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1、10申请公布号CN104087668A43申请公布日20141008CN104087668A21申请号201410323328722申请日20140708C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人北京市农林科学院地址100097北京市海淀区曙光花园中路11北京市农林科学院蔬菜研究中心2443信箱号72发明人于拴仓苏同兵隋光磊张凤兰余阳俊张德双赵岫云卢桂香汪维红徐家炳74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒57摘要本发明公开了大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒。本发明提供了鉴定待测大白菜品种的SS。
2、R引物组，由单独使用的如下28个引物对组成，本发明的实验证明，本发明开发的大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测大白菜品种，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷。51INTCL权利要求书3页说明书14页序列表15页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书14页序列表15页附图3页10申请公布号CN104087668ACN104087668A1/3页21鉴定待测大白菜品种的SSR引物组，由单独使用的如下28个引物对组成BVSSRA011，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；BVSSRA012，其由序列表。
3、中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；BVSSRA013，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；BVSSRA021，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；BVSSRA022，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；BVSSRA023，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；BVSSRA031，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；BVSSRA032，。
4、其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；BVSSRA033，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；BVSSRA041，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；BVSSRA042，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；BVSSRA051，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；BVSSRA052，其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组。
5、成；BVSSRA053，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；BVSSRA061，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；BVSSRA062，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；BVSSRA063，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成；BVSSRA071，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成；BVSSRA072，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列3。
6、8所示的单链DNA分子组成；权利要求书CN104087668A2/3页3BVSSRA073，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单链DNA分子组成；BVSSRA081，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成；BVSSRA082，其由序列表中序列43所示的单链DNA分子和序列表中序列44所示的单链DNA分子组成；BVSSRA083，其由序列表中序列45所示的单链DNA分子和序列表中序列46所示的单链DNA分子组成；BVSSRA091，其由序列表中序列47所示的单链DNA分子和序列表中序列48所示的单链DNA分子组成；BVSS。
7、RA092，其由序列表中序列49所示的单链DNA分子和序列表中序列50所示的单链DNA分子组成；BVSSRA093，其由序列表中序列51所示的单链DNA分子和序列表中序列52所示的单链DNA分子组成；BVSSRA101，其由序列表中序列53所示的单链DNA分子和序列表中序列54所示的单链DNA分子组成；BVSSRA102，其由序列表中序列55所示的单链DNA分子和序列表中序列56所示的单链DNA分子组成。2根据权利要求1所述的引物组，其特征在于每个所述引物对中各条引物的摩尔比为11。3鉴定待测大白菜品种PCR试剂组，由单独使用的28个PCR试剂组成；每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的。
8、一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成；所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为05MOL/L。4鉴定待测大白菜品种的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组。5权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在鉴定待测大白菜品种中的应用。6权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所述的PCR试剂盒在大白菜品种真伪性鉴别中的应用。7鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的方法，包括如下步骤1构建DNA指纹图谱库；所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤1利用权利要求1或2所述的引。
9、物组中的28种引物分别242个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物；2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到242个标准品种不同引物对的电泳图谱；3将242个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT20软件构建242个标准品种DNA指纹图谱，将242个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库；权利要求书CN104087668A3/3页42重复上述1的方法中的13，仅将242个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱；3使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱。
10、为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种；所述242个标准品种为表2和表3所示的品种。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述SSR扩增的模板为待测大白菜的基因组DNA。权利要求书CN104087668A1/14页5大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒。背景技术0002近年来，随着大白菜育种的发展，品种数目急剧增多，存在一品多名和一名多品等现象，如何快速准确地进行。
11、品种鉴定对白菜种业的可持续发展具有重要意义。与田间小区种植鉴定方法相比，DNA指纹图谱技术具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单和周期短等优势。其中以PCR为基础的第二代分子标记技术SSRSIMPLESEQUENCEREPEAT具有共显性、多态性丰富、扩增带型稳定、操作简单及成本低廉等特点，而且白菜基因组测序已完成，使得规模化开发SSR标记成为可能，定位于白菜分子遗传图谱上的SSR标记已超过2000个，这为SSR标记技术应用于大白菜品种鉴定具备了良好的前提条件。0003目前，在玉米上已经开发了以SSR标记为基础的品种DNA指纹检测试剂盒产品，可以简单快速地进行玉米品种的真伪鉴定。但在大。
12、白菜上相应的研究起步较晚，尚无类似的产品出现。发明内容0004本发明的一个目的是提供鉴定待测大白菜品种的SSR引物组。0005本发明提供的引物组，由单独使用的如下28个引物对组成0006BVSSRA011，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；0007BVSSRA012，其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；0008BVSSRA013，其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；0009BVSSRA021，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA。
13、分子组成；0010BVSSRA022，其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；0011BVSSRA023，其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；0012BVSSRA031，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；0013BVSSRA032，其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；0014BVSSRA033，其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；说明书CN104087668A2。
14、/14页60015BVSSRA041，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；0016BVSSRA042，其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；0017BVSSRA051，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；0018BVSSRA052，其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；0019BVSSRA053，其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；0020BVSSRA061，其。
15、由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；0021BVSSRA062，其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；0022BVSSRA063，其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成；0023BVSSRA071，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成；0024BVSSRA072，其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单链DNA分子组成；0025BVSSRA073，其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和。
16、序列表中序列40所示的单链DNA分子组成；0026BVSSRA081，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单链DNA分子组成；0027BVSSRA082，其由序列表中序列43所示的单链DNA分子和序列表中序列44所示的单链DNA分子组成；0028BVSSRA083，其由序列表中序列45所示的单链DNA分子和序列表中序列46所示的单链DNA分子组成；0029BVSSRA091，其由序列表中序列47所示的单链DNA分子和序列表中序列48所示的单链DNA分子组成；0030BVSSRA092，其由序列表中序列49所示的单链DNA分子和序列表中序列50所示的单链DNA分子组成。
17、；0031BVSSRA093，其由序列表中序列51所示的单链DNA分子和序列表中序列52所示的单链DNA分子组成；0032BVSSRA101，其由序列表中序列53所示的单链DNA分子和序列表中序列54所示的单链DNA分子组成；0033BVSSRA102，其由序列表中序列55所示的单链DNA分子和序列表中序列56所示的单链DNA分子组成。0034上述的引物组中，每个所述引物对中各条引物的摩尔比为11。说明书CN104087668A3/14页70035本发明的第二个目的是提供鉴定待测大白菜品种PCR试剂组。0036本发明提供的PCR试剂组，由单独使用的28个PCR试剂组成；0037每个PCR试剂由。
18、上述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成；0038所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为05MOL/L。0039本发明第三个目的是提供鉴定待测大白菜品种的PCR试剂盒。0040本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。0041上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在鉴定待测大白菜品种中的应用也是本发明保护的范围。0042上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在大白菜品种真伪性鉴别中的应用也是本发明保护的范围。0043本发明第三个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的方法。0044本发明提供的方法，包括如下步骤00。
19、451构建DNA指纹图谱库；0046所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤00471利用上述的引物组中的28种引物分别242个标准品种进行SSR扩增，得到不同引物对的SSR扩增产物；00482非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到242个标准品种不同引物对的电泳图谱；00493将242个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT20软件构建242个标准品种DNA指纹图谱，将242个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库；00502重复上述1的方法中的13，仅将242个标准品种替换为待测样本，其余步骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱；00513使用MEGA50软件的U。
20、PGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种；0052所述242个标准品种为表2和表3所示的品种。0053上述方法中，所述SSR扩增的模板为待测大白菜的基因组DNA。0054所述SSR扩增采用TOUCHDOWN程序94预变性5MIN；94变性35S，62复性45S每个循环降低1，72延伸45S，共10个循环；94变性35S，52复性45S，72延伸45S，共23个循。
21、环；72延伸6MIN；12保存。0055本发明的实验证明，本发明开发的大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测大白菜品种和新种质，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，利用该试剂盒还包括大白菜谱带标准，不仅检测结果稳定可靠、操作便捷和成本低廉，而且有利于技术的标准化，尤其是建立了每对引物扩增等位位点的参照标准样品，它是本试剂盒的一个重要组成部分，这为大白菜品种质量监控和品种权保护提供了技术支持。附图说明0056图1为引物BVSSRA013、BVSSRA053和BVSSRA071扩增等位基因的梯度分子量说明书CN104087668A4/14页8标准0057图2为242份品种的基因分型。
22、图0058图3为28对SSR核心引物对242份大白菜品种的聚类结果具体实施方式0059下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0060下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0061实施例1、大白菜28对SSR核心引物及含有其试剂盒的制备0062一、SSR核心引物的制备0063从大白菜2000多对SSR引物中经过大量的筛选试验挑选出来表1所示的28对SSR核心引物。0064表1为28对SSR核心引物序列0065说明书CN104087668A5/14页90066说明书CN104087668A6/14页100067二、检测242份大白菜0068242份大白。
23、菜，类型丰富有春播大白菜和秋播大白菜，包球类型有舒心、合抱、叠抱和拧抱等，球色有白心、黄心和橘红等颜色，基本包括了大白菜主要类型和主要农艺性状，具有较高的遗传多样性。其中，春季播种的大白菜共161份，秋季播种大白菜共81份。0069表2为秋播大白菜列表0070说明书CN104087668A107/14页1100710072表3为春播白菜列表0073说明书CN104087668A118/14页120074说明书CN104087668A129/14页1300751、提取基因组DNA0076将242份大白菜待测品种，采用CTAB法提取待测样品的DNA每份材料各取5株叶片进行混合，经冷冻干燥后磨成粉末。
24、称01G，装入2ML离心管中。每管加入800L65说明书CN104087668A1310/14页14预热的CTAB缓冲液，迅速振荡混匀，放入65水浴锅水浴30MIN，期间至少颠倒混匀一次。再向离心管中加入800L氯仿/异戊醇氯仿异戊醇为241，振荡混匀，静止5MIN后，12000R/MIN离心10MIN。吸600L上清液转入另一只2ML离心管中，加入等体积20预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于20冰箱冷却20MIN，然后10000R/MIN离心5MIN，弃上清。用800L75乙醇漂洗2次，每次10000R/MIN离心5MIN，弃上清液收集沉淀，最后室温下吹干沉淀，加入200LDDH2O溶解DNA。
25、，得到各份大白菜的基因组DNA。00772、PCR扩增0078用实施例1获得的28对SSR核心引物分别对242份大白菜待测品种进行PCR扩增，得到每份大白菜的28种SSR扩增产物。0079上述PCR扩增的反应体系采用20L，其由10L2PCRMIXTRANSGENAS11103、SSR引物上下游引物各1UL，每条引物在反应体系的终浓度均为05MOL/L、2ULDNA模板20NG/UL和水组成；可以作为PCR试剂。0080PCR扩增程序采用TOUCHDOWN程序94预变性5MIN；94变性35S，62复性45S每个循环降低1，72延伸45S，共10个循环；94变性35S，52复性45S，72延伸。
26、45S，共23个循环；72延伸6MIN；12保存。0081得到的SSR扩增产物，将该PCR产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染，通过CALIPERLABCHIP自动核酸分析仪的1KB芯片，得到28对SSR核心引物梯度分子量标准，如表4和图1所示，其中图1从左到右依次为引物BVSSRA013、BVSSRA053和BVSSRA071的梯度分子量标准。0082表4为28对SSR核心引物梯度分子量标准0083说明书CN104087668A1411/14页150084说明书CN104087668A1512/14页160085说明书CN104087668A1613/14页170086取出银染后的凝胶晾。
27、干后扫描成图片保存，根据每对引物扩增等位基因的梯度分子量标准读取待测样品的片段大小，缺失条带记为“”，利用GGT20软件构建了242个品种的基因分型图，即242个品种的DNA指纹图谱，由242个品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库。00873、聚类作图0088取出电泳后的凝胶晾干后扫描成图片保存，数据统计在电泳图的相同迁移率位置上，观察某一引物有无扩增条带，有带记为“1”，无带记为“0”，缺带记为“”，建立0/1数据矩阵图。利用GGT20软件构建了242份杂交品种的基因分型图图2，即242份品种的DNA指纹图谱。0089使用MEGA50软件的UPGMA法对上述242个品种的DNA指纹图谱进。
28、行聚类作图，结果如图3所示，28对SSR核心引物能够完全区分开242份杂交品种，以季节分类为例可分成两类一类主要是春播大白菜浅绿色，均为结球大白菜，绝大多数为半直立包心品种，属于中熟类型；另一类主要是秋播大白菜红色。其中秋播大白菜又分为结球和不结球两种，其中结球品种包括极早熟、早熟、中熟和晚熟类型，最适宜在秋季栽培；不结球品种均为极早熟类型，适宜四季栽培。242份杂交品种绝大部分来源于云南、北京、天津、山东、河北、辽宁等地，即使同一单位选育的品种也至少存在一个位点的差异。且上述划分与白菜实际播种的是一致的。0090上述结果可以看出，28对SSR核心引物组合可以用来品种鉴定或品种真实性鉴定或种质。
29、资源鉴定，具体方法如下0091用28对引物分别对待测样本进行PCR扩增，得到待测样本的28种PCR产物，将上述PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到图谱利用GGT20软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱；0092使用MEGA50软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种。0093可以制备一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的试剂盒，包括。
30、28对引物或者28种PCR试剂。0094实施例2、28对SSR核心引物在鉴定待测大白菜品种中的应用00951、提取基因组DNA0096提取待测大白菜已知为春大白菜津秀1号叶片的基因组DNA。00972、PCR扩增0098按照实施例1的二的2中的方法，用实施例1获得的28对SSR核心引物分别对待测大白菜待测品种进行PCR扩增，得到28种SSR扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到待测大白菜28种SSR扩增产物图谱。00993、聚类0100将图谱利用GGT20软件构建待测样本基因分型图，即待测样本DNA指纹图谱库；说明书CN104087668A1714/14页180101使用MEGA50软件。
31、的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和上述DNA指纹图谱库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种。0102结果待测样本DNA指纹图谱与DNA指纹图谱库中春大白菜津秀1号的DNA指纹图谱一致，说明其为春大白菜津秀1号。说明书CN104087668A181/15页1900010002序列表CN104087668A192/15页200003序列表CN104087668A203/15页210004序列表CN1040876。
32、68A214/15页220005序列表CN104087668A225/15页230006序列表CN104087668A236/15页240007序列表CN104087668A247/15页250008序列表CN104087668A258/15页260009序列表CN104087668A269/15页270010序列表CN104087668A2710/15页280011序列表CN104087668A2811/15页290012序列表CN104087668A2912/15页300013序列表CN104087668A3013/15页310014序列表CN104087668A3114/15页320015序列表CN104087668A3215/15页33序列表CN104087668A331/3页34图1说明书附图CN104087668A342/3页35图2说明书附图CN104087668A353/3页36图3说明书附图CN104087668A36。