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1、10申请公布号CN104082146A43申请公布日20141008CN104082146A21申请号201410334141722申请日20140714A01H4/00200601C12N5/0420060171申请人北京林业大学地址100083北京市海淀区清华东路35号72发明人李颖岳王岩庞晓明王欢康亚璇74专利代理机构北京市广友专利事务所有限责任公司11237代理人张仲波54发明名称一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法57摘要本发明提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，涉及生物技术领域，以解决现有方法很难得到纯合四倍体的问题。一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤启动培养，诱导。
2、培养，伸长培养，壮苗培育，幼叶检测。本发明用以培养得到酸枣纯合四倍体材料，为枣树遗传改良提供支持。51INTCL权利要求书3页说明书6页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书6页附图3页10申请公布号CN104082146ACN104082146A1/3页21一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基一上进行911D预暗培养；诱导培养，将叶片转至含有4080MG/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100RMP摇床震荡培养23D后转入不定芽启动培养基一上继。
3、续暗培养810D；伸长培养，预暗培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，移至光下培养2535D；壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基中，培养1820D；幼叶检测，待不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。2根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述不定芽启动培养基一包括改良WPM基本培养基和包含10MG/L的噻苯隆和03MG/L的吲哚3丁酸的植物生长调节剂；所述不定芽伸长培养基二包括改良WPM基本培养基和包含01MG/L的吲哚3乙酸和05MG/L的赤霉素的植物生长调节剂。3根据权利要求2所述的酸枣不定芽途径诱。
4、导多倍体的方法，其特征在于，所述改良WPM基本培养基含蔗糖30G/L，PH5862，配方为4根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述MS壮苗培养基含蔗糖30G/L，PH5862，配方为权利要求书CN104082146A2/3页35根据权利要求4所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述MS壮苗培养基中的植物生长调节剂为10MG/L的6苄氨基腺嘌呤和04MG/L的吲哚丁酸。6根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述幼嫩叶片为酸枣无菌苗植株形态学上端至下端的第35枚的三枚叶片；所述叶片刻伤方法为沿中脉垂直方向横切23个伤口，切断主。
5、脉但不切断叶片；所述接种方式为近轴端接触培养基。7根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述诱导培养所用液体培养基为不加入琼脂的不定芽启动培养基一，所述秋水仙碱的浓度为4080MG/L。8根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述伸长培养阶段采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养条件中光照强度为19000X21002X，光照时间1216H/D，温度2327。9根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述多倍体检测方法为流式细胞仪法，所用裂解液为改良WPB裂解液，所用染液为10UG/L的DAPI染液；其中，所述改良W。
6、PB裂解液PH7278，配方为改良WPB裂解液成分配置1L含量TRISHCL2422GMGCL26H2O081GNA2EDTA2H2O074G权利要求书CN104082146A3/3页4NACL503GKCL596GNA2S2O5190GTRITONX10010MLPVP1010G权利要求书CN104082146A1/6页5一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域，特别是指一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法。背景技术0002枣ZIZYPHUSJUJUBAMILL为鼠李科RHAMNACEAE枣属ZIZYPHUSMILL植物，是原产于中国的特色优势经济树种，其味道鲜。
7、美，果形美观，富含人体所需的多种氨基酸和维生素，还含有多种多糖、微量元素及抗癌物质环磷酸腺苷等药用成分，是药食两用滋补品。0003酸枣ZIZIPHUSSPINOSUSHU原产中国华北，多野生，耐干旱、贫瘠，在山区开发中曾发挥重要作用。酸枣花期长，是良好的蜜源植物，种仁饱满可入药。酸枣作为食品，营养价值很高，含有钾、钠、铁、锌、磷、硒等多种微量元素；更重要的是酸枣中含有大量的维生素C，其含量是普通红枣的23倍、柑橘的2030倍，在人体中利用率可达863。此外，近年来果汁、果醋等天然养生食品深受广大消费者喜爱，酸枣作为生产原材料，其枣果品质的增加可以大幅提高生产效率，减少生产成本。0004酸枣的多。
8、倍体研究已有一些报道，但多采用田间愈伤组织途径或材料为丛芽、茎段的离体诱导途径，这些途径通常会形成的嵌合体，很难得到纯合四倍体。本发明以酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，采用直接再生不定芽途径进行多倍体的诱导，从而有效的避免嵌合体的出现。此外，对于枣树叶片离体多倍体诱导最佳处理时期的相关研究还未见报道，本发明采用两步培养法，在第一步预暗培养中首次找到秋水仙碱最佳处理时期，进而可以提高诱变效率，以期短时间内获得大量的多倍体材料，对枣树的遗传改良具有重要价值。发明内容0005本发明要解决的技术问题是提供酸枣不定芽途径诱导多倍体中秋水仙碱的最佳处理时期、适宜浓度和处理时间，以解决现有方法很难得到纯合。
9、四倍体的问题。0006为解决上述技术问题，本发明实施例提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基一上进行911D预暗培养；诱导培养，将叶片转至含有4080MG/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100RMP摇床震荡培养23D后转入不定芽启动培养基一上继续暗培养810D；伸长培养，预暗培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，移至光下培养2535D；壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基中，培养1820D；幼叶检测，待不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行。
10、多倍体检测。0007其中，所述不定芽启动培养基一包括改良WPM基本培养基和包含10MG/L的噻苯隆和03MG/L的吲哚3丁酸的植物生长调节剂；所述不定芽伸长培养基二包括改良WPM基本培养基和包含01MG/L的吲哚3乙酸和05MG/L的赤霉素的植物生长调节剂。说明书CN104082146A2/6页60008其中，所述改良WPM基本培养基含蔗糖30G/L，PH5862，配方为00090010其中，所述MS壮苗培养基含蔗糖30G/L，PH5862，配方为00110012其中，所述壮苗培养基中的植物生长调节剂为10MG/L的6苄氨基腺嘌呤和04MG/L的吲哚丁酸。0013其中，所述幼嫩叶片为酸枣无菌苗。
11、植株形态学上端至下端的第35枚的三枚叶片；所述叶片刻伤方法为沿中脉垂直方向横切23个伤口，切断主脉但不切断叶片；所述说明书CN104082146A3/6页7接种方式为近轴端接触培养基。0014其中，所述诱导培养所用液体培养基为不加入琼脂的不定芽启动培养基一，所述秋水仙碱的浓度为4080MG/L。0015其中，所述伸长培养阶段采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养条件中光照强度为19000X21002X，光照时间1216H/D，温度2327。0016其中，所述多倍体检测方法为流式细胞仪法，所用裂解液为改良WPB裂解液，所用染液为10UG/L的DAPI染液。0017其中，所述改良WPB裂解液P。
12、H7278，配方为0018改良WPB裂解液成分配置1L含量TRISHCL2422GMGCL26H2O081GNA2EDTA2H2O074GNACL503GKCL596GNA2S2O5190GTRITONX10010MLPVP1010G00190020本发明的上述技术方案的有益效果如下0021上述方案中，通过采用酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，能有效克服嵌合体的出现，获得同质多倍体植株的效率较高，对枣树的遗传改良具有重要价值。附图说明0022图1为本发明实施例的刻伤后的酸枣无菌苗的幼嫩叶片；0023图2为本发明实施例的酸枣无菌幼嫩叶片在不定芽伸长培养基二光照培养30D后的示意图；0024图3为。
13、本发明实施例的酸枣叶片再生不定芽壮苗培养20D后的示意图；0025图4A为本发明实施例的酸枣二倍体植株DNA含量示意图；0026图4B为本发明实施例的酸枣四倍体植株DNA含量示意图；0027图5A为本发明实施例的酸枣二倍体植株气孔密度和大小示意图；0028图5B为本发明实施例的酸枣四倍体植株气孔密度和大小示意图；0029图6为本发明实施例的酸枣四倍体植株的生长状况示意图。说明书CN104082146A4/6页8具体实施方式0030为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。0031本发明实施例针对现有的方法很难得到纯合四倍体的问题，提供一种酸枣不。
14、定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤0032启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基一上进行911D预暗培养；0033诱导培养，将叶片转至含有4080MG/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100RMP摇床震荡培养23D后转入不定芽启动培养基一上继续暗培养810D；0034伸长培养，预暗培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，移至光下培养2535D；0035壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基MURASHIGEANDSKOOG，1962中，培养1820D；0036幼叶检测，待不定芽生长健壮后，。
15、取幼嫩叶片，进行多倍体检测。0037通过采用酸枣无菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，能有效克服嵌合体的出现，获得同质多倍体植株的效率较高，对枣树的遗传改良具有重要价值。0038具体地，所述酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤0039步骤一、启动培养0040制备不定芽启动培养基一，包括改良WPM基本培养基WOODYPLANTMEDIUM和包含10MG/L的噻苯隆和03MG/L的吲哚3丁酸的植物生长调节剂，其中所述改良WPM基本培养基含蔗糖30G/L，PH60，配方为00410042选取酸枣无菌苗植株形态学上端至下端的第35枚的三枚叶片，如图1所示，在每说明书CN104082146A5/6页9枚。
16、叶片上沿中脉垂直方向横切2个伤口，切断主脉但不切断叶片，采用近轴端接触培养基接种在不定芽启动培养基一，共接种144枚叶片，进行10D预暗培养。0043步骤二，诱导培养0044制备含有75MG/L秋水仙碱的液体培养基，即在不加入琼脂的不定芽启动培养基一中加入75MG/L秋水仙碱。0045经过10D预暗培养，叶片的叶柄和伤口主脉处都长出了类似愈伤组织的白点，此时为秋水仙碱诱导加倍处理最佳时期，将叶片转入含有75MG/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100RMP摇床震荡培养3D，之后，转入不定芽启动培养基一上继续预暗培养10D。0046步骤三，伸长培养0047制备不定芽伸长培。
17、养基二，包括改良WPM基本培养基和包含01MG/L的吲哚3乙酸和05MG/L的赤霉素的植物生长调节剂，所述改良WPM基本培养基配方同上。0048如图2所示，预暗培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，并移至光下培养，采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养条件中光照强度为20000X，光照时间14H/D，温度25。004930D后共有120枚叶片诱导出不定芽，平均每枚叶片再生芽数229。不定芽再生率为8333，其中不定芽再生率诱导出不定芽叶片个数100/接种外植体数。0050步骤四，壮苗培养0051制备MS壮苗培养基，所述MS壮苗培养基含蔗糖30G/L，PH60，配方为00520053。
18、0054并加入10MG/L的6苄氨基腺嘌呤和04MG/L的吲哚丁酸的植物生长调节剂。说明书CN104082146A6/6页100055如图3所示，将经伸长培养长至2CM的不定芽从叶片上小心剥离，并接种到MS培养基上，共接种275个不定芽，经培养20D后，有211个不定芽成活，成活率为7672。0056步骤五，幼叶检测0057制备改良WPB裂解液和10UG/L的DAPI染液，所述改良WPB裂解液PH75，配方为0058改良WPB裂解液成分配置1L含量TRISHCL2422GMGCL26H2O081GNA2EDTA2H2O074GNACL503GKCL596GNA2S2O5190GTRITONX1。
19、0010MLPVP1010G0059如图4A至图6所示，将壮苗培养所得叶片切碎于含1MLWPB裂解液的培养皿中，使用200目尼龙网过滤至离心管，加入100ULDAPI染液，采用细胞仪法进行多倍体检测。最终得到14个纯合四倍体植株，四倍体诱导率为663。0060以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104082146A101/3页11图1图2说明书附图CN104082146A112/3页12图3图4A图4B图5A说明书附图CN104082146A123/3页13图5B图6说明书附图CN104082146A13。