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1、10申请公布号CN104160030A43申请公布日20141119CN104160030A21申请号201380009859222申请日2013021861/599,96320120217USC12N15/82200601A01H5/0020060171申请人凯金公司地址荷兰瓦赫宁恩72发明人安妮德斯莱特斯梅斯玛丽克海伦娜阿德里安娜范赫尔滕希塔尔阿尼尔库马尔迪克西特马丁德福斯杰斯大卫蒙克沃尔德马修维塔比莱迪莱奥74专利代理机构北京德琦知识产权代理有限公司11018代理人王峰王珍仙54发明名称改善植物抗旱性UPL457摘要本发明涉及一种增强植物抗旱性的新方法。所述方法包括破坏所述植物中一个或多。
2、个基因的表达。与没有被处理以破坏所述基因的表达的植物相比，该植物显示改善的抗旱性。还提供可以通过根据本发明的方法获得的植物和植物产品。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014081886PCT国际申请的申请数据PCT/NL2013/0501002013021887PCT国际申请的公布数据WO2013/122471EN2013082251INTCL权利要求书2页说明书19页序列表83页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书19页序列表83页附图4页10申请公布号CN104160030ACN104160030A1/2页21用于生产具有与对照植物相。
3、比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物中UPL蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述植物，所述UPL蛋白质包括包含至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。2用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物、植物细胞或植物原生质体中功能性UPL4蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性UPL4蛋白质包括包含与SEQIDNO2的氨基酸序列至少35同一性的氨基酸序列。3根据权利要求2所述的方法，其中所述功能性UPL4蛋白质包括包含至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构。
4、域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。4根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。5用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物、植物细胞或植物原生质体中功能性UPL4蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性UPL4蛋白质包括具有至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据。
5、模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。6用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏功能性UPL4蛋白质的表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性UPL4蛋白质由包括具有与SEQIDNO1的核酸序列至少60同一性的核酸序列的核酸序列编码。7根据权利要求56中任一项所述的方法，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。8根据权利要求27中任一项所述的方法，其。
6、中所述破坏功能性UPL4蛋白质的表达的步骤包括使编码所述功能性UPL4蛋白质的核酸序列突变。9根据权利要求8的方法，其中使所述核酸序列突变包括至少一个核苷酸的插入、缺失和/或取代。10根据权利要求18中任一项所述的方法，其中所述破坏表达的步骤包括基因沉默。11根据权利要求210中任一所述的方法，所述方法包括破坏所述植物中两种或更多种功能性UPL4蛋白质表达的步骤。12根据权利要求111中任一项所述的方法，所述方法进一步包括由具有改善的抗旱性的植物生产植物或植物产品的步骤。13与SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少35同一性的氨基酸序列或与SEQIDNO1的核酸序列具有至少60同一性的核酸序列在。
7、植物抗旱性筛选中的用途。14具有SEQIDNO2的UPL4氨基酸序列或SEQIDNO1的UPL4核酸序列在拟南芥权利要求书CN104160030A2/2页3植物抗旱性筛选中的用途。15SEQIDNO1的UPL4核酸序列的至少一部分或SEQIDNO2的UPL4氨基酸序列的至少一部分作为培育抗旱性拟南芥植物的标记物的用途。16如权利要求27中任一项所定义的功能性UPL4蛋白质用于调节、优选地增强植物抗旱性的用途。17其中功能性UPL4蛋白质的表达受损的植物、植物细胞或植物产品用于在干旱胁迫条件下生长的用途，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插。
8、入系中表达时，其产生与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物，其中所述干旱胁迫条件引起其中所述功能性UPL4蛋白质的表达未受损的对照植物、植物细胞或植物产品比其中功能性UPL4蛋白质的表达被破坏的植物、植物细胞或植物产品更早地显示的干旱胁迫症状，例如枯萎症状。18其中功能性UPL4蛋白质的表达被破坏的番茄、陆地棉、大豆、小麦属植物、大麦、燕麦、高粱、黑麦或甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物产品，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其产生与其中所述功。
9、能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。19根据权利要求18所述的番茄、陆地棉、大豆、小麦属植物、大麦、燕麦、高粱、黑麦或甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物产品，包含被破坏的内源性UPL4基因。权利要求书CN104160030A1/19页4改善植物抗旱性UPL4技术领域0001本发明涉及一种增强植物抗旱性的方法。所述方法包括破坏所述植物中一个或多个基因或蛋白质的表达。与没有被处理以破坏所述一个或多个基因或蛋白质表达的植物相比，所述植物显示改善的抗旱性。还提供了可以通过根据本发明的方法获得的植物和植物产品。背景技术0002非生物。
10、胁迫，例如干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫都是农业的威胁，并且其是全世界作物损失的主要原因WANG等，2003PLANTA2181114。0003本领域中，一些报道可用于处理非生物胁迫的生物化学、分子和遗传学背景WANG等，2003PLANTA2181114或KILIAN等2007PLANTJ502347363。用于处理非生物胁迫的植物改良通常是基于保护和保持细胞组分的功能和结构的基因操作。然而，由于对非生物胁迫条件的遗传复杂反应，这样的植物似乎更难控制和工程化。WANGWANG等，2003PLANTA2181114特别地提及工程化的策略之一依靠使用一个或几个基因，所述基因参与信号传导。
11、和调控途径、或编码引起功能和结构性保护物例如渗透物和抗氧剂的合成的途径中存在的酶、或编码赋予耐逆性的蛋白质。0004尽管已经报道了在提供非生物胁迫抗性植物方面的改善，但是以其为基础的遗传复杂机制的性质提供了进一步改善该领域的持续的需要。例如，据报道由于发育和生理失衡，基因转化的抗旱植物通常可能显示更慢的生长和减少的生物量SERRANO等，1999JEXPBOT5010231036，因此，与没有转化的植物相比具有显著的适合度代价KASUGA等，1999NATUREBIOTVOL17；DANBYANDGEHRING2005TRENDSINBIOTVOL23NO11。0005为了在胁迫条件下获得植物。
12、生长，提出了一些生物技术方法。例如，WO03/020015中公开了对盐胁迫的抗性增强的植物。该文件公开了利用9顺式环氧类胡萝卜素加双氧酶核苷酸和多肽而抗盐胁迫的转基因植物。0006在例如US2009/0144850、US2007/0266453和WO2002/083911中公开了抗旱性增强的植物。US2009/0144850描述了由于DR02核酸的表达改变而显示耐旱表型的植物。US2007/0266453描述了由于DR03核酸的表达改变而显示耐旱表型的植物，并且WO2002/083911描述了由于在保卫细胞中表达的ABC转运体的活性降低而具有对干旱胁迫的抗性增强的植物。另一个实例是KASUGA。
13、和合著者1999的工作，其描述了在正常生长条件下，转基因植物中编码DREB1A的CDNA的过表达活化许多胁迫抗性基因的表达，导致对干旱、盐负荷和严寒的抗性改善。然而，DREB1A的表达也引起在正常生长条件下严重的生长迟缓KASUGA1999NATBIOTECHNOL173287291。仍然需要用于增强对非生物胁迫尤其是如干旱的非生物胁迫的抗性的新的、可替代的和/或另外的方法。0007本发明的一个目的是提供增强植物抗旱性的新方法。如果在低的水可利用性/干旱的条件下生长，与没有接受根据本发明的方法的植物相比，这样的植物例如有可能生产说明书CN104160030A2/19页5更多生物量和/或更多作物。
14、和其衍生的植物产品。发明内容0008本发明提供一种用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物中UPL蛋白质的表达的步骤，和可选择地再生所述植物，所述UPL蛋白质包括包含至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。0009在另一个方面，本发明提供了一种生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物、植物细胞或植物原生质体中功能性UPL4蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性UPL4蛋白质包括包含与SEQIDNO2的氨基酸序列至少35同一性的氨基酸序列。00。
15、10所述功能性UPL4蛋白质可以包括包含至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。0011所述功能性UPL4蛋白质可以是如下蛋白质当在具有破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其得到与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。0012本发明进一步涉及一种生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植物、植物细胞或植物原生质体中功能性UPL4蛋白质表达的步骤，和可选择选地再生所述植物，其中所述功能性UPL4。
16、蛋白质包括具有至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复的氨基酸序列。0013本发明还涉及一种生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏功能性UPL4蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性UPL4蛋白质由包含与SEQIDNO1的核酸序列具有至少60同一性的核酸序列的核酸序列编码。0014所述功能性UPL4蛋白质可以是如下蛋白质当在具有破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其得到与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性。
17、相比抗旱性受损的植物。0015破坏功能性UPL4蛋白质的表达的步骤可以包括使编码所述功能性UPL4蛋白质的核酸序列突变。使所述核酸序列突变可以包括插入、缺失和/或取代至少一个核苷酸。破坏表达的步骤可以包括基因沉默。破坏表达的步骤可以包括破坏所述植物中两种或更多种功能性UPL4蛋白质的表达。0016所述方法可以进一步包括由具有改善的抗旱性的植物生产植物或植物产品的步骤。0017本发明还涉及与SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少35同一性的氨基酸序列或与SEQIDNO1的核酸序列具有至少60同一性的核酸序列在植物抗旱性筛选中的用途。0018本发明涉及具有SEQIDNO2的UPL4氨基酸序列或SEQ。
18、IDNO1的UPL4核酸序列在拟南芥植物抗旱性筛选中的用途。0019本发明还涉及SEQIDNO1的UPL4核酸序列的至少一部分或SEQIDNO2的UPL4氨基酸序列的至少一部分作为培育抗旱性拟南芥植物的标记物的用途。说明书CN104160030A3/19页60020本发明进一步提供如本文定义的功能性UPL4蛋白质用于调节、优选地提高植物抗旱性的用途。0021在另一个方面，本发明提供其中功能性UPL4蛋白质的表达受损的植物、植物细胞或植物产品用于在干旱胁迫条件下生长的用途，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其得到与其中所述功。
19、能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物，其中所述干旱胁迫条件引起其中所述功能性UPL4蛋白质的表达未受损的对照植物、植物细胞或植物产品比其中功能性UPL4蛋白质的表达被破坏的植物、植物细胞或植物产品更早地显示干旱胁迫症状，例如枯萎症状。0022本发明还教导其中功能性UPL4蛋白质的表达受损的番茄SOLANUMLYCOPERSICUM、陆地棉GOSSYPIUMHIRSUTUM、大豆GLYCINEMAX、小麦属植物TRITICUMSPP、大麦HORDEUMVULGARE、燕麦AVENASATIVA、高粱SORGHUMBICOL。
20、OR、黑麦SECALECEREALE或甘蓝型油菜BRASSICANAPUS植物、植物细胞或植物产品，其中所述功能性UPL4蛋白质为如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达、具有被破坏的内源性UPL4基因的所述拟南芥TDNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。所述植物、植物细胞或植物产品可包括被破坏的内源性UPL4基因。附图说明0023图1显示在实施例1和2中说明的典型的实验的结果。0024图2显示与对照野生型植物的干旱敏感性表型相比，UPL4敲除拟南芥AT5G02880插入突变体的抗旱表型。0025图3显示AT5G0。
21、2880插入突变体UPL4的干旱存活率。拟南芥AT5G02880插入突变体比野生型COL0植物或补充AT5G02880SEQIDNO1；阳性对照和来自拟南芥SEQIDNO3、芜菁SEQIDNO5或7、番茄SEQIDNO9或水稻SEQIDNO11的同系物的编码序列CDS的AT5G02880插入突变体抗旱存活显著地更好P005。该图证实UPL4基因中的插入突变产生抗旱表型。而且，其也表明来自单子叶植物和双子叶植物物种的该基因同系物起恢复正常干旱敏感性表型的作用。因此，这些同系物在它们各自作物物种中，在耐旱方面执行相同的功能。当插入拟南芥的UPL4插入突变体中时，观察到单子叶植物和双子叶植物UPL4。
22、基因都可以恢复干旱敏感性，表明UPL4基因编码的蛋白质的活性降低在整个植物界中产生耐旱表型。因此，预测UPL4基于同源性检索和特征结构域HECT和犰狳重复序列将能够鉴定植物物种中的植物UPL4同系物。然后，人们可以使用众所周知的方法降低这些植物同系物的蛋白质活性例如，诱变、TDNA或转座子插入、RNAI等，以得到抗旱植物。灰色条具有比黑色条显著更低的值P005。0026图4显示番茄UPL4突变体的干旱表型。对于干旱实验，使用含有纯合型、杂合型和野生型等位基因的分离的M2种群。在干旱处理开始之后21天拍摄的相片显示野生型番茄植物右和携带SLG98247中V158E突变的植物左。与野生型等位基因相。
23、比，携带SLG98247中V158E突变的植物的耐旱表型和干旱处理的存活率显著地更好P01，表明蛋白质的这一改变引起番茄出现耐旱表型。说明书CN104160030A4/19页70027定义0028在下述说明和实施例中，使用大量术语。为了提供对说明书和权利要求书包括给出的这类术语的范围的清楚一致的理解，提供下述定义。除非本文另有定义，否则使用的所有技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献的全部内容通过引用合并于此。0029实施用于本发明方法中的常规技术的方法将对普通技术人员是显而易见的。本领域技术人员熟知分子生物学、生。
24、物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、序列和相关领域中常规技术的实践，并且在例如下述文献参考中讨论SAMBROOK等，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,2NDEDITION,COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,COLDSPRINGHARBOR,NY,1989；AUSUBEL等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JOHNWILEYSONS,NEWYORK,1987及定期更新；和THESERIESMETHODSINENZYMOLOGY,ACADEMICPRESS,SANDIEG。
25、O。0030在该文件及其权利要求书中，动词“包括”及其变化形式以非限定含义使用，意味着包括该术语后的项目，但是不排除没有明确提及的项目。其涵盖动词“基本上由组成”以及“由组成“。0031除非上下文另有清楚的规定，如本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示。例如，如上述使用的用于分离“一个”DNA分子的方法包括分离多个分子例如，数十个、数百个、数千个、数万个、数十万个、数百万个、或更多分子。0032对齐ALIGNING和比对ALIGNMENT术语“对齐”和“比对”指根据相同或相似核苷酸的短或长的延伸的存在，比较两个或更多个核苷酸序列。本领域已知一些核苷酸序列比对的方法，如下进一。
26、步解释。0033“基因表达”指可操作地连接到合适的调节区尤其是启动子的DNA区域转录成RNA的过程，该RNA有生物活性，即能够翻译成生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。“异位表达”指在其中通常基因不表达的组织中的表达。“蛋白质表达”在本文中与术语基因表达可互换地使用。其指可操作地连接到合适的调节区尤其是启动子的DNA区转录成MRNA，然后翻译成蛋白质或肽或活性肽片段的过程。0034与UPL4蛋白质或变体，例如直系同系物或突变体、及片段有关的“功能性”指基因和/或编码蛋白质改良定量和/或定性抗旱性的能力，例如通过改良植物中基因的表达水平例如通过过表达或沉默。例如，可以通过各种方法检测从植物物种X获得。
27、的UPL4蛋白质的功能性。优选地，如果蛋白质是功能性的，则植物物种X中编码该蛋白质的基因的沉默，例如使用基因沉默载体，将导致抗旱性改善，如通过本文的详细阐述检测。而且，用功能性UPL4蛋白质互补UPL4敲除将能够修复或赋予该特性，在此情形中将恢复干旱敏感性。本领域技术人员在检测功能性方面没有任何困难。0035术语“基因”指包含区域转录区的DNA序列，其被转录为可操作地连接至合适的调控区例如启动子的细胞中RNA分子例如MRNA。因此，基因可以包括几个可操作地连接的序列，例如启动子、5前导序列包含例如参与翻译起始的序列、蛋白质编码区CDNA或基因组DNA和3非翻译序列包含例如转录终止序列位点。00。
28、36术语“CDNA”指互补DNA。互补DNA是通过将RNA逆转录成互补DNA序列制备的。因此，CDNA序列对应于从基因表达的RNA序列。由于当从基因组表达时MRNA序列可能受到说明书CN104160030A5/19页8剪切，即在细胞质中翻译成蛋白质之前，内含子被从MRNA剪切掉且外显子连接在一起，应当理解CDNA的表达指编码CDNA的MRNA的表达。因此，CDNA序列可能与其对应的基因组DNA序列不相同，因为CDNA可能仅编码蛋白质的完全开放读码框由连接的外显子构成，而基因组DNA编码，并且外显子中散布内含子序列。因此，遗传修饰编码CDNA的基因可能不仅涉及修饰对应于CDNA的序列，而且也可能。
29、涉及使基因组DNA的内含子序列和/或该基因的其它基因调控序列的突变，只要其造成基因表达的破坏。0037“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的测量。通常，比对序列，以便获得最高位匹配。“同一性”本身具有领域公知的含义，并且可以使用公开的技术计算。参见，例如COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，LESK,AM编辑，OXFORDUNIVERSITYPRESS，NEWYORK，1988；BIOCOMPUTINGINFORMATICSANDGENOMEPROJECTS，SMITH,DW编著，ACADEMICPRESS，NEWYORK，1993；COMPUTERANALYSI。
30、SOFSEQUENCEDATA，第1部分，GRIFN,AM和GRIFN,HG编辑，HUMANAPRESS，NEWJERSEY，1994；SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY，VONHEINJE,G，ACADEMICPRESS，1987；和SEQUENCEANALYSISPRIMER；GRIBSKOV,M和DEVEREUX,J编辑，MSTOCKTONPRESS，NEWYORK，1991。虽然有多种测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性的方法，但是普通技术人员所熟知该术语“同一性”CARILLO,H和LIPTON,D，SIAMJ，APPLIEDMATH1988481。
31、073。通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于在GUIDETOHUGECOMPUTERS,MARTINJBISHOP编辑，ACADEMICPRESS，SANDIEGO，1994，以及CARILLO,H和LIPTON,D,SIAMJ，APPLIEDMATH1988481073中公开的方法。计算机程序编码了测定同一性和相似性的方法。优选的测定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括，但不限于GCS程序包DEVEREUX,J等，NUCLEICACIDSRESEARCH1984121387，BLASTP、BLASTN、FASTAATSCHUL,SF等，JMOLECBIOL。
32、1990215403。0038作为示例，具有与编码某个序列的多肽的参考核苷酸序列至少例如95“同一性”的核苷酸序列多核苷酸，表示该多核苷酸序列除了可以相对于每100个参考多肽序列的核苷酸包括至多5点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。因此，在参考核酸序列的全长上计算核苷酸序列与参考核酸序列的同一性百分比。换句话说，为了获得与参考核苷酸序列具有至少95同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5的核苷酸可以缺失和/或被另外的核苷酸取代，和/或参考序列中总核苷酸的至多5的数目核苷酸可以插入到参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5或3末端位置上，或者这两种末端位置之间。
33、的任何位置上，单个散布在参考序列的核苷酸之间或参考序列的一个或多个邻接组内。0039类似地，具有与SEQIDNO2的参考核苷酸序列至少例如95“同一性”的氨基酸序列的多肽，表示该多肽序列除了可以相对于SEQIDNO2的参考氨基酸的每100个氨基酸包括至多5个氨基酸改变之外，该多肽的氨基酸序列与参考序列相同。因此，在参考氨基酸序列的全长上计算氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性百分比。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少95同一性的氨基酸序列的多肽，参考序列中至多5的氨基酸残基可以缺失和/或被另外的氨基酸残基取代，和/或参考序列中总氨基酸残基的至多5的数目的氨基酸可以插入到参考序列中。参考序。
34、列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者这两种末端位置之间的任何位置上，单个散布在参考说明书CN104160030A6/19页9序列的残基之间或参考序列的一个或多个邻接组内。0040根据本发明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基，分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶、及腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或低聚物参见其全部内容为所有目的通过引用合并于此的ALBERTLLEHNINGER,PRINCIPLESOFBIOCHEMISTRY,AT793800WORTHPUB1982。本发明涵盖任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分、及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。
35、。所述聚合物或低聚物组成上可以是异质的或同质的，并且可以从天然存在来源分离，或人工或合成生成。另外，核苷酸可以是DNA或RNA、或其混合物，并且可以以单链或双链形式永久或短时存在，包括同源双链体、异源双链体和杂交体。0041如本文使用的术语“可操作地连接的”指功能上相关的多核苷酸元件的连接。当核酸置于与另一个核酸序列功能相关时，其是“可操作地连接的”。例如，如果其影响编码序列的转录，则启动子或更确切地转录调节序列与编码序列可操作地连接。可操作地连接可以指连接的DNA序列是邻接的。0042“植物”指完整植物或可从植物获得的植物的一部分，例如细胞、组织或器官例如花粉、种子、配子、根、叶、花、花蕾、。
36、花粉囊、果实等，以及这些的任何衍生物及通过自交或杂交衍生自这类植物的后代。“植物细胞”包括分离物中或组织、器官或生物体之内的原生质体、配子、悬浮培养物、小孢子、花粉粒等。0043如本文使用的术语“启动子”指核酸片段，其起控制一个或多个基因的转录的作用，相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游，并且从结构上识别为存在DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列，包括，但不限于转录因子结合位点、遏制子或激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知直接或间接地调节从该启动子转录的量的任何其它核苷酸序列。可选择地，术语“启动子”在本文中也包括5UTR区5非翻译区例如启动子在本文中可包。
37、括基因的翻译起始密码子的一个或多个上游部分5，因为该区域可在调节转录和/或翻译方面有作用。“组成型”启动子是在大部分生理和发育条件下在大部分组织中有活性的启动子。“可诱导的”启动子是生理地例如通过外部应用某些化合物或发育调节的启动子。“组织特异性”启动子仅仅在特定类型的组织或细胞中有活性。“植物或植物细胞中的启动子活性”指启动子在植物或植物细胞内驱动转录的启动子的一般能力。其没做出有关于启动子的时空活性的任何暗示。0044术语“蛋白质”或“多肽”可互换地使用，并且指由氨基酸链组成的分子，与具体作用方式、尺寸、3维结构或来源无关。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍然可以称为“蛋白质”。“分离蛋白。
38、”用于指不再位于其自然环境中的蛋白质，例如位于体外或重组的细菌或植物宿主细胞中。0045“转基因植物”或“转化植物”在本文中指例如通过将非沉默突变引入内源基因或其部分中而已经转化的植物或植物细胞。这样的植物已经遗传修饰，以例如在基因中引入一个或多个突变、插入和/或缺失和/或在基因组中引入基因沉默构建物。转基因的植物细胞可以指处于分离物或组织培养中的植物细胞，或者包含在植物或分化的器官或组织中的植物细胞，这两种都可能性都明确地包括在本文中。因此，在说明书或权利要求书中提及植物细胞不是仅指培养物中分离的细胞或原生质体，而且指任何植物细胞，无论其位于任何位置，或在任何类型的植物组织或器官中。说明书C。
39、N104160030A7/19页100046靶核苷酸交换TNE是一种方法，通过该方法一条与染色体或附加体基因中的位点部分互补的合成寡核苷酸在特定位点引导单个核苷酸的逆转。已经描述了TNE使用多种寡核苷酸和靶标。一些报道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合体，含有末端修饰以赋予核酸酶耐受性。0047如本文使用的术语“干旱胁迫”或“干旱”指与植物对水可获得性受限有关的次佳SUBOPTIMAL环境条件。当例如不下雨或下雨少和/或当植物的灌溉常常比所需更少时，可能出现水可获得性受限。当例如土壤中存在水但植物不能有效地吸取时，也可能出现植物对水的可获得性受限。例如，当土壤强结合水时或水具有高含盐量时，植物可能。
40、更难从土壤吸取水。因此，许多因素可能有助于导致植物的水可获得性受限，即干旱。植物经历“干旱”或“干旱胁迫”的影响可能是植物不能具有最佳生长和/或发育。经历干旱的植物可具有枯萎症状。例如，植物可以在其中不提供水例如，没有降雨和/或灌溉植物的特定控制条件经历至少15天的时期。0048术语“改善的抗旱性”指当具有改善的抗旱性的植物经历干旱或干旱胁迫时，不会显示如没有具有改善的抗旱性的植物中观察到的影响或显示减轻的影响。正常植物具有一定水平的抗旱性。通过在所选控制条件下比较对照植物与具有改善的抗旱性的植物，可容易地确定植物是否具有改善的抗旱性，因此，在一定时期之后，即当植物经历干旱或干旱胁迫时，可以观。
41、察到对照植物干旱症状。与对照植物相比，具有改善的抗旱性的植物将显示较少和/或减少的已经历干旱的症状，例如枯萎。本领域技术人员知道如何选择合适的条件，例如像实施例中的控制条件。当植物具有“改善的抗旱性”时，经干旱或干旱胁迫时能够持续正常生长和/或正常发育，否则将导致正常植物的生长减慢和/或发育减慢。因此，“改善的抗旱性”是通过比较植物而确定的相对术语，其中在干旱胁迫下最能够持续正常生长的植物是具有“改善的抗旱性”的植物。本领域技术人员熟知如何选择用于测定植物抗旱性的合适条件和如何测量干旱症状，例如在例如如下提供的手册描述的IRRI，BREEDINGRICEFORDROUGHTPRONEENVIR。
42、ONMENTS，FISCHER等，2003，和CIMMYT，BREEDINGFORDROUGHTANDNITROGENSTRESSTOLERANCEINMAIZEFROMTHEORYTOPRACTICE，BANZINGER等，2000。SNOW和TINGEY，1985，PLANTPHYSIOL，77，6027，和HARB等，ANALYSISOFDROUGHTSTRESSINARABIDOPSIS，AOP2010，PLANTPHYSIOLOGYREVIEW中提供了测定植物改善的抗旱性的方法的实例，并且如下述实施例部分中描述的。具体实施方式0049本发明涉及通过破坏所述植物中功能性UPL4蛋白质的。
43、表达来改善植物的抗旱性。改善是相对于其中这样的改变没有被引入或不存在且其中功能性UPL4蛋白质的表达未受损的对照植物而言。换句话说，与对照植物，即非改变的植物相比，根据本发明改变的植物能够在水可获得性减少、暂时性缺水或干旱条件下较好地生长和存活。应理解，根据本发明改变例如破坏功能性UPL4蛋白质的表达可包括遗传修饰，例如遗传修饰UPL4基因表达或靶核苷酸交换。0050遗传修饰包括在感兴趣的核酸序列中引入突变、插入、缺失和/或将基因沉默构造插入靶向感兴趣的核酸序列的植物或植物细胞的基因组中。遗传修饰编码MRNA的核酸序列例如基因不仅涉及修饰对应于MRNA序列的外显子序列，而且涉及使基因组DNA的。
44、说明书CN104160030A108/19页11内含子序列和/或核酸序列的其它基因调节序列例如基因的突变。0051在本发明的上下文中，功能性UPL4蛋白质可以是如下蛋白质当在具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系，例如本文列举的AT5G02880敲除系，如SALK_091246CHTTP/WWWARABIDOPSISORG/SERVLETS/SEEDSEARCHERACTIONDETAILSTOCK_NUMBERSALK_091246C中表达时，产生与其中所述功能性UPL4蛋白质未表达的、具有被破坏的内源性UPL4基因的拟南芥TDNA插入系例如AT5G02880敲除系，如SALK。
45、_091246C的抗旱性相比抗旱性受损的植物。0052如本文使用的术语“被破坏的内源性UPL4基因”指被破坏例如切断例如利用TDNA插入所述UPL4基因中的方式植物基因组中的天然存在的UPL4基因。破坏所述内源性UPL4基因可以导致所述内源性UPL4基因不表达，因此，不存在内源性UPL4蛋白质功能性的或非功能性的。0053如本文使用的术语“对照植物”指相同种类的植物，优选相同种类，优选相同遗传学背景的植物。0054本发明还涉及通过修饰所述植物中功能性UPL4蛋白质的表达而调节植物的抗旱性。调节是相对于其中这种修饰没有被引入或不存在的对照植物优选地相同种类和/或品种的，并且优选相同遗传学背景而言。
46、的。0055在一个方面，本发明提供一种生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，其包括破坏植物中UPL蛋白质的表达的步骤，所述UPL蛋白质包括包含至少一个根据PF00632的PFAMHECT结构域和至少一个根据模型SSF48371的超家族ARM重复单元的氨基酸序列。0056在另一个方面，本发明涉及一种用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，该方法包括破坏所述植物中功能性UPL4蛋白质表达的步骤。0057如本文使用的“使功能性UPL4蛋白质的表达受损”可以指UPL4基因的表达受损，和/或UPL4基因的表达正常，但是得到的MRNA的翻译被抑制或阻止例如，通过RNA干扰，和/或UP。
47、L4蛋白质的氨基酸序列改变，使得优选地在生理条件下，尤其是在相同的生理条件下，与如SEQIDNO2所述蛋白质的泛素蛋白连接酶比活性相比，其泛素蛋白连接酶比活性降低。备选地，UPL4蛋白质可以通过使用UPL4抑制剂，例如特异性结合所述UPL4蛋白质的抗体，或其它UPL4抑制剂例如中止、阻止、或降低UPL4蛋白质的活性的蛋白质或化学抑制剂例如离子、或金属，或辅助因子清除SCAVENGING其而变成无功能的或较少功能的。例如，特异性集合所述UPL4蛋白质的抗体可以与所述UPL4蛋白质同时表达，从而降低其比活性。如果UPL4蛋白质的泛素蛋白连接酶比活性统计学显著地低于如SEQIDNO2中所述蛋白质的泛。
48、素蛋白连接酶比活性，则可认为该蛋白质的泛素蛋白连接酶比活性“降低”。UPL4蛋白质的泛素蛋白连接酶比活性可以例如降低至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多。可以通过例如使用定向诱变来改变启动子序列，实现植物的内源性UPL4基因的表达减少。本领域技术人员能够基于常规方法确定泛素蛋白连接酶比活性。0058本发明人相信由于低表达，例如通过RNA干扰，或者降低UPL4蛋白质的活性/功能性，或上述一种或多种，破坏功能性UPL4蛋白质的表达例如通过表达和/或活性的降低、抑制或缺失导致功能性UPL4蛋白质不存在或水平降低，并且所述功能性UPL4蛋白质说明书CN104160030A。
49、119/19页12不存在或水平降低导致所述植物对水的需要的减少或抗旱性改善。0059已知泛素蛋白连接酶蛋白质UPL参与酵母菌和动物中调节蛋白的选择性降解HUIBREGTSE等，1995PROCNATLACADSCIUSA92,25632567；PICKART2001ANNUREVBIOCHEM70,503533。用多个泛素链修饰呈递用于降解的蛋白质，然后被26S蛋白酶体识别。这些泛素蛋白连接酶蛋白质的一个重要类型是由HECTE3S形成的，其包括在C末端称为HECT结构域的保守的350个氨基酸结构域基于其与人E6相关蛋白E6AP的C末端的同源性HUIBREGTSE等，1995PROCNATLACADSCIUSA,92,25632567。HECT结构域包括围绕催化泛素转移所需位置不变的半胱氨酸的高度保守区。0060根据DOWNES等2003,PLANTJ35,729742，植物也含有HECTE3S，拟南芥中存在7个UPL1、UPL2、UPL3、UPL4、UPL5、UPL6和UPL7。DOWNES等进一步描述了可以基于相应基因的内含子/外显子位置、蛋白质序列和长度、以及HECT结构域的上游存在另外的蛋白质基序将UPL1、UPL2、UPL3、UPL4、UPL5、UPL6和UPL7按结构分成四个子。