201和208处分别为T、G、T 和A/G等位基因的个体。
PCR扩增SNP位点所在片段的反应体系20μL：在PCR反应管中加入上下游引物混合 物2.0μL(每个上下游引物混合物对应一个PCR反应管)、PCR反应试剂3μL、50ng/μL DNA 模板1.0μL，加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心。
PCR扩增的反应条件为先94℃变性5min；再经过35个循环，每个循环包括94℃30s、 60℃15s、72℃30s；然后72℃延伸10min、最后4℃保存。
PCR-SSCP检测包括：2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min， 然后冰浴5min；3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29：1，电压都为 150V，过夜电泳。
一种鸡精液品质三基因联合效应诊断试剂盒，包括盒体1，衬垫2，VIPR1引物混合物P 3，VIPR2引物混合物P 4，VAR2引物混合物P 5，PCR反应试剂6：10×buffer、dNTP和 Taq酶的混合物，超纯水7，上样缓冲液8。
VIPR1基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列5’-gctcccgcagatatatggaa-3’； 下游引物序列:5’-tgggaggagacaaaacaaca-3’。
VIPR2基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列：5’-gtgttcacttttgggcacct-3’；下 游引物序列:R:5’-cagccaaaaacattggtgtg-3’。
DAR2基因PCR扩增的上下游引物混合物，上游引物序列:5’-gttggggagtggaggttcag-3’； 下游引物序列:5’-attgggctggagatggcaaa-3’。
鸡精液品质密切相关基因诊断试剂盒，其操作方法如下：
1、PCR扩增SNP位点所在片段：采用20μL反应体系：在PCR反应管中加入上下 游引物混合物2.0μL、PCR反应试剂3μL、50ng/μL DNA模板1.0μL，加超纯水至20μL， 充分混匀后短暂离心。每个上下游引物混合物对应一个PCR反应管。
将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增：先94℃变性5min；再经过35个循环，每 个循环包括94℃30s、60℃15s、72℃30s；然后72℃延伸10min、最后4℃保存。
PCR-SSCP检测:2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后 冰浴5min。3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29：1，电压都为150V， 过夜电泳。
目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图 谱中的带型选择VIPR1、VIPR2和DAR2基因的基因型分别为TT/GG/OQ三基因复合基因型 的个体，即在73352、36127、201和208处分别为T、G、T和A/G等位基因的个体。
实施例1
一、VIPR-1、VIPR-2和DAR2三基因SNP检测
检测218只优质肉鸡——邵伯鸡三个基因的基因型。血样采自江苏省家禽科学研究所， 翅静脉采集血样1.5mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。用酚氯仿抽提的法提取基因组DNA，溶 于TE，对基因组DNA进行浓度测定后备用。
按照本试剂盒的操作步骤，VIPR1引物的SSCP图谱如图1所示，显示3种基因型(带 型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用CC和TT表示，杂合型用CT表示。测序表明 TT型与CC型相比在73352 bp处发生了C→T突变(图2)。
VIPR2引物的SSCP图谱如图3所示，显示3种基因型(带型表明形成了3种基因型， 两种纯合型分别用AA和GG表示，杂合型用AG表示，测序表明GG型在36127bp处发生 了G→A的突(图4)。
DAR2引物SSCP图谱如图5所示，显示6种基因型(带型表明形成了6种基因型，三种纯合 型分别用OO、PP和QQ表示，相应的杂合型用OP、OQ和PQ表示，OO型在201和208bp处的等 位基因分别为C和A，PP型在相应的位点分别为C和A，QQ型在相应的位点分别为T和G，分 别定义为OO、OP、OQ、PP、PQ和QQ基因型。取OO、PP和QQ3种基因型的PCR产物 片段进行测序。结果发现：QQ与OO相比在201处发生C→T突变，208处发生A→G突变(图 6)。
二、VIPR1、VIPR2和DAR2基因复合基因型对优质肉鸡鸡冠及精液品质的效应分析
配合下列模型分析VIPR-1、VIPR-2和DAR2复合基因型对优质肉鸡鸡冠及精液品质的 影响：Y＝μ+VIPR1基因的基因型效应+VIPR2基因的基因型效应+DAR2基因的基因型效应 +残差效应。优质肉鸡复合基因型TT/GG/OQ与不同复合基因型鸡冠及精液品质的比较见表1。
表1优质肉鸡复合基因型TT/GG/OQ与不同复合基因型精液品质的比较
复合基因型 密度(亿/ml) 精液量(μl) 活力 畸形率％ TT/GG/OP 35.98±1.02a 621±22a 8.33±0.13a 4.01±0.33 CC/GG/OQ 35.44±1.31a 582±25ab 8.31±0.18a 4.21±0.35 TT/AA/PP 35.12±1.23a 551±21b 8.12±0.15ab 4.12±0.28 CT/AA/PP 34.62±1.52b 579±24ab 8.30±0.16a 4.20±0.31 CT/GG/OP 35.02±1.21ab 584±23ab 8.24±0.23a 4.13±0.36 CC/GG/OP 34.48±1.22b 587±25ab 8.16±0.12ab 4.10±0.18 CC/AA/OO 34.07±1.23b 536±42b 7.50±0.15b 4.20±0.36 CT/AA/OO 34.54±1.28b 554±25b 7.86±0.19b 4.44±0.68 CT/AA/OP 35.04±1.36ab 583±34ab 8.11±0.18ab 4.18±0.47 CC/AG/OO 35.54±1.29a 587±28ab 8.11±0.31ab 4.18±0.39 TT/GG/OO 35.68±1.47ab 608±16ab 8.11±0.07ab 4.02±0.62 CC/GG/OO 34.59±1.39b 575±31ab 8.63±0.11a 4.20±0.58 TT/AA/OO 34.81±1.42ab 581±28ab 8.37±0.23a 4.21±0.39 TT/AG/OP 35.59±1.18a 606±37a 8.11±0.26ab 4.18±0.47 CC/AA/OP 34.24±1.37b 568±36b 7.99±0.29b 4.24±0.52 TT/AA/OP 35.68±1.31a 603±25a 8.31±0.18a 4.22±0.35 CT/GG/OO 35.12±1.23ab 572±21ab 8.12±0.15ab 4.02±0.28
注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表可见，三基因复合基因型TT/GG/OQ的个体精液品质最好，精液量比CC/AA/OO基 因型个体多15.9％(P<0.05)，比CT/AA/OO基因型个体多12.1％(P<0.05)；精子密度TT/GG/OQ 的个体比CC/AA/OO个体多多5.6％(P<0.05)，比CC/AA/OP个体多5.1％(P<0.05)；精子 活力TT/GG/OP型个体与CC/AA/OO、CT/AA/OO、CC/AA/OP个体的差异显著(P<0.05)； 精子畸形率各基因型个体间虽然差异不显著，但TT/GG/OQ型个体的畸形率小于其他基因型 个体。在群体中筛选复合基因型TT/GG/OQ可以提高优质鸡精液品质，所以根据VIPR1、VIPR2 和DAR2基因的SSCP图谱筛选TT/GG/OQ三基因复合基因型可作为提早优质肉鸡鸡冠及精 液品质的方法。
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120>提高鸡精液品质方法及其引物、试剂盒及其使用方法
<160> 6
<210> 1
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<212> DNA
<213>人工序列
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<221>VIPR1基因PCR扩增的上游引物
<223>
<400> 1
gctcccgcag  atatatggaa   20
 
<210>2
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<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> VIPR1基因PCR扩增的下游引物
<223>
<400> 2
tgggaggaga  caaaacaaca   20 
 
<210>3
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<212> DNA
<213>人工序列
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<221>VIPR2基因PCR扩增的上游引物
<223>
<400> 3
gtgttcactt  ttgggcacct   20
 
<210>4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
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<221>VIPR2基因PCR扩增的下游引物
<223>
<400> 4
cagccaaaaa  cattggtgtg   20
 
<210>5
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<212> DNA
<213>人工序列
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<221>DAR2基因PCR扩增的上游引物
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<400> 5
gttggggagt  ggaggttcag  20
 
<210>6
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<212> DNA
<213>人工序列
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<221> DAR2基因PCR扩增的下游引物
<223>
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attgggctgg  agatggcaaa   20