高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂及制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种测定血清成分试剂的制备方法及试剂，特别是测定血清中的高密度脂蛋白中胆固醇试剂的制备方法与试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
心脑血管疾病的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)呈负相关已经流行病学和相关临床证实，检测高密度脂蛋白胆固醇还可广泛应用于相关的临床诊治，并作为脂类代谢异常的危险性指标之一。因此高密度脂蛋白胆固醇的准确测定至关重要，特别是在高密度脂蛋白胆固醇下限，极小的误差可能造成相对较大的影响，而且高密度脂蛋白胆固醇的结果直接影响低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的计算值。目前，对高密度脂蛋白胆固醇的测定方法有已知的超速离心法和电泳法以及中华人民共和国卫生部医政司编制的《全国临床检验操作规程》第二版279页所推荐的沉淀法。超速离心法是根据脂蛋白地比重不同，用超速离心器把脂蛋白进行分类，再对胆固醇进行测定。该方法过程分超速离心和胆固醇检测两步，费用高、耗时大。电泳法需要借助一些如琼脂糖凝胶等做为载体分离，操作极其繁杂。沉淀法是使用多聚阴离子和二价金属离子试剂沉淀大颗粒的脂蛋白，然后离心，用其上清液测定其含量。该方法虽简便，但不适用于全自动、大批量样本检测，而且对高甘油三酯血症患者，会使高密度脂蛋白胆固醇结果偏高，当高甘油三酯大于5mmol/L时会使计算LDL-C的Friedwald公式受其限制。上述这些已知的方法由于都不能在全自动上直接检测，近几年，直接在全自动上进行检测HDL-C试剂也相继出现，如中国专利(申请号99116565.9)他们利用聚阴离子复合物与血清中LDL(低密度脂蛋白)、VLDL(极低密度脂蛋白)、CM(乳糜微粒)反应，生成不溶于水的复合物，而HDL-C仍以溶液状态存在，在胆固醇试剂的存在下进行其测定，本方法中添加了胆酸钠，可能是为了提高专一性。在本发明中不仅仅HDL起反应，LDL、VLDL等也缓慢地起反应，所以要想得到完全的HDL的反应终点是不可能的。并且特异性也不一定好。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种测定高密度脂蛋白中胆固醇的试剂的制备方法及试剂的改进，用该方法所制得的试剂应特异性好、检测简便、测试准确率高，并能够在各种型号的全自动生化分析仪上对高密度脂蛋白中胆固醇进行检测。
本发明采用了以下技术方案：
高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂，包括适量防腐剂、稳定剂和色原，该试剂还包括以下成分：
A、高亲合性酶化合物，该酶化合物，由酶和化合物反应而得，其中：
化合物是甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种与活化剂混合、活化后的活化物，化合物的浓度为1-50毫克/毫升；
酶是1、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10、
2、脂蛋白脂酶和胆固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10中的任一组与缓冲液混合、溶解后的溶解物，缓冲液的PH值为5-9，缓冲液的摩尔配比是50-200mmol/L，所述的缓冲液是GOOD’S缓冲液或磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液或柠檬酸缓冲液或硼酸盐缓冲液；
上述化合物与酶二种成分反应时的摩尔配合比为1∶1-20∶1；
B、表面活性剂，其混合比例与A成分的重量百分比是0.003-30，所述的表面活性剂是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或任意比例混合的多种。
所述的酶优先选择胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。
该试剂还包括适量催化剂。
所述的表面活性剂的混合比例为0.01-10重量百分比。
该试剂中还有适量抗干扰物质。
所述的高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂的制备方法包括以下步骤：
一、化合物活化
选择所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种，在水介质中用公知的叠氮法或碳化二亚胺法或丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，活化条件为：
化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶10，温度0-25℃，PH在4-11范围内，时间0.1-24小时。
二、酶溶解
选择所述的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和胆固醇氧化酶中的任一组，溶解在缓冲液中；
三、混合反应
活化后的化合物与溶解后的酶混合，该溶液在0-25℃的温度下反应18-24小时；
四、配置：
反应后的酶化合物与表面活性剂混合，并加入防腐剂、稳定剂、用于显色测定的色原和催化剂。
所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素预先置于以下有机溶剂混合物中溶解：二甲亚砜或甲酰替二甲胺或六甲醇与甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物；化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶30-1∶0.01。
该试剂中还加入抗干扰剂物质。
本发明所提供的高密度脂蛋白中胆固醇测定试剂的制备方法及试剂，能够直接在各种型号的全自动生化分析仪上对高密度脂蛋白中胆固醇进行检测，省却了样本离心、沉淀等繁杂步骤，大幅度减轻了检测工作量、减少了检测时间、降低了检测成本；而且试剂的特异性好，检测的准确率较高，与国家推荐的沉淀法的检测效果比较，相关性达到0.98以上。
【附图说明】
图1至图3分别是本发明的实施例1至实施例3的测得值与沉淀法(《全国临床检验操作规程》第二版279页所推荐)的测得值的相关性示意图。
【具体实施方式】
经研究发现：用经制备的高亲合性胆固醇酯酶化合物和高亲合性胆固醇氧化酶化合物及对高密度脂蛋白中胆固醇具有较强作用的表面活性剂配制的试剂用来测定经超速离心分离出的HDL、LDL、VLDL及CM各组份脂蛋白时，上述各组份脂蛋白胆固醇的反应性显示出不同，且不同组份的选择性和反应性为HDL＞LDL＞VLDL＞CM。当表面活性剂浓度达一定时，LDL、VLDL、CM在很长时间内不参加测定HDL的反应。
由此，本发明提供的试剂及其制备方法是：
一、选用高亲合性酶化合物：
该酶化合物，由酶和化合物制备而得，其中：
1、化合物选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶。或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-胡椒烷、羊毛脂甾烷等的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素。上述化合物可以单独使用也可以两种或几种混合使用，没有特别的限制，只要制得的酶化合物及对高密度脂蛋白中胆固醇具有较强作用的表面活性剂配制的试剂对高密度脂蛋白中胆固醇的反应比其它脂蛋白胆固醇的反应性强。
本发明中使用的甾类糖苷实例有：脱糖毛地黄皂苷、天门冬苷、龙舌苷、羊毛蜡苷等等。
三萜烯糖苷的实例有：七叶素、茶皂苷等。
疏水蛋白质实例有：脂蛋白的脱水蛋白质、溶酶体的蛋白质等等。
蛋白质毒素可由细菌、海洋微生物等获得，作为实例有：链球菌溶血素O、脑酮溶细胞素等。
多烯抗菌素实例有：菲律宾菌等。
2、酶选用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和胆固醇氧化酶中任意一组。当然也可以选用其它的酶，只要制得的高亲合性酶化合物及对高密度脂蛋白中胆固醇具有较强作用的表面活性剂配成的试剂对高密度脂蛋白中胆固醇的反应比其它脂蛋白胆固醇的反应性强。为了提高检测的专一性，本发明中优先使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的来源不作具体限制。
二、高亲合胆固醇酶化合物的制备：
1、将上述化合物中的一种或几种混合物在水介质中进行活化
将上述化合物中的一种或几种混合物在水介质中用公知的叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，选用的方法最好能够最大地保持制备的酶化合物的活性。活化条件为：化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶10，化合物的浓度为1-50毫克/毫升，温度0-25℃，PH在4-11范围内，时间0.1-24小时。众所周知，其中的活化剂，在叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法中分别是叠氮化物、对环己基-2-(4-吗啉)乙基-碳化二亚胺-甲基-对甲苯磺酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及高碘酸钠。上面所描述的某些化合物，如甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素较难溶于水，为使它们完全溶解可预先置于以下不给出质子的极性有机溶剂混合物中溶解：二甲亚砜或甲酰替二甲胺或六甲醇与甲苯按2∶1混合的混合物、甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物。化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶30-1∶0.01。
2、所述的胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶溶解在PH为5-9范围的缓冲液中
胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶溶解在PH为5-9范围的缓冲液中。为了提高胆固醇酶化合物的亲合性，还可向溶液中加入能改变胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶化合物中的氨基的高分子聚合物。检测其活性后直接使用。
3、混合反应
活化后的化合物与溶解后的酶按1∶1-20∶1(摩尔比)的比例混合，该溶液在0-25℃的温度下反应18-24小时；
三、配置：
在制得的酶化合物中加入表面活性剂，表面活性剂的混合比例为前述成分重量百分比的0.003-30，优先混合比例为0.01-10；还可加入适量防腐剂、稳定剂和用于显色测定的色原，还可考虑加入适量催化剂和抗干扰物质。
本发明中使用的对高密度脂蛋白胆固醇具有较强作用的表面活性剂可以是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面性性剂，只要对高密度脂蛋白胆固醇具有较强作用，作为阳离子表面活性剂的实例有：月桂酰胺基咪唑啉、棕榈酰胺基咪唑啉、聚环氧乙烷十二烷胺、聚氧乙烯十六烷胺；作为阴离子表面活性剂的实例有：十二(烷)醇聚氧乙烯醚磷酸混合脂、PAM共聚物、十二烷基二苯醚二磺酸钠、棕榈酰甲基硫磺酸钠；作为非离子表面活性剂的实例有：磺基咪唑啉甜菜碱、烷基聚氧乙烯甜菜碱；作为非离子表面活性剂的实例子有：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、二苄基联苯基聚氧乙烯醚、失水山梨醇聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚、三苄基酚聚氧乙烯醚等。这里优选非离子表面活性剂(如：Tween-80、Triton X-100、GenapolX-081、Thesit等)。表面活性剂可以单独使用也可以混合使用，其用量如前所述。
在本发明中为了保持酶化合物和试剂的稳定性，可以加入稳定剂、防腐剂或防霉剂或其它的醇类，如乙二胺四乙酸钠(EDTA.2Na)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、二价金属离子。防腐剂或防霉剂的种类和用量可多可少不作限定，一般使用范围0.1-20mmol/L。
在本发明中用于显色测定的色原有：2.4.6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHBA)、3.5-二氯-2-羟基苯甲酸(DHBS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-2甲氧基苯胺(HDAOS)、TODP、TOOS等。色原的种类和用量也可多可少不作限定，一般使用范围0.01-10mmol/L。
本发明所使用的缓冲液，可以是GOOD’S缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液等，缓冲液的种类和浓度因具体成份而定，这里不作限制，只要在PH为5-9的范围内保证缓冲作用且不抑制酶活性的一种或其混合物。优先选用50-200mmol/L的GOOD’S缓冲液。
催化剂的种类和用量也可多可少不作限定，一般使用范围也为10U/L-10000U/L。
本发明中为了防止其它非测量物质的干扰，可加入抗坏血酸氧化酶等抗干扰物质。该物质的种类和用量也的种类和用量可多可少不作限定，一般使用范围10U/L-10000U/L。
本发明所采用的所有生化用品均可外购获得。
本发明所提供的高密度中胆固醇的试剂，在测试时全自动生化分析仪上的主要参数如下：
Test HDL-C Assay code 2point Assay point 15-34 Wave(sub/main) 700nm/546nm Sample volume 3μl R1 volume 225μl R2 volume 75μl Calib.type Linear Calib/span.point 2/2
实施例1：本实施例中的高亲合酶胆固醇酯酶化合物与高亲合酶胆固醇氧化酶化合物由甾类糖苷化合物中的龙舌苷甾类糖苷与酶制备；配置方式如前所述，其中：
化合物活化的活化条件为：
化合物与活化剂的摩尔比为1∶1，温度15℃，PH值为8，时间10小时。
缓冲液的摩尔配比是100mmol/L，缓冲液的PH值为7。
活化后的化合物与溶解后的酶混合，该溶液在15℃的温度下反应20小时。
所述的龙舌苷预先置于以下有机溶剂混合物中溶解：甲酰替二甲胺与甲苯按2∶1混合的混合物，化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶0.01。
试剂I
高亲合酶胆固醇酯酶化合物 500U/L
高亲合酶胆固醇氧化酶化合物 5000U/L
缓冲液GOOD’S(PH：6.7) 100mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂聚乙二醇 10g/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
色原TOPS 2mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
催化剂辣根过氧化物酶 950U/L
抗干扰物质抗坏血酸氧化酶 1000U/L
试剂II
表面活性剂聚氧乙烯烷基苯基醚 500g/L
缓冲液GOOD’S(PH：6.7) 100mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
色原4-AAP 0.25mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
上机测试时试剂I、试剂II同时混合加入测试。
表1为本实施例1的上机测试值与沉淀法的测定值对照表。
图1根据表1数据制成，本实施例1测得值与沉淀法(《全国临床检验操作规程》第二版279页所推荐)的测得值的相关性r为0.992，说明相关性良好。
实施例2
本实施例中使用胆固醇酯酶化合物、胆固醇氧化酶化合物由三萜烯糖苷类化合物的中的茶皂苷与酶制备；配置方式如前所述，其中：
化合物活化的活化条件为：
化合物与活化剂的摩尔比为1∶5，温度0℃，PH值为4，时间24小时。
缓冲液的摩尔配比是50mmol/L，缓冲液的PH值为9。
活化后的化合物与溶解后的酶混合，该溶液在0℃的温度下反应24小时；
所述的茶皂苷预先置于以下有机溶剂混合物中溶解：甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物；化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶15。
试剂I
胆固醇酯酶化合物用量为 5000U/L
胆固醇氧化酶化合物用量为 4000U/L
缓冲液GOOD’S(PH：5) 50mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂Mgcl2 5mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
色原TOOS 2.2mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
催化剂辣根过氧化物酶 950U/L
抗干扰物质抗坏血酸氧化酶 1000U/L
试剂II
表面活性剂聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚 600g/L
缓冲液GOOD’S(PH：6.7) 50mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
色原4-AAP 0.20mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
上机测试时试剂I、试剂II同时混合加入测试。
表2为本实施例2的上机测试值与沉淀法的测定值对照表。
图2根据表2数据制成，本实施例2测得值与沉淀法(《全国临床检验操作规程》第二版279页所推荐)的测得值的相关性r为0.994，说明相关性良好。
实施例3
本实施例中使用胆固醇酯酶化合物、胆固醇氧化酶化合物由由三萜烯糖苷类化合物的中的茶皂苷与酶制备；配置方式如前所述。
化合物活化的活化条件为：
化合物与活化剂的摩尔比为1∶10，温度25℃，PH值11，时间0.1小时。
缓冲液的摩尔配比是200mmol/L，缓冲液的PH值为5。
活化后的化合物与溶解后的酶混合，该溶液在25℃的温度下反应18小时；
所述的茶皂苷预先置于以下有机溶剂混合物中溶解：六甲醇与甲苯按2∶1混合的混合物，化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶30。
试剂I
胆固醇酯酶化合物用量为 6000U/L
胆固醇氧化酶化合物用量为 600U/L
缓冲液GOOD’S(PH：9) 200mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂Mgcl2 5mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
色原HDAOS 3mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
催化剂辣根过氧化物酶 950U/L
抗干扰物质抗坏血酸氧化酶 1000U/L
试剂II
表面活性剂三苄基酚聚氧乙烯醚 12g/L
缓冲液GOOD’S(PH：6.7) 200mmol/L
防腐剂NaN3 7.5mmol/L
色原4-AAP 0.15mmol/L
稳定剂BSA 1g/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
上机测试时试剂I、试剂II同时混合加入测试。
表3为本实施例3的上机测试值与沉淀法的测定值对照表。
图3根据表3数据制成，本实施例3测得值与沉淀法(《全国临床检验操作规程》第二版279页所推荐)的测得值的相关性r为0.989，说明相关性良好。
表1 沉淀法测定值(mmol/L)本发明方法(实施例1)测定值(mmol/L) 1.21.2 1.611.56 1.11.12 1.621.63 0.620.61 1.451.5 1.551.54 1.771.84 1.041.01 1.571.54 1.121.04 1.060.95 1.681.63 1.211.22 1.461.46 1.111.04 1.721.7 1.381.35 1.271.25 0.850.77 0.910.96 1.491.5 0.870.91 1.00.98 1.791.75 1.061.1 0.830.8 0.990.98 0.960.95 1.311.3 1.43 1.4 1.25 1.23 0.87 0.86
表2 沉淀法测定值(mmol/L) 本发明方法(实施例2)测定值 (mmol/L) 0.94 0.92 1.08 1.04 0.97 1.01 0.86 0.89 0.94 0.96 1.41 1.28 1.17 1.21 0.89 0.85 1.68 1.64 0.89 0.94 0.83 0.82 1.13 1.09 1.49 1.5 1.4 1.4 0.84 0.9 0.79 0.78 1.12 1.1 1.12 1.2 0.91 0.9 1.03 1.0 1.02 1.0 1.29 1.27 0.88 0.88 1.59 1.54 1.06 1.09 1.23 1.2 1.5 1.48 0.38 0.36 1.22 1.18 2.13 2.1 0.43 0.41 1.52 1.5 1.36 1.36
表3 沉淀法测定值(mmol/L) 本发明方法(实施例3)测定值 (mmol/L) 1.5 1.43 1.48 1.31 1.08 0.96 1.12 0.99 0.88 0.83 1.27 1.06 2.0 1.79 1.11 1.0 1.04 0.87 1.72 1.49 1.1 0.91 0.88 0.85 1.42 1.27 1.54 1.38 1.94 1.72 1.18 1.11 1.66 1.46 1.39 1.21 1.86 1.68 1.08 1.06 1.19 1.12 1.75 1.57 1.15 1.04 2.1 1.77 1.75 1.55 1.72 1.45 1.86 1.62 1.28 1.1 1.78 1.61 1.37 1.2