一种培育自交系配合力提高玉米的方法.pdf

本发明公开了一种培育自交系配合力提高玉米的方法。本发明提供了ZmDWF4蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在培育自交系配合力提高植物中的应用；所述ZmDWF4蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明克隆得到调控油菜素内酯生物合成酶关键基因ZmDWF4，将其导入玉米中，获得了转基因玉米株系，将转基因玉米株系与来自不同群体自交系杂交获得F1代，对F1植株的株型和穗部性状考种分析，利用转基因植株杂交所得F1代产量显著提高，该转基因阳性植株可用于提高作物的产量，具有重要的经济价值和社会效益。

1.  ZmDWF4蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在培育自交系配合力提高植物或调控植物对氮吸收能力中的应用；
所述ZmDWF4蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ZmDWF4蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

3.  根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述重组载体为所述ZmDWF4蛋白编码基因插入表达载体得到的载体。

4.  根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。

5.  根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：
所述自交系为玉米品种Lx9801、3841、3848、T7、原早3-1、V3H1、S1620、zheng58或S415。

6.  一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将ZmDWF4蛋白编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；
所述转基因植物的自交系配合力高于所述目的植物
或所述转基因植物对氮的吸收能力大于所述目的植物。

7.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的自交系配合力高于所述目的植物为所述转基因植物与自交系亲本杂交得到的名称为杂交子代A的杂交子代的产量高于所述目的植物与所述自交系亲本杂交得到的名称为杂交子代B的杂交子代的产量。

8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述杂交子代A的产量高于所述杂交子代B的产量体现在如下1)-7)中至少一种：
1)所述杂交子代A的株高高于所述杂交子代B的株高；
2)所述杂交子代A的穗长大于所述杂交子代B的穗长；
3)所述杂交子代A的行粒数大于所述杂交子代B的行粒数；
4)所述杂交子代A的穗行数大于所述杂交子代B的穗行数；
5)所述杂交子代A的穗粒数大于所述杂交子代B的穗粒数；
6)所述杂交子代A的千粒重大于所述杂交子代B的千粒重；
7)所述杂交子代A的单穗产量大于所述杂交子代B的单穗产量。

9.  根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述ZmDWF4蛋白编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体为所述ZmDWF4蛋白编码基因插入表达载体得到的载体。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米.

10.  根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：
所述自交系亲本为玉米品种Lx9801、3841、3848、T7、原早3-1、V3H1、S1620、zheng58或S415。

一种培育自交系配合力提高玉米的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种培育自交系配合力提高玉米的方法。
背景技术
玉米是重要的粮饲兼用作物，也是现代医药和化工等工业的重要原料，其产量和种植面积居我国第二位。随着分子生物学的发展和玉米基因组测序的完成，利用基因工程技术改良玉米农艺性状和种质创新成为研究热点。经过不断探索，玉米转基因研究取得了长足的进步。人们已经利用转基因技术获得了一批抗病、抗虫、抗逆以及品质改良的玉米新品种，显著地提高了玉米的品质与产量，逐渐被人们接受并迅速推广，如转Bt基因抗虫玉米和转基因抗除草剂玉米也已步入商品化生产领域(James,2008)。
油菜素甾醇类(brassinosteroids，简称BRs)是一类广泛调控植物生长发育的激素，20世纪70年代首次从油菜花粉中分离得到。BRs在植物生长发育的各个过程中都起到重要的调节作用，如细胞的伸长与分裂、器官分化、开花、结实和衰老等发育过程，拟南芥和水稻的BRs缺失型突变体由于细胞不能够正常伸长而表现为植株矮小，而过表达植株因BRs生物合成水平提高则能够增加植株高度、分枝数目、种子数目等(Choe et al.,1998，2001；Wu et al.,2008)。DWF4基因编码合成甾醇类C-22α羟化酶，该酶作用于BRs生物合成过程中从campestanol(CN)到6-deoxocathasterone(6-DeoxoCT)的C-22α羟基化过程，是BRs生物合成过程中的限速步骤。Choe等人观察到拟南芥dwf4突变体植株明显矮小(Choe et al.,1998)。根据水稻osdwarf4突变体叶片夹角减小、整体光吸收量增多的特点，Sakamoto等人合理密植，在单位面积中获得了高产(Sakamoto et al.,2005)；另一方面，针对DWF4基因过量表达也开展了很多有意义的研究工作，获得了丰富的植株表型。过表达AtDWF4基因的拟南芥植株营养生长增强，分枝数目及单株种子数目均增多(Choe et al.,2001)。Liu等人将玉米的ZmDWF4基因导入拟南芥中，转基因植株表现出分枝数目及种子数目增多，植株增高等表型(Liu et al.,2007)。在水稻中过表达AtDWF4和ZmDWF4后均能增强叶片光合作用，促进种子淀粉积累，增加转基因植株种子数目和重量(Wu et al.,2008)。
关于DWF4基因影响植物株型的研究已经相对比较深入，但目前国内外尚没有将ZmDWF4基因应用于改良玉米杂交种产量等农艺性状的报道。
发明内容
本发明的一个目的是ZmDWF4蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体的应用。
本发明提供的ZmDWF4蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在培育自交系配合力提高植物或调控植物对氮的吸收能力中的应用；
所述ZmDWF4蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
上述应用中，所述ZmDWF4蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1或序列3。
上述应用中，所述重组载体为所述ZmDWF4蛋白编码基因插入表达载体得到的载体。在本发明的实施例中，表达载体为pCAMBIA3300，重组载体为将序列表中序列3所示的ZmDWF4正向插入pCAMBIA3300-Ubi(pUB)表达载体的BamHⅠ酶切识别位点得到的载体，命名为pUBI::ZmDWF4。
上述调控植物对氮的吸收能力为提高植物对氮的吸收能力。
上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。
上述应用中，所述自交系为玉米品种Lx9801、3841、3848、T7、原早3-1、V3H1、S1620、zheng58或S415。
本发明另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将ZmDWF4蛋白编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；
所述转基因植物的自交系配合力高于所述目的植物；
或所述转基因植物对氮的吸收能力高于所述目的植物。
上述方法中，所述转基因植物的自交系配合力高于所述目的植物为所述转基因植物与自交系亲本杂交得到的名称为杂交子代A的杂交子代的产量高于所述目的植物与所述自交系亲本杂交得到的名称为杂交子代B的杂交子代的产量。
上述方法中，
所述杂交子代A的产量高于所述杂交子代B体现在如下1)-7)中至少一种：
1)所述杂交子代A的株高高于所述杂交子代B的株高；
2)所述杂交子代A的穗长大于所述杂交子代B的穗长；
3)所述杂交子代A的行粒数大于所述杂交子代B的行粒数；
4)所述杂交子代A的穗行数大于所述杂交子代B的穗行数；
5)所述杂交子代A的穗粒数大于所述杂交子代B的穗粒数；
6)所述杂交子代A的千粒重大于所述杂交子代B的千粒重；
7)所述杂交子代A的单穗产量大于所述杂交子代B的单穗产量。
上述方法中，
所述ZmDWF4蛋白编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体为所述ZmDWF4蛋白编码基因插入表达载体得到的载体。
在本发明的实施例中，表达载体为pCAMBIA3300-Ubi(pUB)，重组载体为将序列表中序列3所示的ZmDWF4正向插入pCAMBIA3300-Ubi(pUB)表达载体的BamHⅠ酶切识别位点得到的载体，命名为pUBI::ZmDWF4。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米.
上述方法中，
所述自交系亲本为玉米品种Lx9801、3841、3848、T7、原早3-1、V3H1、S1620、zheng58或S415。
本发明的实验证明，本发明克隆得到调控油菜素内酯生物合成酶关键基因ZmDWF4，将其导入玉米中，获得了转基因玉米株系，观察发现该植株与不同遗传群体的自交系均具有较好的配合力，杂交种产量也显著提高，将该转基因阳性植株应用于实际生产，可用于提高作物产量，具有重要的经济价值和社会效益。
附图说明
图1为植物表达载体pUBI::ZmDWF4载体结构图；
图2为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图，
图中Bar基因为筛选标记基因，片段大小为650bp；Ubi-ZmDWF4基因为目的基因(包括Ubiqitin启动子部分区段和ZmDWF4基因部分区段)，片段大小为912bp。其中，M表示分子量标记，L表示候选转基因植株，WT表示野生型对照，PC表示阳性质粒。
图3为根系比较图
图4为转基因植株氮吸收效率测定结果，
其中，CK表示野生型对照，L表示候选转基因植株；
图5转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株株高的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图6转基因杂交组合与对照组合在田间表现。左侧为转基因杂交组合，右侧为对照组合。
图7转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗比较。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。图J为果穗分布示意图。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图8转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗长度的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图9转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗行粒数的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图10转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗穗行数的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图11转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗穗粒数的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图12转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗千粒重的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图13转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗单穗产量的数据统计。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
图14转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株小区产量的数据统计。图中CK均为Q319自交系，第一个柱子均为各自对照组合，后三个柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。单星号表示差异显著(T检验，P<0.05)，双星号表示差异极显著(T检验，P<0.01)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；其中本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明中转基因植株所用选择标记基因为磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(BAR)，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。本发明选用的筛选抗生素为双丙氨酰磷(biolaphos)。本发明将转ZmDWF4基因的齐319自交系与来自不同群体的自交系杂交获得杂交种，杂交方法都是本领域人员熟知的，为杂交育种常规操作，所使用的自交系来自多个群体，这些自交系包括但不仅限于：P系、黄改、兰卡、瑞德等自交系类群；除此之外，本发明所采用的均为本领域现有技术。
实施例1、ZmDWF4基因克隆及植物表达载体构建
1、玉米RNA的提取和纯化
取2-3g新鲜的玉米自交系齐319(以下也称为野生型玉米)材料在液氮中研磨，迅速将研磨好的样品移入15ml CTAB提取液中(2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，100mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM EDTA，2.0M NaCl，2％(W/V)β-巯基乙醇，0.5g/L亚精胺)，立即涡旋震荡30s，65℃水浴片刻，加与CTAB提取液等体积的氯仿：异戊醇的混合物，其中氯仿：异戊醇的体积比为24:1，振荡混匀；室温下10000rpm离心15分钟，转移上清液到另一干净管中，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)混匀静置，重复抽提一次，室温下10000rpm离心15分钟，转移水相到另一离心管中。根据溶液体积加入8M LiCl，使LiCl终浓度为2M，4℃过夜沉淀(最多16小时)。4℃离心20分钟，去掉上清液，用500μl70％乙醇漂洗沉淀，用500μl SSTE液(1.0M NaCl，0.5％(W/V)SDS，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))溶解沉淀，将溶液转移到1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)，再抽提一次。上清液中加入2倍体积的乙醇，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时，4℃12000rpm离心20分钟，沉淀DNA，先用400μl 70％乙醇漂洗沉淀，再加入400μl 100％乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50μl DEPC ddH₂O溶解沉淀，得到总RNA。
为确保RNA质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：RNA纯度为OD260/280和OD260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓度在1.0-2.0μg/μl范围内。
2、cDNA第一链的合成
在0.2ml DEPC处理的离心管中顺序加入1μl 50μM Oligo dT Primer和15.5μl总RNA，70℃变性6分钟，迅速冰浴5分钟。在上述离心管中顺序加入2μl dNTP Mixture(10mM)，5μl 5×PrimerScript Buffer，0.5μl RNase Inhibitor(40U)，1μl PrimerScript RTase(200U)，加DEPC-H2O至25μl。在PCR仪上运行程序为25℃，10分钟；42℃，90分钟；95℃，5分钟。程序结束后，样品于-80℃冻存待用。
3、ZmDWF4基因的克隆
以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：
上游引物:5'-ATGGATCCATCAGCAGGAGCTCATGGG-3'如序列4所示(下划线部分为BamHI酶切识别序列)
下游引物:5'-ATGGATCCCCCTCTCAGCCTCTTGTGC-3'如序列5所示(下划线部分为KpnI酶切识别序列)
PCR扩增体系为1μl上游引物(50pmol/μL)，1μl下游引物(50pmol/μL)，5μl10×PCR buffer，5μl dNTP混合液(10mmol/L)，0.5μl Taq DNA聚合酶(5U)，4μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至50μl。扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环35次；72℃延伸10分钟。
取4μl PCR产物与pMD19-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD19-TSimple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其核苷酸序列为序列3，表明扩增产物为ZmDWF4基因，该基因的编码区为序列1或序列3第56-1582位核苷酸；其编码的蛋白为ZmDWF4，该蛋白的氨基酸序列为序列2。
4、植物表达载体pUBI::ZmDWF4的构建
用限制性内切酶BamHⅠ酶切扩增上述3得到的ZmDWF4基因PCR扩增产物和含BAR基因的pCAMBIA3300-Ubi载体(pUB)(Surekha Katiyar-Agarwal,Avnish Kapoor and Anil Grover.Binary cloning vectors for efficient genetic transformation of rice.Current Science,2002,82(7),873-876.；公众可从山东农业大学获得)，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用T4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照Fermentas公司产品T4DNA ligase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。
碱法提取质粒DNA并进行酶切鉴定，得到1552bp的为阳性质粒。
阳性质粒送去测序，结果为将序列表中序列3所示的ZmDWF4正向插入pCAMBIA3300-Ubi(pUB)表达载体的BamHⅠ酶切识别位点间的DNA片段得到的载体，命名为pUBI::ZmDWF4，其结构示意图如图1所示。
将酶切鉴定正确的表达载体pUBI::ZmDWF4转化农杆菌LBA4404感受态细胞，并获得可供转化使用的农杆菌菌株LBA4404/pUBI::ZmDWF4。
实施例2、转ZmDWF4玉米的获得
一、转ZmDWF4玉米的获得
侵染前一天挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)LBA4404/pUBI::ZmDWF4接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，220rpm摇菌过夜，第二天一早沉淀并用AB诱导培养基重悬，培养5小时后沉淀菌体，侵染液重悬菌体备用。
收集自交系齐319(以下也称为野生型玉米)授粉后10-13天的幼胚(长度在1.0mm-1.5mm之间)放在预侵染培养基中，收集完全后，2700rpm离心5秒，弃去培养基，加预侵染培养基2ml重新悬浮，2700rpm离心5秒，46℃水浴3分钟，冰浴1分钟，2700rpm离心5秒，弃去培养基。加2ml预侵染培养基，4℃2700rpm离心10分钟，弃去培养基，加入1ml农杆菌悬浮菌液到离心管中，2700rpm离心30秒，室温放置5分钟。
将侵染的幼胚转移至带滤纸的灭菌空培养皿中，吸干菌液后转移至共培养培养基中28℃暗培养3天，移至梯度筛选培养基中，每2周更换一次培养基，梯度筛选3次(双丙氨酰磷三个浓度梯度分别为25mg/L、50mg/L、100mg/L)；筛选后的愈伤组织转入分化培养基。2周 后，将分化得到的幼苗转入生根培养基，将长出3根以上壮根的幼苗炼苗，经过7天左右的炼苗期后，移栽至温室，得到T0代转ZmDWF4玉米。
本实施例中的预侵染培养基为添加了1.5mg/L 2,4-D的MS培养基(Murashige and Skoog,1962)，筛选培养基为添加了2.0mg/L 2,4-D的N6培养基(朱志清等，1974)，其中的2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸。
二、候选转基因植株的分子检测
1、候选转基因植株的PCR检测
采用CTAB法(Sambrook and Russell，分子克隆实验指南，2001)提取T0代转ZmDWF4玉米植株基因组DNA，分别设计引物检测标记基因NPTⅡ和目的基因ZmDWF4，引物对序列如下：
标记基因BAR基因引物对如下：
上游引物：5'-GGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTAC-3'，如序列6所示；
下游引物：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3'，如序列7所示；
标记基因BAR扩增序列长度为650bp，扩增条件：扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸50秒，循环35次；72℃延伸10分钟。
启动子与ZmDWF4基因融合片段引物对如下：
上游引物：5'-TTTTAGCCCTGCCTTCATACG-3'，如序列8所示；
下游引物：5'-CGCTTGACTTCTCCCTGCTCATC-3'，如序列9所示；
扩增序列长度为934bp，扩增条件：扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，61℃退火1分钟，72℃延伸50秒，循环35次；72℃延伸10分钟
结果如图2，PC为pUBI::ZmDWF4质粒DNA、CK为野生型玉米、L678、L857、L943为T0代转ZmDWF4玉米株系，转基因植株的筛选标记基因BAR基因和启动子与ZmDWF4基因融合片段的检测结果，扩增序列长度分别为650bp和934bp，得到上述对应片段的为阳性T0代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA3300-Ubi(pUB)转入野生型玉米中，得到T0代转pUB玉米。采用同样的方法检测，其结果与野生型玉米无显著差异。
将T0代植株播种，培养，得到T1代植株。
观察T1代阳性T0代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943与野生型玉米根系，结果如图3，可以看出，与野生型玉米相比，T1代阳性T0代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943根长增加。
实施例3、转ZmDWF4玉米氮吸收效率的测定
将T1代转ZmDWF4玉米、T1代转pUBI::ZmDWF4玉米和野生型玉米籽粒在正常条件下萌发，后点播于珍珠岩中，于完全营养液条件下生长至3叶期。小心将根洗净并将玉米籽粒去除，挑选长势较为一致的材料重新植于珍珠岩中，以液体的琥珀酸铵培养基作为氮源和碳源供应，使材料生长到需要测定的时期(4-5叶期)。将材料从珍珠岩中洗出，吸干溶液后将材料根浸于硝酸钾水溶液中，按照预设时间点(0分钟、5分钟、15分钟、半小时、1小时、3小时、6小时、12小时等)处理材料。时间到时将材料取出，蒸馏水冲洗后吸干，取材根部并迅速冷冻于液氮中。测定材料中的硝态氮的含量。
1、标准曲线的制作
(1)吸取500mg/L硝态氮标准溶液(准确称取烘至恒重的KNO₃0.7221g溶于ddH₂O中， 定容至200ml)0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1ml，1.2ml分别放入12ml离心管中，用ddH₂O定容至5ml，使之成为10,20,30,40,60,80,100,120mg/L的系列标准溶液。
(2)吸取上述标准溶液0.1ml，分别放入12ml离心管中，以0.1mlddH₂O代替标准溶液做空白，再分别加入0.4ml 5％水杨酸-硫酸溶液(称取5g水杨酸溶于100ml浓硫酸中。(一般在棕色试剂瓶中称取1g SA溶于20ml浓硫酸))，摇匀，在室温下放置20min后，再加入8％NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10ml。
(3)标准去曲线的获得：以空白做参比，在410nm波长下测定光密度。以硝态氮浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。
在植物营养分子生物学实验室分光光度计下得到的回归方程：c(ug/ml)＝140.63*OD410—1.1636
2、样品中硝态氮的测定
(1)硝态氮的提取
取所需要测定的植物材料于1.5ml离心管中，去皮称重后液氮研磨，然后加入1mlddH₂O，100℃煮沸20min，13000rpm离心10min，上清液为所需要测定的样品液。
(2)硝态氮的测定
吸取样品液0.1ml分别于2-3支12ml离心管中，然后加入0.4ml5％水杨酸-硫酸溶液，混匀后置室温下反应20min再加入9.5ml8％NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白(加0.1ml ddH₂O与0.4ml 5％水杨酸-硫酸反应20min，再加入9.5ml 8％NaOH溶液，冷却至室温)做参比，在410nm波长下测其光密度。在回归方程中计算出硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。
NO₃^--N含量＝C*V/W
式中：C—回归方程计算得NO₃^--N浓度；
V—提取样品液总量；
W—样品鲜重
结果如图4所示，可以看出，转基因株系L678、L857和L943在相同时间氮素含量高于对照(CK)，表明转基因株系比对照具有较高的氮吸收效率。。
实施例4、转ZmDWF4玉米与自交系杂交得到杂交子代
1、杂交
将T0代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943播种，培育，直到得到T2代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943纯合系；
将T2代转ZmDWF4玉米株系L678、L857、L943纯合系作为母本分别与四个来自不同群体的自交系Lx9801(孟昭东，玉米结实习性遗传规律及其在育种中的应用，[D]，山东农业大学，2006；公众可从山东农业大学获得)、3841(由『(PANAR31×黄早四)×昌7-2』杂交后代为材料经多代自交、回交选育而来，于2010年育成。其中，PANAR31为非洲外引材料。)、3848(由『(PANAR31×黄早四)×昌7-2』杂交后代为材料经多代自交、回交选育而来，于2010年育成。其中，PANAR31为非洲外引材料。)、T7(由『(黄早四×BLS71)×CMTR5-1』杂交后代为材料经多代自交、回交选育而来，于1998年育成。其中，BLS71为外引材料，CMTR5-1为自选系。)、原早3-1(由『(PANAR31×黄早四)×昌7-2』杂交后代为材料经多代自交、回交选育而来，于2010年育成。其中，PANAR31为非洲外引材料。)、V3H1(由CIMBL144×SD388杂交后代为材料,经多代回交、自交选育,于2005年育成。其中CIMBL144为外引系，SD388为自选系。)、S1620(由Moty－9×SD388杂交后代为材料,经多代回交、自交选育,于2007年 育成。Moty－9为外引系、SD388为自选系，于2005年育成。)、zheng58(张发林，玉米优良自交系郑58的育成和应用，作物杂志，2001(4)：21；公众可从山东农业大学获得)和S415(由掖『(478×178)×5003』杂交后代经多代自交、回交选育而来，于1998年育成。)(作为父本)杂交，得到杂交子代1、杂交子代2和杂交子代3，具体如下：
杂交子代1：L678、L857、L943分别为母本、Lx9801为父本杂交得到杂交子代F₁L678/Lx9801、L857/Lx9801、L943/Lx9801；
杂交子代2：L678、L857、L943分别为母本、3841为父本杂交得到杂交子代F₁L678/3841、L857/3841、L943/3841；
杂交子代3：L678、L857、L943分别为母本、3848为父本杂交得到杂交子代F₁L678/3848、L857/3848、L943/3848；
杂交子代4：L678、L857、L943分别为母本、T7为父本杂交得到杂交子代F₁L678/T7、L857/T7、L943/T7；
杂交子代5：L678、L857、L943分别为母本、原早3-1为父本杂交得到杂交子代F₁L678/原早3-1、L857/原早3-1、L943/原早3-1；
杂交子代6：L678、L857、L943分别为母本、V3H1为父本杂交得到杂交子代F₁L678/V3H1、L857/V3H1、L943/V3H1；
杂交子代7：L678、L857、L943分别为母本、S1620为父本杂交得到杂交子代F₁L678/S1620、L857/S1620、L943/S1620；
杂交子代8：L678、L857、L943分别为母本、zheng58为父本杂交得到杂交子代F₁L678/zheng58、L857/zheng58、L943/zheng58；
杂交子代9：L678、L857、L943分别为母本、S415为父本杂交得到杂交子代F₁L678/S415、L857/S415、L943/S415；
以齐319作为母本，分别与四个来自不同群体的自交系Lx9801、3841、3848、T7、原早3-1、V3H1、S1620、zheng58和S415(作为父本)杂交，得到杂交子代F₁CK/Lx9801、CK/3841、CK/3848、CK/T7、CK/原早3-1、CK/V3H1、CK/S1620、CK/zheng58、CK/S415为对照。
图6转基因杂交组合与对照组合在田间表现。左侧为转基因杂交组合，右侧为对照组合。
2、表型统计
取上述1得到的各种杂交子代各80粒种子，按照每行20粒，行长5米，行间距65公分，4行为一小区的标准进行播种。
统计授粉10天的各F₁代植株的株高如图5，转基因杂交组合株高均高于对照组合。其中，杂交子代1平均增高2.06％；杂交子代2平均增高14.3％；杂交子代3平均增高2.47％；杂交子代4平均增高2％；杂交子代5平均增高6.51％；杂交子代6平均增高3.67％；杂交子代7平均增高5.33％；杂交子代8平均增高3.82％；杂交子代平均增高2.59％。
3、穗部性状及考种数据分析
对上述1得到的各种杂交子代果穗的长度、行粒数、穗行数、穗粒数、千粒重、单穗产量及小区产量(每行20粒，行长5米，行间距65公分，4行为一小区)等性状进行测定，并统计结果(图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14)，具体分析如下：
图7转基因植株与九个来自不同群体自交系杂交一代植株果穗比较。图中CK均为Q319自交系，白色柱子均为各自对照组合，灰色柱子为转基因杂交组合，L678、L857和L943为三个转基因株系。图J为果穗分布示意图。
如图8所示，转基因杂交一代果穗长度均长于对照，增长幅度最高达11.54％。其中，杂交子代1平均增长5.09％；杂交子代2平均增长5.39％；杂交子代4平均增长2.68％；杂交子代4平均增长0.56％；杂交子代5平均增长11.54％；杂交子代6平均增长4.7％；杂交子代7平均增长2.74％；杂交子代8平均增长11.43％；杂交子代平均增长6.76％。
如图9所示，转基因杂交一代果穗的行粒数均多于对照，增长幅度最高达13.68％。其中，杂交子代1平均增长11.3％；杂交子代2平均增长4.61％；杂交子代4平均增长7.62％；杂交子代4平均增长4.2％；杂交子代5平均增长13.68％；杂交子代6平均增长8.90％；杂交子代7平均增长0.42％；杂交子代8平均增长7.08％；杂交子代平均增长11.25％。
如图10所示，转基因杂交一代果穗的穗行数均多于对照，增长幅度最高达15.94％。其中，杂交子代1平均增长2.93％；杂交子代2平均增长15.94％；杂交子代4平均增长0.38％；杂交子代4平均增长1.83％；杂交子代5平均增长5.22％；杂交子代6平均增长8.33％；杂交子代7平均增长2.11％；杂交子代8平均增长0.46％；杂交子代平均增长1.44％。
如图11所示，转基因杂交一代果穗的穗粒数均多于对照，增长幅度最高达21.03％。其中，杂交子代1平均增长14.58％；杂交子代2平均增长21.03％；杂交子代4平均增长7.51％；杂交子代4平均增长4.08％；杂交子代5平均增长7.41％；杂交子代6平均增长17.82％；杂交子代7平均增长2.54％；杂交子代8平均增长6.09％；杂交子代平均增长9.92％。
如图12所示，转基因杂交一代果穗的千粒重均高于对照，增长幅度最高达30.56％。其中，杂交子代1平均增长10.22％；杂交子代2平均增长14.85％；杂交子代4平均增长7.15％；杂交子代4平均增长8.41％；杂交子代5平均增长20.29％；杂交子代6平均增长9.02％；杂交子代7平均增长30.56％；杂交子代8平均增长21.67％；杂交子代平均增长15.99％。
如图13所示，转基因杂交一代果穗的单穗产量均高于对照，增长幅度最高达38.74％。其中，杂交子代1平均增长26.47％；杂交子代2平均增长38.75％；杂交子代4平均增长15.54％；杂交子代4平均增长13.01％；杂交子代5平均增长28.55％；杂交子代6平均增长27.74％；杂交子代7平均增长33.75％；杂交子代8平均增长28.77％；杂交子代平均增长25.73％。
如图14所示，转基因杂交一代小区产量均多于对照，增长幅度最高达25.28％。其中，杂交子代1平均增长17.53％；杂交子代2平均增长22.72％；杂交子代4平均增长18.6％；杂交子代4平均增长20.08％；杂交子代5平均增长10.22％；杂交子代6平均增长18.85％；杂交子代7平均增长12.24％；杂交子代8平均增长9.73％；杂交子代平均增长25.28％。
以上数据可充分说明转ZmDWF4基因株系可从果穗长度、穗行数、行粒数、穗粒数、千粒重、单穗产量等多个性状改良杂交种的产量，其为自交系配合力提高的玉米。总体来说，转基因自交系比常规自交系可使杂交种具有更高的产量和更高的应用价值。
除此之外本发明中ZmDWF4基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它可以改良农艺性状的转基因植物，如小麦、水稻、高粱等作物，包括此类转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。