一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法.pdf

本发明公开了一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法。首先在谷氨酸特异性内肽酶基因的5’端连上p43启动子，在3’端连上终止子，再将此序列插入pHY300pLK克隆载体的EcoRI和HindIII酶切位点之中，然后转化到地衣芽孢杆菌中，得到重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌。因此本发明选用适用于地衣芽孢杆菌的克隆载体PHY300PLK，并在其中引入P43启动子和终止子以便于GSE-BL的表达，实现地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶可溶性表达，为地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶的制备、研究其结构及酶学性质提供新的策略，从而促进GSE-BL在蛋白质序列及构象分析、多肽合成及生物活性肽的回收方面的广泛应用。

权利要求书
1.  一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，首先在谷氨酸特异性内肽酶基因的5’端连上p43启动子，在3’端连上终止子，再将此序列插入pHY300pLK克隆载体的EcoRI和HindIII酶切位点之中，然后转化到地衣芽孢杆菌中，得到重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌；
所述的谷氨酸特异性内肽酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的p43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.  根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌ATCC14580。

3.  根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在谷氨酸特异性内肽酶基因的起始密码子后和/或终止密码子前加入组氨酸标签。

4.  一种按照权利要求1、2或3所述的构建方法构建得到的重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌。

说明书一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法。
背景技术：
地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶(GSE-BL)是一种能特异性地识别谷氨酸或天冬氨酸残基的α-羧基的类胰凝乳蛋白酶，它对于谷氨酸残基所形成肽键的切割效率是天冬氨酸残基所形成肽键切割效率的100-1000倍。由于其对于谷氨酸和天冬氨酸的特异识别能力在蛋白质序列及构象分析、多肽合成及生物活性肽的回收等方面有着广泛的应用前景。Svendsen等(Ib Svendsen，Klaus Breddam.Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis.European Journal of Biochemistry,1992,204(1):165-171)从一种商业化碱性蛋白酶Alcalase(提取自地衣芽孢杆菌ATCC14580发酵液)中通过弱阳离子交换层析、亲和层析的方法得到了较纯的地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性蛋白酶(GSE-BL)，其产量为8.24mg/L。但这个方法步骤较繁琐，工艺较复杂，产率也较低。也有很多研究者尝试将GSE-BL在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中进行异源表达。GSE-BL在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，经过尿素变性，亲和层析纯化和梯度尿素复性，得到有活性的GSE-BL，但该工艺步骤较为繁琐，还需要加入价格相对昂贵的硫代异丙基半乳糖苷，不利于工业放大。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能实现地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶可溶性表达的重组表 达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌及其构建方法。
本发明的重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌，是通过以下方法构建的：首先在谷氨酸特异性内肽酶基因的5’端连上p43启动子，在3’端连上终止子，再将此序列插入pHY300pLK克隆载体的EcoRI和HindIII酶切位点之中，然后转化到地衣芽孢杆菌中，得到重组表达谷氨酸特异性内肽酶的地衣芽孢杆菌；
所述的谷氨酸特异性内肽酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的p43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的地衣芽孢杆菌优选为地衣芽孢杆菌ATCC14580。
优选，在谷氨酸特异性内肽酶基因的起始密码子后和/或终止密码子前加入组氨酸标签，组氨酸标签便于纯化。
目前，关于地衣芽孢杆菌表达体系的研究报道比较少，而地衣芽孢杆菌是一种公认的安全无毒的革兰氏阳性菌，而且地衣芽孢杆菌的营养要求简单，生长迅速。因此建立地衣芽孢杆菌的重组表达体系有较重要的现实意义。因此本发明选用适用于地衣芽孢杆菌的克隆载体PHY300PLK，并在其中引入P43启动子和终止子以便于GSE-BL的表达，实现地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶可溶性表达，为地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶的制备、研究其结构及酶学性质提供新的策略，从而促进GSE-BL在蛋白质序列及构象分析、多肽合成及生物活性肽的回收方面的广泛应用。此外，GSE-BL由地衣芽孢杆菌分泌，通过重组表达在地衣芽孢杆菌中可实现蛋白酶结构的优化，有利于得到有活性的蛋白酶。
附图说明：
图1为PHY300PLK-GSE-BL的双酶切鉴定图；其中M为DL5000Marker；1.pHY300PLK载体，2.PHY300PLK-GSE-BL的双酶切产物，其中1200bp位置为P43启动子加GSE-BL；
图2为PHY300PLK-GSE-BL阳性克隆的测序结果；
图3为PHY300PLK-GSE-BL表达产物(GSE-BL蛋白)纯化后的SDS-PAGE及Western blot鉴定图：图3A为SDS-PAGE鉴定图；图3B为Western blot鉴定图，其中野生菌表示地衣芽孢杆菌ATCC14580，重组菌表示含重组质粒PHY300PLK-GSE-BL的地衣芽孢杆菌ATCC14580。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：PHY300PLK-GSE-BL的重组质粒的构建：
一、重组质粒pBEP43-vgb的获取。
1.设计引物： 
上游引物：ACGCGTCGACATGTTAGACCAGCAAACCAT
下游引物：CGCGGATCCTTCAACCGCTTGAGCGTAC
2.以透明颤菌基因组为模板，按如上引物PCR扩增得到带酶切位点的vgb基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，用SalI和BamHI于37℃处理2h。将pBEP43载体用SalI和BamHI于37℃处理2h，回收酶切产物。将两酶切产物于22℃连接5h,转化DH5α感受态细胞，挑取克隆扩大培养，用氨苄青霉素和卡那霉素筛选，菌液PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。所得阳性克隆即是将vgb基因插入pBEP43载体，然后再转化进入DH5α细胞中，所得的重组载体命名为：重组质粒pBEP43-vgb(将vgb基因插入pBEP43载体中)。
二、重组质粒pET22b-GSE-BL
设计GSE-BL的上下游引物：
上游引物GGAATTCCATATGCACCCGGCCCAAGCC
下游引物GCCCTCGAGTTGTGCGCTGTTTTTCCAGTTGG
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，以如上引物进行PCR扩增得到含有NdeI和XhoI酶切位点的GSE-BL基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，所得PCR产物用NdeI和XhoI酶切。将pET22b载体质粒用NdeI和XhoI酶切，于37℃处理2h，回收酶切产物。将两酶切产物于22℃连接5h,转化DH5α感受态细胞，挑取克隆扩大培养，用氨苄青霉素筛选，菌液PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。所得阳性克隆即是将GSE-BL基因插入pET22b载体，然后再转化进入DH5α细胞中，所得的重组载体命名为：重组质粒pET22b-GSE-BL(将GSE-BL基因插入pET22b载体中)。
三、PHY300PLK-GSE-BL的重组质粒的构建
(1)接种含有pBEP43-vgb重组质粒的大肠杆菌DH5α，提取质粒pBEP43-vgb，用SalI和BamHI于37℃酶切2h，切胶回收7.9kb左右的片段(pBEP43-vgb片段)；
(2)以重组质粒pET22b-GSE-BL为模板，以GSE-BL上下游引物(F：5’-acgcgtcgacatgcacccggcccaagccgcgcc-3’；R：5’-acgcggatccttagtggtggtggtggtggtgttgtgcgctgtttttccag-3’)进行扩增，在其C端引入组氨酸标签。
其反应体系如下：


PCR扩增程序如下：

切胶回收900bp左右的片段，采用SalI和BamHI于37℃酶切5h，采用天根的DNA产物回收试剂盒回收产物(GSE-BL片段)。
将SalI和BamHI双酶切后所得的pBEP43-vgb和GSE-BL片段于22℃连接5h，连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取克隆，用引物(F：5’-acgcgtcgacatgcacccggcccaagccgcgcc-3’；R：5’-a cgcggatccttagtggtggtggtggtggtgttgtgcgctgtttttccag-3’)筛选阳性克隆，提取质粒pBEP43-GSE-BL(将GSE-BL基因插入到载体pBEP43中)，采用EcoRI和HindIII对其进行双酶切，回收1100bp左右的小片段(GSE-BL片段，其包含C端的组氨酸标签，GSE-BL基因，p43启动子(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，以及终止子(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。采用EcoRI和HindIII对质粒PHY300PLK进行双酶切，DNA产物回收试剂盒回收产物。将经过双酶切的PHY300PLK片段和GSE-BL片段于22℃连接5h，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆。挑取克隆，提取质粒pHY300PLK-GSE-BL(GSE-BL片段插入到载体PHY300PLK中)进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，如图1所示，经双酶切后可得到5kb和1.2kb左右的两个片段。将所得阳性克隆送至测序公司进行测序确认。
实施例2:PHY300PLK-GSE-BL电转化至地衣芽孢杆菌ATCC14580，包含如下步骤：
(1)地衣芽孢杆菌ATCC14580感受态的制备：
将30ml地衣芽孢杆菌ATCC14580(该菌株保藏于美国菌种保藏中心(ATCC)，其保藏编号为：ATCC14580，任何人都可以从该保藏中心购买到该菌株)菌液培养至OD600nm为0.8左右，4℃，6000rpm冷冻离心，用冰预冷的EP缓冲液洗涤细胞2次，4℃，6000rpm冷冻离心，用1ml EP缓冲液悬浮细胞，-80℃保存。
(2)重组质粒的电转化：
将重组质粒PHY300PLK-GSE-BL与地衣芽孢杆菌ATCC 14580感受态细胞于冰上混合5min，转移至冰预冷的2mm电转杯中，以1800V，5.0ms的转化条件进行电转化。电转结束后立即加入1ml复苏培养基，于30℃下恢复培养4h,涂布至含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，挑取克隆扩大培养，菌液PCR和测序鉴定，确定阳性克隆，其测序结果在NCBI数据库中比对得知，该片段为GSE-BL基因(GenBank accession:D10060)(图2)。
实施例3：GSE-BL的SDS-PAGE及Western blot鉴定，包含如下步骤：
(1)将含有质粒PHY300PLK-GSE-BL的重组地衣芽孢杆菌ATCC14580接种至LB培养基中，于30℃培养48h，收集菌体，100W的条件下进行超声破碎，8000rpm离心10分钟，保留其上清。
(2)所得上清上样至Ni亲和层析柱，采用含有不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液进行洗脱。如图3A所示，在地衣芽孢杆菌ATCC14580中表达的重组GSE-BL(谷氨酸特异性内肽酶)的分子量为36kD左右，与预测的分子量一致，GSE-BL在55mM咪唑洗脱液中纯度最高，达到93.8％，其产量为26.25mg/L。
(3)以未导入重组质粒的野生ATCC14580破菌后的上清为对照，与导入PHY300PLK-GSE-BL的重组ATCC14580一并进行Western blot鉴定。SDS-PAGE完毕后转膜至NC膜，100V恒压条件下转膜40min，5％脱脂奶粉37℃封闭2.5h，采用鼠源偶联HRP的Anti-His单克隆抗体(Abcam品牌)以1:1500稀释度4℃温育过夜，TBST洗涤3次，每次15min，加入底物和发光液于暗室进行曝光。结果如图3B所示，只有含有质粒PHY300PLK-GSE-BL的重组地衣芽孢杆菌ATCC14580能产生GSE-BL蛋白。
(4)以不含GSE-BL的55mM咪唑洗脱液作为空白对照，以Z-Phe-Leu-Glu-pNA为底物，测定含GSE-BL的55mM咪唑洗脱液的酶活力，最终计算得知其酶活力为458.6.2U/mg。