一种种子特异性表达的启动子和 利用该启动子培育高油酸油菜的方法 本发明涉及一种种子特异性表达的启动子和利用该启动子培育高油酸油菜的方法。
随着分子生物学技术的发展，植物基因工程的研究热点已从抗病、抗逆性研究逐渐转向植物生理代谢调控研究。目前生理代谢调控基因工程的焦点主要集中于三方面，即脂肪酸代谢途径、淀粉合成途径及氨基酸合成途径。在对这三个代谢途径透彻了解的基础上，克隆了一大批调控酶相关基因，这为利用基因工程手段调控这些代谢途径以获得优质、营养的食品及廉价的化工原料奠定了坚实的基础。在这类基因工程研究中，人们主要受益于植物的种子，因此，种子特异性表达启动子的克隆便成为展开此类研究的前提。
在我国，植物基因工程研究正进行得如火如荼，但主要研究范围仍集中于抗病、抗逆领域，而在利用基因工程调控植物生理代谢方面仍是一片空白，因此国内至今尚无类似的种子特异表达基因启动子克隆的相关报道。本专利涉及的甘蓝型油菜BcNA1启动子不但为国内植物生理代谢(脂肪酸代谢、糖代谢、氨基酸代谢)基因工程的研究准备了必要元件，同时也为利用基因工程手段在抗病、耐藏等方面改善作物种子品质提供了前提，在医药生产、保健品开发及转基因技术中具有广阔的应用前景。
另一方面，随着生活水平的不断提高，人们对食品的营养要求也越来越高。由于长期摄入大量饱和脂肪酸会导致高血压、冠心病，而植物油地饱和脂肪酸含量较动物脂肪少40～50％，因此目前人们对脂肪酸的摄入逐渐由动物脂肪转向植物油。然而植物油中多不饱和脂肪酸的存在，不但使其保存期缩短，还增加了烹饪过程中的不稳定性，这类植物油往往要经过部分氢化来减少多不饱和脂肪酸的含量。通常人们通过水合作用去掉一些双键来降低多不饱和脂肪酸的含量，在此过程中，自然形成的顺式双键变成反式构象，这种反式不饱和脂肪酸是引起冠心病的主要因素之一。因此，使植物天然合成单不饱和脂肪酸(仅含一个双键)，如油酸(18∶1)，将是解决以上各种问题的最佳途径。
本发明的一个目的是提供一种种子特异性表达启动子，该启动子具有如图1所述的序列。
本发明的另一个目的是提供一种利用本发明的种子特异性表达启动子培育高油酸油菜的方法。
有关研究表明，Napin蛋白是一类由多基因家族编码的蛋白质，它们广泛存在于芸薹属植物(如甘蓝型油菜和白菜型油菜)的种子里，占种子蛋白总量的20-30％。我们利用PCR方法，首次以甘蓝型油菜H165的总DNA为模板，克隆了甘蓝型油菜的一种napin基因启动子，BcNA1启动子，序列分析表明，此DNA片段含有1752个核苷酸，其序列如图1所示。实验结果表明，该启动子具有种子特异性表达的功能，同时，根据其序列特点，分析认为，此调控序列的部分片段(从第871-1752个核苷酸)同样具有种子特异表达的特性。
根据研究结果，我们认为该启动子的适用范围较广，它不但是大多数十字花科植物的内源序列，而且还可以在茄科植物(如烟草)中启动外源基因的种子特异性表达，同时，我们也不排除它在其他植物中具有类似的调控功能。
本发明还提供了一种利用本发明的种子特异性表达启动子培育高油酸油菜的方法，该方法包括：
(1)将本发明的种子特异性表达启动子与反向的油酸脱饱和酶基因(Fad2基因)(Okuley J，et al.Plant Cell，1994，6：147.)相连，并将连接后的基因与一种载体相连，构建植物表达载体；
(2)将所构建的植物表达载体导入油菜组织；
(3)将转化的植物组织培育成植株。
在本发明的方法中，所使用的载体可以是现有技术中已知的能够在植物中进行表达的任何一种载体。构建后的表达载体可以以现有技术中任何一种转化方法转化油菜组织，例如pCAMBIA1301。例如，可以采用农杆菌介导法。对所使用的油菜品种没有特殊限定，可以是例如甘蓝型油菜，如H165。所使用的油菜的组织可以是任何一种可以进行再生的组织，例如，油菜子叶柄。转化后的油菜组织可通过已知的方法培育成植株。对成功转化的油菜植株可进行分子生物学检测，确定转基因植株。对转基因油菜可进行人工同株异花授粉，得到转基因油菜种子。对转基因油菜种子进行质谱及色谱分析，测定种子中各种脂肪酸含量。
我们将以上的甘蓝型油菜BcNA1基因启动子与反向的油酸脱饱和酶基因相连构建载体并转化油菜，培育出了种子中平均油酸含量高达68.72％的油菜，为油菜的脂肪酸基因工程研究提供了可贵的方法和经验，不但开创了我国在脂肪酸代谢基因工程研究的新局面，还为国际上相关研究提供了有力的实验依据。附图简要说明图1是甘蓝型油菜H165(Brassica napus cv.H165)的BcNA1启动子序列图2是本发明的表达载体的构建流程图实施例
下文将通过实施例对本专利做进一步的说明。
实施例I：甘蓝型油菜BcNA1基因启动子的克隆及其在转基因烟草中对GUS基因表达调控的研究。
1.甘蓝型油菜BcNA1基因启动子的克隆：
设计并合成如下两个引物：
引物1：5’-GCGAAGCTTGATATCACTACAATGTCGGA-3’
HindIII
引物2：5’-CGCGTCGACTTGTGTATGTTCTGTAGTGA-3’
SalI
两个引物的5’端分别引入了HindIII位点和SalI位点。以甘蓝型油菜H165总DNA为摸板，94℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 1min，63℃2min，共3个循环；然后94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min共32个循环；72℃ 10min扩增，即可产生1.75kb的DNA片段(BcNA1启动子)。将此DNA片段经HindIII和SalI酶切后与经同样酶切的pBluescript SK相连，用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组质粒pSB，进行PCR及酶切鉴定，确证pSB为含有BcNA1基因启动子的重组质粒。
2.植物表达载体pBIB的构建
提取以上pSB质粒，经HindIII与SalI酶切后，释放出BcNA1启动子片段，与经过同样酶切的植物表达载体pPZP222相连，产生过渡质粒pPZP-pro45；再将pPZP-pro45经HindIII与BamHI酶切，回收1.75kb的BcNA1启动子片段，与经HindIII和BamHI酶切的pBI121产生的载体大片段部分相连，最终构建成含有BcNA1启动子和GUS基因的植物表达载体pBIB。
3.农杆菌介导的烟草的遗传转化
利用冻融法将植物表达载体pBIB转入根癌农杆菌LBA4404，转化方法参照Hofen(1988)。
烟草的转化参照Horsch等(1988)的叶盘法进行。转化受体为烟草(Nicotiana tabacumcv.Sumson)。将过夜培养的农杆菌LBA4404(含质粒pBIB)菌液用MS液体培养基稀释5-10倍，将剪成0.5cm2左右的烟草叶片在上述菌液中浸泡5分钟后，吸干多余菌液，25-28℃暗培养36-40小时。
共培养后的叶片转至筛选培养基上，25℃、每日16小时光照/8小时黑暗条件下培养，待芽长出并达5cm高时，将其转移到生根培养基上，使其生根。共筛选得到152株生长茁壮、根系发育良好的再生烟草苗。将其中18棵移入花盆全部成活。待再生苗长到20cm左右，在阴雨天气将其移栽至本所试验田，成活16棵。在烟草开花前两天用一较大的羊皮纸杂交袋罩住花序，直至开花7天后再取下，确保自花受粉。
4.转基因烟草的分子生物学检测
用CTAB法提取植物总DNA，用克隆BcNA1基因启动子所用引物(引物1、引物2)进行PCR扩增，结果表明，对照植株均不能扩增产生1.75kb的条带，说明未转化植株本身不含有BcNA1启动子序列。而在22株再生抗性植株中，共有18株扩增出1.75kb的条带，与植物表达载体pBIB扩增产生的条带在同一位置，初步确定此18株为转基因植株。
选取9棵PCR检测阳性的转基因烟草苗与2棵对照植株(非转化植株)，大量提取植物总DNA，并依照Boehringer Mannheim公司的The PCRDIG Probe Synthesis Kit说明书制备BcNA1启动子探针，然后按Boehringer Mannhein公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit与CSPD使用方法进行杂交与检测。发现这9棵转基因烟草均有明显的Southern杂交信号，而且其中2株还产生了多条杂交带，如TT26有2条杂交带，TT34有5条杂交带，说明在这2株转基因烟草中，至少含有2个或5个拷贝的外源BcNA1启动子。而所选取的2棵对照植株均无杂交信号产生，进一步表明烟草本身中并不存在BcNA1启动子及其同源序列。
5.转基因烟草GUS基因表达分析
5.1 GUS基因表达的荧光检测分析
将植物材料(根、茎、叶、花、种子)经液氮处理后加3倍体积的提取缓冲液(50mmol/L Na3PO4(pH7.0)，10mmol/L EDTA，0.1％TritonX-100，10mmol/L β-巯基乙醇，20％甘油，5％BSA)，匀浆，离心取上清，即为GUS粗酶提取液。在Eppendorf管中加1ml预热的反应液(提取缓冲液中加入1mmol/L MUG)，再加入2-100μl提取缓冲液(加入量视样品浓度而定)，混匀，在37℃下进行反应，于反应开始后不同时间取样各100μl，注入盛有0.9ml反应终止液(0.2mmol/L Na2CO3)的离心管中，终止反应，用HITACHI F4000型荧光光度在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测各样品的荧光。结果发现，与对照植株相比，转基因烟草的根、茎、叶和花的提取液并未发现较高的GUS酶活性，由此可知GUS基因并未在这些器官中表达。而种子提取液的荧光检测结果表明，与非转基因烟草相比，转基因植株的种子表现出了较高的GUS酶活性，多拷贝插入的转基因植株(如TT26、TT34)种子GUS酶活性较单拷贝插入的转基因植株明显增高，转基因烟草种子的最高GUS酶活性与对照相比，大约是后者6-25倍，表明甘蓝型油菜BcNA1启动子能启动外源基因在转基因植株种子中特异性地高效表达，而且这种表达是显性的，因为GUS基因单拷贝插入便可产生种子特异性表达，表现出GUS酶活性。
5.2转基因烟草种子GUS基因表达的组织化学分析
取外源基因单拷贝插入的转基因烟草开花后15天所生成的种子，在固定液(1-2％甲醛，50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，0.05％TritonX-100)中固定30-60分钟后，再用50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)漂洗3次，每次15分钟。用锋利的双面刀片将种子粒切成两半，其中一半投入加X-Gluc染色液的离心管中，37℃水浴2-24小时；另一半弃去不用。弃去染色液，分别统计被染成蓝色或未被染成蓝色的种子数目。结果发现，将切开的转基因种子放入X-Gluc染色液，37℃保温30分钟即可看到一部分种子的切面呈现蓝色，而非转基因种子即使在37℃保温20小时也未变成蓝色，而且在选取的三株转基因烟草的种子中，被染成蓝色与未被染成蓝色的数值之比分别为2.88、3.10和3.00，根据X2检测，它们与理论比3/1均无显著差异，由此可知，此专利涉及的BcNA1启动子确实能启动外源基因在种子中特异高效地表达，而且其遗传传递方式与孟德尔遗传定律相一致。
实施例2农杆菌介导的油菜的遗传转化及转基因高油酸油菜的获得
1.拟南芥油酸脱饱和酶基因(Fad2基因)的克隆
设计并合成以两个引物，引物两端分别引入了SacI位点和SalI位点：
引物59618#：5’-AGAGAGCTCAAACATGGGTGCAGGTGG-3’
SacI
引物59619#：5’-GGCGTCGACAATTTCACCATCAT-3’
SalI
取拟南芥一株幼苗，按文献(傅荣昭等，1994)小量提取植物总DNA，以总DNA为模板，95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 1min，63℃ 2min，共3个循环；然后94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 2min共32个循环；72℃ 10min扩增基因编码区。PCR产物回收后，按使用说明与pEGM-T vector连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取质粒pTF，进行酶切及PCR检测，确证此质粒是含有Fad2基因的重组克隆。Fad2基因序列见参考文献(Okuley等，1994)。
2.植物表达载体pCBF的构建
在pCB1301(Hajadukiewicz等，1994)的多克隆位点附近无启动子和终止子，故先用BamHI和EcoRI将pBLG上的β-1，3-葡聚糖酶基因与Nos终止子切下，回收片段，插入pCB1301中，构建形成pCG；再用SalI和SacI将Fad2基因从克隆载体中切下，反向插入到经同样酶切的pCG中，同时将β-1，3-葡聚糖酶基因替换，构建形成pCF；最后用HindIII和SalI将BcNA1基因启动子从克隆载体切下，插入到经同样酶切的pCF中，形成pCBF。经PCR及多种酶切鉴定，确证pCBF为包含种子特异表达启动子及反义Fad2基因的植物表达载体。载体pCBF构建流程图见图2。
3.农杆菌介导的油菜的遗传转化及转基因油菜的获得
选用甘蓝型油菜H165为转化受体。将油菜种子灭菌后接种于MS培养基上，待种子萌发4-5天后，切取幼苗的子叶柄进行农杆菌侵染。含有植物表达载体pCBF的农杆菌LBA4404摇菌20小时左右，再将菌液稀释，感染子叶柄，之后将其转入筛选培养基共培养1-2天，转到加有潮霉素的筛选培养基上进行筛选，当再生苗长至3-4厘米时，即可转入生根培养基上诱导生根，待根系发育茁壮再将其移入花盆或试验田。共得到11株再生油菜苗。在转基因植株开花期间严格控制杂交，实行同株异花人工授粉，种子成熟后单株收种。
4.转基因油菜的分子生物学检测
提取油菜再生苗的总DNA，用BcNA1启动子的5’端引物(引物1)与Fad2基因的5’引物(引物59618#)进行PCR扩增，发现得到的11棵再生植株中，有7棵扩增产生了2.95kb的条带。大量提取PCR阳性的转基因植株与对照植株的总DNA，用EcoRI充分酶切后与Fad2基因探针进行Southern杂交检测，结果转基因植株与对照植株(未转化植株)中均有一条分子量较小的杂交条带产生，另外，在7株被测转基因植株中，还出现了大小不等的杂交条带，证明载体pCBF的Fad2基因已整合至油菜的基因组上，产生了杂交信号。
5.转基因油菜种子脂肪酸含量分析
取转基因油菜及对照植株所结种子各40粒，在研钵中研细后用滤纸包起，放入抽提瓶中，加入石油醚提取植物油。将植物油皂化和酯化后用质谱仪测各种脂肪酸含量。发现在转基因油菜种子中，某些脂肪酸含量发生变化，表现为(1)大多数转基因植株产生种子中油酸含量有了明显的增加，最高油酸含量为种子脂肪酸总量的68.72％，分别比对照的47.26％和45.28％升高了21.64％和23.44％；(2)油酸含量的升高与亚油酸含量的降低呈明显的一致关系，如在油酸含量最高的TB7中，亚油酸的含量最低，仅为5.02％，比对照的24.37％和24.07％分别降低了19.35％和19.05％。(4)转基因油菜油酸含量的升高与亚麻酸含量的降低有一致性，同时还与硬脂酸含量的增加有一定的相关性。这些结果充分说明，在甘蓝型油菜BcNA1启动子的调控下，反义Fad2基因在种子中特异表达，对油菜内源油酸脱饱和酶基因的表达产生了抑制，使种子脂肪酸含量发生变化。
参考文献：1.Hofen R，Willmitzer L.Storage of competent cells for Agrobacterium transformation.Nucl.Acids Res.，1988，16：9877.2.Horsch R B，Fry J E，Hoffman N L，Eicholtz D，Rogers S G，Fraley R T.Science，1985，227：1229-1231.3.Okuley J，et al.Plant Cell，1994，6：147.4.Hajdukiewicz，et al.Plant Molecular Biology，1994(25)：989-994.5.傅荣昭等，植物遗传转化手册，1994，北京：中国科学技术出版社。6.蓝海燕等，生物工程学报，1998，14(3)：63-69。