一种测定巯基蛋白酶酶活的方法及其专用稳定溶液 【技术领域】
本发明涉及酶活力测定方法及其专用稳定溶液，特别是涉及一种巯基蛋白酶活力测定的方法及其专用稳定溶液。
背景技术
使用巯基蛋白酶进行红细胞血型、免疫性血型抗体检定已有近60年的应用历史。木瓜蛋白酶(Papain)、菠萝蛋白酶(Bromelein)和无花果蛋白酶(Ficin)是几种常用的血型血清学使用的巯基蛋白酶。
酶活力效价的标化是涉及体外血型血清实验检定质量的关键内容，国际众多学者，如R，Lsmbert(Medical Sciences 1978；35：233)、PK Phillips(J ClinPathol 1988；45：7)、M.L.Scoott(Medical Laboratory Sciences 1988；45：7)等人都曾报道过血型血清学使用的巯基蛋白酶的活力效价分析方法，但这些活力效价分析方法与体外血型血清检定实验方法差距较远，如ISBT/ICSH-1994工作条约显示：用M.L.Scoott等人的报道方法标化的木瓜蛋白酶试剂进行的体外血型血清学实验检定会产生“假阳性”反应。
【发明内容】
本发明地目的是提供一种较准确地测定巯基蛋白酶活力效价的方法及其专用稳定溶液。
本发明所提供的巯基蛋白酶的稳定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mmol/L普鲁兰。
为了增加巯基蛋白酶在溶液中的稳定性，所述稳定溶液一般还含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二钾和0.2-0.3mol/L甘露醇。
磷酸盐优选的是磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物，所述磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的摩尔比为20-22∶1。
稳定溶液的pH为5.3-5.7。
本发明所提供的测定巯基蛋白酶活力效价的方法，是用巯基蛋白酶、专用稳定溶液配制的酶样品，用pH6.8-7.2的1-2％偶氮化白蛋白(底物溶液)溶液与酶样品溶液在36.5-37.5℃反应10分钟，在430nm测定OD值，计算酶活力效价；所述巯基蛋白酶的稳定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普鲁兰。
所述底物溶液是用偶氮化白蛋白、磷酸盐溶液配制的，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物，它们的摩尔比为1.5-2.5∶1。
在上述内容的基础上，酶活力效价测定的具体步骤包括：
1)将浓度为30-40mg/100ml的样品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中预热10分钟；
2)将底物溶液和样品溶液按体积比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反应10分钟；
3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；
4)离心取上清液，加入等体积的0.5mol/L氢氧化钠溶液；
5)在430nm测定酶水解液OD值。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下优点：
1、使用了较强的缓冲体系，将酶反应过程的pH控制在了7.0±0.1范围内，降低了测量不定度。
2、由0.06-0.08mol/L磷酸盐、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸、0.05-0.10mmol/L普鲁兰配制酶原料的样品溶液，对酶样品的激活、酶样品溶液的稳定是重要的，可以克服酶样品溶液的活力衰减，降低测量不定度。
3、控制酶与底物的水解反应时间、反应温度、离子强度、pH条件等实验条件，使酶活力效价的测定条件与体外血型血清学实验检定条件保持一致，为体外血型血清学实验检定使用的巯基蛋白酶质量标准评价，以及体外血型血清学实验检定技术的评价提供了数据化保证。
4提出了酶试剂溶液的活力控制标准，10-16U/50μl，或100-160U/50μl。
【具体实施方式】
实施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取与制备
取1000g的番木瓜果浆冰冻物，用微波加热融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)，在匀浆器中匀浆。
加入1％壳聚糖溶液100ml，匀浆搅拌，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。
向滤液中加入硫酸铵至35％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；在上清液中加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟。10000×g离心20分钟，弃去沉淀物；最后再向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，室温静置60分钟，10000×g离心20分钟，收集沉淀物。
将沉淀物用200ml纯水溶解，然后用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜超滤，在超滤过程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的条件下循环超滤1h，得到超滤浓缩液。
向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，混匀。用该磷酸钾缓冲液预先平衡纤维素CM-92色谱柱，然后以5ml/min的速度，将溶液上柱，以0.7mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)为洗脱液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩洗脱液。
向浓缩液加入普鲁兰0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物30g。
实施例2、巯基蛋白酶制剂的制备
本实施例制备了木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的制剂，其中木瓜凝乳蛋白酶为实施例1所得，木瓜酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶为市售商品酶。
一、木瓜凝乳蛋白酶制剂
1配方
普鲁兰 0.048mmol
甘露醇 0.3mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.05mol
木瓜凝乳蛋白酶 200000PU
2、制备工艺及过程
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制剂。
二、木瓜蛋白酶制剂
1配方
普鲁兰 0.05mmol
甘露醇 0.3mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.05mol
木瓜蛋白酶 200000PU
2、制备工艺及过程
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到木瓜蛋白酶制剂。
三、菠萝蛋白酶制剂
1配方
普鲁兰 0.042mmol
甘露醇 0.28mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.055mol
菠萝蛋白酶 200000PU
2、制备工艺及过程
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到菠萝蛋白酶制剂。
四、无花果蛋白酶制剂
1配方
普鲁兰 0.04mmol
甘露醇 0.24mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.05mol
无花果蛋白酶 200000PU
2、制备工艺及过程
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到无花果蛋白酶制剂。
实施例3、巯基蛋白酶原料的活力效价测定
本实施例分别测定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的酶活，其中木瓜凝乳蛋白酶为实施例1所得，木瓜酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶为市售。
1、溶液配制
1)酶激活—稳定剂(pH5.5±0.2)
L-半胱氨酸 0.025mol
乙二胺四乙酸二钾 0.03mol
甘露醇 0.3mol
普鲁兰 0.05mmol
磷酸二氢钾 0.064mol
磷酸氢二钠 0.003mol
将上述溶质溶解于900ml纯水中，用纯水定容至1000ml。
2)样品溶液
分别称取酶样品30mg，用酶激活—稳定剂溶解，稀释至100ml定容。
3)配制底物溶液(pH7.0±0.1)
称取磷酸氢二钠0.93mol，磷酸二氢钠0.06mol，，用蒸馏水溶解，稀释至1000ml定容。称取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于100ml上述磷酸盐溶液中。
2、酶活力效价测定
1)将样品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中预热10min。
2)用加样器吸取底物溶液1.0ml、样品溶液100μl注入试管中，置37℃±0.5℃水浴箱反应10分钟。
3)取出试管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000×g离心5分钟，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml，混合。
5)在430nm下测定该溶液OD值。
6)活力效价定义
在上述条件下，酶样品溶液在430nm产生0.002吸光值的改变为一个酶活力效价单位。
7)活力效价计算公式
公式I：PU＝A/0.002×10×100/10/W
式中：A为吸光度值；
0.002为1酶活力单位；
10为系数；
100为酶样品溶液体积，(ml)；
10为反应时间(分钟)；
W为酶样品重量，(mg)。
公式II：PU＝A/0.002×10×100/W
式中：A为吸光度值；
0.002为1酶活力单位；
10为系数；
100为酶样品溶液的体积(ml)；
W为酶样品重量，(mg)。
按照上述的计算公式I计算酶活力：木瓜凝乳蛋白酶为750PU/mg，木瓜蛋白酶为500PU/mg，菠萝蛋白酶450PU/mg，无花果蛋白酶为480PU/mg。
按照上述的计算公式II计算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶为7500PU/mg，木瓜蛋白酶为5000PU/mg，菠萝蛋白酶4500PU/mg，无花果蛋白酶为4800PU/mg
实施例4巯基蛋白酶制剂活力效价测定
本实施例分别测定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶制剂的活力效价，所测定的酶样品均为本发明实施例2制备。
1溶液配制
1)磷酸盐溶液
磷酸二氢钾 0.064mol
磷酸氢二钠 0.003mol
将上述溶质溶解于900ml纯水中，用纯水定容至1000ml。
2)样品溶液
取标示活力效价同为2000PU规格的木瓜凝乳蛋白酶制剂、木瓜蛋白酶制剂、菠萝蛋白酶制剂和无花果蛋白酶制剂各1瓶，用上述的磷酸盐溶液10毫升溶解，混合均匀。
3)底物溶液(pH7.0±0.1)
称取磷酸氢二钠0.93mol，磷酸二氢钠0.06mol，，用蒸馏水溶解，稀释至1000ml定容。
称取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于100ml上述磷酸盐溶液中。
2、酶活力效价测定
1)将样品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中预热10min。
2)用加样器吸取底物溶液1.0ml、样品溶液100μl注入试管中，置37℃±0.5℃水浴箱反应10分钟。
3)取出试管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000g离心5分钟，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml，混合。
5)在430nm下测定该溶液OD值。
6)活力效价定义
在上述条件下，酶样品溶液在430nm产生0.002吸光值的改变为一个酶活力单位。
7)活力效价的计算公式
公式I：PU＝A/0.002×10×2/10
式中：A为吸光度值；
0.002为1酶活力单位；
10为系数；
2为酶样品溶液体积，ml
10为反应时间(分钟)
公式II：PU＝A/0.002×10×2
式中：A为吸光度值；
0.002为1酶活力单位；
10为系数；
2为酶样品溶液的体积(毫升)；
按照上述的计算公式I计算酶活力：木瓜凝乳蛋白酶制剂的活力效价为2010PU/瓶，木瓜蛋白酶制剂的活力效价为2002PU/瓶、菠萝蛋白酶制剂的活力效价为2004PU/瓶，无花果蛋白酶制剂的活力效价为2012PU/瓶；依照体外血型血清学实验检定灵敏度的评价标准，每50μl上述的巯基蛋白酶试剂溶液所应具备的活力效价为10-16PU。
按照上述的计算公式II计算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶制剂的活力效价为20100PU/瓶，木瓜蛋白酶制剂的活力效价为20020PU/瓶、菠萝蛋白酶制剂的活力效价为20040PU/瓶，无花果蛋白酶制剂的活力效价为20120PU/瓶；依照体外血型血清学实验检定灵敏度的评价标准，每50μl上述的巯基蛋白酶试剂溶液所应具备的活力效价为100-160PU。