一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法.pdf

本发明公开了一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。本发明中高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，通过采用目前已有的免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫蛋鸡，在免疫过程中通过喂食桑叶杜仲提取物；通过收集2～6周的免疫PRRS疫苗的鸡蛋，提取卵黄水提液，对卵黄水提液采用冻融法纯化获得卵黄抗体IgY。本发明制备方法中的桑叶杜仲提取物通过喂食的方法能够明显提高机体免疫功能，促进抗体产生，符合当前绿色食品的需求，本研究选择桑叶杜仲提取物作为免疫增强剂以制备高效价蓝耳病卵黄抗体，对猪蓝耳病的紧急治疗具有实用价值，从而对减少养猪业的经济损失，促进新型兽用生物药物开发具有重要意义。

权利要求书
1.  一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)取20～30周龄的健康蛋鸡，饲喂一周后，进行首次免疫，在首次免疫后14天、28天分别进行二次免疫和三次免疫，所述的首次免疫、二次免疫和三次免疫的处理方法相同，所述的免疫的方法为：肌肉分点免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗0.2ml/羽，同时通过饮水给药喂食桑叶杜仲提取物5mg/羽；收集免疫后2～6周内所产的免疫PRRS疫苗的鸡蛋；
2)将步骤1)收集的免疫PRRS疫苗的鸡蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加卵黄液9倍体积的pH5.2酸化水稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，10000r/min 4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液；
3)采用冻融法纯化卵黄抗体IgY：置卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得纯化后的猪蓝耳病卵黄抗体IgY。

2.  根据权利要求1所述的高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的蛋鸡为罗曼蛋鸡或白羽蛋鸡。

3.  根据权利要求1所述的高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的桑叶杜仲提取物由桑叶多糖和杜仲提取物制成，每1000ml桑杜复方多糖由桑叶280-320g和杜仲皮50-100g制成。

4.  根据权利要求1所述的高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的酸化水是在1000ml生理盐水中加入0.1mol/l的冰醋酸，调节PH值为5.2。

说明书一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域，特别涉及一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法。
背景技术
猪蓝耳病(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是我国猪病中最主要的一种免疫抑制病，主要引起大量怀孕母猪流产、早产，产下死胎等，给养猪业带来严重的经济损失。像其他传染病一样，猪蓝耳病的主要预防手段是接种疫苗，但是在实践过程中，蓝耳病疫苗防治经常会出现免疫失败，其主要原因是疫苗免疫时，机体产生中和抗体时间较长，或不能产生高效价的抗体，如高致性蓝耳病灭活苗需要14天才能产生，20天才能达到有效保护，而在此期间均有可能感染。因此，采用人工主动与被动联合免疫防治猪蓝耳病具有重要意义。
针对目前畜禽重大疾病尤其是病毒性疾病的防治中无特效药物，利用卵黄抗体(Egg Yolk Immunoglobulin，IgY)对畜禽进行被动免疫来防治畜禽传染病是一种很好的措施。卵黄抗体是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从卵黄中获得特异性多克隆抗体的技术。IgY通过被动免疫方式使用，在畜禽和水产业的重大传染病的防控和治疗中发挥了巨大作用。
获得高效价的卵黄抗体的关键是用抗原刺激使得机体产生持续的、稳定的抗体。免疫佐剂的应用是提高疫苗免疫效果的重要途径之一，可增强免疫反应的强度和反应的持久性。中药成分佐剂在提高疫苗免疫效果方面已经有很多研究，已有多种中药多糖具有很好的免疫增强效果，中药提高卵黄抗体效价的报道也有很多，如鲁敏等证实蜂胶佐剂灭活苗能够促进抗CPV的特异性卵黄抗体的产生，并能够达到较高的抗体效价水平。鉴于猪蓝耳病防治过程中经常出现疫苗免疫失败及制备高免卵黄抗体的需要，亟须一种制备高效价的卵黄抗体的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取20～30周龄的健康蛋鸡，饲喂一周后，进行首次免疫，在首次免疫后14天、28天分别进行二次免疫和三次免疫，所述的首次免疫、二次免疫和三次免疫的处理方法相同，所述的免疫的方法为：肌肉分点免疫猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)活疫苗0.2ml/羽，同时通过饮水给药喂食桑叶杜仲提取物5mg/羽；收集免疫后2～6周内所产的免疫PRRS疫苗的鸡蛋；
2)将步骤1)收集的免疫PRRS疫苗的鸡蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加相当于卵黄液9倍体积的酸化水(pH5.2)稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，10000r/min 4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液(Water Soluble Fraction，WSF)；
3)采用冻融法纯化卵黄抗体IgY：置卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得纯化后的猪蓝耳病卵黄抗体IgY。
步骤1)中所述的蛋鸡优选为罗曼蛋鸡或白羽蛋鸡。
步骤1)中所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗优选为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)。
步骤1)中桑叶杜仲提取物5mg/羽中的浓度以中药多糖计。
步骤1)中所述的桑叶杜仲提取物由桑叶多糖和杜仲提取物制成，每1000ml桑叶杜仲提取物由桑叶280-320g和杜仲皮50-100g制成。
步骤2)中所述的酸化水是在1000ml生理盐水中加入0.1mol/l的冰醋酸，调节PH值为5.2。
上述方法获得的抗体效价测定方法，具体步骤如下：用2-6病毒滴度的繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)包被96孔板，每孔100μl，4℃孵育过夜；弃去板中包被液，用洗涤液洗3次，每次1min，加1％BSA200μl封闭，37℃作用2h，弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次3min；在每孔中加入100μl已稀释不同浓度梯度待测阳性卵黄提取液，设阴性对照、PBS对照， 37℃作用1h，弃去板中溶液，用洗涤液洗3次，每次3min；加入1:5000稀释度羊抗鸡HRP-IgG二抗，每孔100μl，37℃作用1h；弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次5min；加底物显色液，每孔100μL，37℃避光作用15min；2mol/lH2SO4终止显色，每孔50μl；测定各孔的OD450值；判定指标：阳性OD值＞1.0，阴性OD值＜0.3，当(OD阳性－ODPBS)/(OD阴性－ODPBS)＞2.1，即表示该稀释倍数的卵黄抗体效价，取最高卵黄提取液稀释度对数为几何平均效价滴度。
所述的已稀释不同浓度梯度待测阳性卵黄提取液为上述获得的纯化后的猪蓝耳病卵黄抗体IgY从1:8开始2倍倍比稀释，稀释至2-9。优选为猪蓝耳病卵黄抗体的稀释度为2-6。所述的阴性对照为未经PRRSV免疫的空白对照组卵黄提取液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中高效价猪蓝耳病卵黄抗体的制备方法，通过采用目前已有的免疫猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)活疫苗免疫蛋鸡，在免疫过程中通过喂食桑叶杜仲提取物，增加疫苗的的免疫效果、增强免疫反应的强度和反应的持久性；通过收集2～6周的免疫PRRS疫苗的鸡蛋，提取卵黄水提液，对卵黄水提液采用冻融法纯化获得卵黄抗体IgY，获得猪蓝耳病卵黄抗体的效价高，制备方法简单且易大规模生产。本发明制备方法中的桑叶杜仲提取物通过喂食的方法能够明显提高机体免疫功能，促进抗体产生，以及桑叶杜仲提取物的中药成分符合当前绿色食品的需求，本研究选择桑叶杜仲提取物作为免疫增强剂以制备高效价蓝耳病卵黄抗体，对猪蓝耳病的紧急治疗具有实用价值，从而对减少养猪业的经济损失，促进新型兽用生物药物开发等具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中IgY水提物及纯化后SDS-PAGE图，其中：M.标记蛋白；1.卵黄水提液；2.纯化后IgY；3.牛血清白蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.试验一：30周龄健康罗曼蛋鸡16只，购自泰州某养殖场，饲喂自配无抗蛋鸡全价料1周。随机分为4组，每组4只，分别于首免及首免后14天、28天肌肉分点免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)0.2ml/羽(一组)、0.4ml/羽(二组)、0.6ml/羽(三组)、0.8ml/羽(四组)。不添加使用任何疫苗佐剂。分别于免疫后第1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周收集各组鸡蛋，用于卵黄抗体效价测定，以确定最佳疫苗免疫剂量。
2.试验二：20周龄健康白羽蛋鸡30只(由泰州某养殖场提供)，饲喂自配无抗蛋鸡全价料。一周后，随机分为3组，每组10只。分别为桑叶杜仲提取物组、免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)。除空白对照组注射0.2ml生理盐水外，其余各组分别胸肌分三点注射0.2ml/羽PRRS疫苗。同时，桑叶杜仲提取物组按照5mg/羽(以中药多糖计)分别饮水给药，首免后间隔两周进行二免和三免，按相同的方式给药。免疫前1周和免疫后连续9周，每组随机抽取4只鸡蛋，采用ELISA法测定卵黄中PRRSV特异性IgY抗体效价。
3.试验三：卵黄抗体水提液的制备
收集免疫PRRS疫苗鸡的蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加相当于卵黄液9倍体积的酸化水(pH5.2)稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，10000r/min 4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液(Water Soluble Fraction，WSF)。
4.试验四：卵黄抗体的纯化
采用冻融法纯化IgY。置WSF于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，即为纯化后的IgY。
5.试验五：特异性IgY抗体ELISA方法的建立
(1)抗原最佳包被浓度的确定
用棋盘法，将全病毒溶液用PH9.6碳酸盐缓冲液从1:10开始进行10倍倍比稀释，每孔100μl包被酶标板，稀释至10-11，4℃过夜。选择免疫后第4周免疫对照组鸡蛋按1.4方法制备WFS，从1:8开始2倍倍比稀释，稀释至2-9。设未免疫组鸡蛋作阴性对照，同阳性WFS稀释法稀释。PBS作空 白对照。酶标二抗羊抗鸡HRP-IgG作1:5000稀释，其它步骤按ELISA方法进行。加底物显色液，每孔100μl，37℃避光作用15min。2mol/lH2SO4终止显色，每孔50μL。测定各孔的OD450值。取P/N>2，且值最大时相对应的为抗原最佳包被浓度和周FS最佳稀释度。
(2)酶标二抗最佳工作浓度确定
采用最佳抗原包被浓度、最佳WFS稀释度，将羊抗鸡HRP-IgG二抗作1:2500、1:5000、1:7500、1:10000稀释进行间接ELISA测定，以确定酶标二抗的最佳工作浓度。取P/N>2，且值最大时相对应的酶标二抗浓度为最佳工作浓度。
(3)抗PRRSV特异性IgY抗体效价监测
采用ELISA法测定纯化后卵黄液中PRRSV特异性IgY抗体效价。简要如下：用PRRSV最佳包被浓度包被96孔板，每孔100μl，4℃孵育过夜。弃去板中包被液，用洗涤液洗3次，每次1min，加1％BSA200μl封闭，37℃作用2h，弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次3min。在每孔中加入100μl已稀释待测阳性卵黄提取液，设阴性(空白对照组卵黄提取液)对照、PBS对照，37℃作用1h，弃去板中溶液，用洗涤液洗3次，每次3min。加入最佳稀释度羊抗鸡HRP-IgG二抗，每孔100μl，37℃作用1h。弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次5min。加底物显色液，每孔100μl，37℃避光作用15min。2mol/lH2SO4终止显色，每孔50μl。测定各孔的OD450值。判定指标：阳性OD值＞1.0，阴性OD值＜0.3，当(OD阳性－ODPBS)/(OD阴性－ODPBS)＞2.1，即表示该稀释倍数的卵黄抗体效价，取最高卵黄提取液稀释度对数为几何平均效价滴度。
上述实验的研究结果如下：
1)IgY蛋白卵黄抗体的提取
利用水稀释法从鸡蛋中提取的IgY抗体，经冻融后获得较高纯度，经15％SDS-PAGE电泳分析，提纯后IgY样品在Mr为67kDa和27kDa左右处显示出两个条带(如图1所示)，由于上样缓冲液中含有β-巯基乙醇，IgY的二硫键被打开，裂解为IgY的重链和轻链。
2)ELISA法检测抗PRRSV特异性IgY抗体效价方法确定
在ELISA法检测抗PRRSV特异性IgY抗体效价方法建立中，选择棋盘法进行抗原最佳包被浓度和酶标二抗最佳稀释度的确定。
(1)抗原最佳包被浓度确定
通过方阵滴定法，当抗原的稀释度为10-9，卵黄提取液的稀释度为2-6时，阳性卵黄提取液的OD450值为1.029，阴性卵黄提取液的OD450值为0.201，阳性与阴性卵黄提取液的OD450值相差最大(P/N＝5.119)。因此，选择10-9为抗原的最佳包被浓度，2-6为卵黄提取液的最佳稀释度。
(2)酶标二抗最佳稀释度确定
当羊抗鸡HRP-IgG二抗稀释度为1:5000时，阳性卵黄提取液与阴性卵黄提取液的OD450值比值最大，为5.153。因此，将1:5000确定为酶标二抗的最佳工作浓度。
因此，测定抗PRRSV特异性IgY抗体效价ELISA方法为：用2-6稀释度的PRRSV包被96孔板，每孔100μl，4℃孵育过夜。弃去板中包被液，用洗涤液洗3次，每次1min，加1％BSA200μl封闭，37℃作用2h，弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次3min。在每孔中加入100μl已稀释待测阳性卵黄提取液，设阴性(空白对照组卵黄提取液)对照、PBS对照，37℃作用1h，弃去板中溶液，用洗涤液洗3次，每次3min。加入1:5000稀释度羊抗鸡HRP-IgG二抗，每孔100μL，37℃作用1h。弃去板中溶液，洗涤液洗3次，每次5min。加底物显色液，每孔100μl，37℃避光作用15min。2mol/lH2SO4终止显色，每孔50μl。测定各孔的OD450值。判定指标：阳性OD值＞1.0，阴性OD值＜0.3，当(OD阳性－ODPBS)/(OD阴性－ODPBS)＞2.1，即表示该稀释倍数的卵黄抗体效价，取最高卵黄提取液稀释度对数为几何平均效价滴度。
3)不同免疫剂量产生卵黄抗体效价比较
不同免疫剂量产生卵黄抗体效价结果见表1。在首免后第1周，各剂量组乱黄抗体水平无显著性差异(P＞0.05)；在首免后第2～6周，0.2ml免疫剂量组卵抗效价均高于其它剂量组，且在大部分时间点均成显著性差异(P＜0.05)；在首免后第7～9周0.2ml免疫剂量组抗体效价稍高于其它剂量组，但差异不显著(P＞0.05)。
4)中药复方多糖提高抗PRRSV特异性卵黄IgY抗体效价
桑叶杜仲提取物组和免疫对照组抗PRRSV特异性卵黄IgY抗体效价结果见表2。给药组增强抗PRRSV特异性卵黄IgY抗体水平在各时间点均显著高于免疫对照组(P＜0.05)。
表1 PRRSV不同免疫剂量产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)

注：“X”为血清稀释倍数。同行数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
表2 PRRS特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。