红细胞增殖因子及其生产工艺 一.技术领域
本发明属于生化分离纯化技术领域。
二.背景技术
从人胎肾细胞培养液和人尿中可以分离到一种蛋白质，具有与EPO很相似的生物活性。体外促使13天胎鼠肝细胞形成红系集落(CFU-E)：体内使5/6肾切除所致的肾性贫血大鼠红细胞数量明显上升；对肾衰透析或透析前病人的肾性贫血亦有明显改善。此蛋白分子量59000左右，故当时命名为P59蛋白，此蛋白等电点在PH4.2左右，不能与EPO单抗结合。
三.发明内容
由于胎肾来源有限，而从人尿中分离则因含量较低需要很大规模，这些都限制了P59蛋白研究的开展。血浆中含该因子较富集，但血浆十分昂贵。经多次研究发现血浆在分离白蛋白和球蛋白以后的乙醇沉淀物中亦含有类似活性的蛋白，性质和人尿P59相似，但分子量较低，该蛋白在血浆中有一部分是和其他蛋白质结合成分子量10万以上的大分子形式存在，可能这是该蛋白在体内存在的形式，可以避免很快从尿中排出，这也是为什么在血浆中很容易检查出地原因，现将此蛋白命名为红细胞增殖因子Erythrocyte proliferating factor(EPF)。
本发明目的是从血浆中制备具有促进红细胞生成的新的生血因子—红细胞增殖因子(EPF)用于治疗除缺铁性贫血以外的多种红细胞贫血症。
EPF分子量经质谱测定为50000～52000Dalton，等电点为pH3.8～4.2，N端15个氨基酸与维生素D结合蛋白(DBP)的末端相同，但胰蛋白酶解图谱完全不同，亦不同于任何已知的其他蛋白。
EPF的纯化方法为将人血浆按Cohn法分离白蛋白和球蛋白后的乙醇沉淀物，以10倍pH6.8的PBS溶解，高速离心，截止分子量10万的超滤膜超滤，滤液经DEAE离子交换纤维素层析，洗去穿过峰，改用含0.25mol/L NaCl的PBS一次洗脱，洗脱峰经浓缩至溶液中无CL-检出为止，浓缩液经Sephacryl S-200凝胶柱过滤，收集活性峰3即为EPF，再经除热源，测蛋白，测活性，加辅料，除菌，除病毒，分装，冻干，即为冻干粉注射剂。Sephacryl洗脱图谱见附图1：
将凝胶过滤所得活性峰经HPLC反相柱二次分离，第一次中性分离得到5个峰，经测定活性集中在峰4中并除去了样品中的白蛋白，得率在8-9％。分离结果见附图2：
将峰4进行SDS-PAGE，并将主条带送北京协和医大基础所测序，结果发现N端序列与维生素D结合蛋白(DBP)一样，胰酶切图谱与DBP 100％吻合。我们将峰4在酸性条件下进行第二次HPLC分离，得到8个蛋白峰。分离结果见附图3：经用网红细胞法测定活性，在8个蛋白峰中唯有峰4有很高的活性，比活亦很高。将峰4经SDS-PAGE再经West blotting转入PVDF膜上，考马斯亮兰染色，表现在分子量51000左右有一条主带，分子量大约57000处一条细带，将主带送测N端序列。
1.EPF N端15个氨基酸的序列测定；将PVDF膜上主蛋白带用刀片切下送北京协和医大基础所，测序结果N端15个氨基酸与DBP的N端序列完全一致，但同一样品经SDS-PAGE，考马斯亮兰染色将主蛋白带凝胶切下送上海基康生物技术有限公司测定胰酶切图谱，所得图谱检索则与DBP的相似性很低；结果见附图4、5，等电点测定EPF为4.0而DBP为5.2两者相去甚远；而分子量为59000的峰7完全没有促红细胞生成的活性，故判定EPF虽然N端15个氨基酸的序列与DBP一样但并不是DBP，而是DBP家族中的一员，是一种新发现的促红细胞生成的生长因子，这是在红细胞生成的途径中发现的除EPO以外的唯一的其他调节刺激因子。
2.EPF的生物活性检测
经前述纯化方法得到的EPF制品用网红细胞法测定其活性：方法如下
将玻片一端涂以1％煌焦油兰(B2002 Brilliant Cresyl Blue/ALD)干燥以备用。
取雄性ICR小鼠21只，体重20-26g，3只小鼠一组，分成7组。一组为对照组，注射0.12ml生理盐水：两种实验样品各分3组，分别注射0.06ml，0.12ml，0.24ml。EPO用含0.05％人血白蛋白的PBS稀释为36Iu/ml；EPF配置成12-35ug/ml溶液(视EPF活性而定)。连续肌肉注射3天，第4天小鼠眼眶取血3-4滴加入已加有20ul肝素钠(50u/ml)的小管中充分混匀，取40ul加在涂有煌焦油兰的玻片上与染料混匀，放入湿盒中30分钟，在干净玻片上涂单层细胞，干燥后，用甲醇固定，再用吉姆萨染液复染，干燥后用高倍镜观察，计数500个红细胞中网红细胞数(有网状或点状染色的细胞核)每组3只平行小鼠，每只小鼠涂片两张，3个人分别计数，最后平均，得出网红细胞增加百分率。EPO促红细胞生成的线性范围在2-15u，超出此浓度网红细胞增长数与浓度不成比例，必须调整浓度。EPF亦存在同样问题，所以不同样品需选择不同浓度。
按上述测定方法测定EPF的生物活性并以EPO作为阳性对照，测得如下结果：
EPF对小鼠网红细胞的促进作用(网红细胞％)
注射体积ml 0.12 0.06 0.12 0.24
对照(生理盐水) 3.08
EPO 3.87 5.77 7.60
EPF 6.0 8.28 9.30
3.EPF和EPO的协同作用
将EPF和EPO同时给小鼠注射，检查网红细胞，发现两者有协同刺激网红细胞生成的作用，效果远超出单独使用的水平。
EPF和EPO的协同作用(网红细胞增加百分率％)
注射体积(ml)
EPO(36u/ml) EPF(34ug/ml) 网红细胞增加百分率(％)
1 0.12 2.65
2 0.24 4.52
3 0.12 5.72
4 0.24 6.22
5 0.06 0.06 6.15
6 0.12 0.12 7.27
组⑤网红数比组①增加132％，比组③增加7.5％。
组⑥网红数比组②增加60.8％，比组④增加16.9％。这种协同作用一方面证明EPF和EPO是两种不同的生血因子，作用在红细胞分化的不同阶段，所以同时存在时才可以协同增加红细胞的生成；其次，协同作用显示将来临床联合用药可加速红细胞的生成速度，或者减少EPO的用药量以降低副作用。
4.EPF与黏度的关系
据报道长期使用EPO会造成病人血黏度增加，出现血栓。取ICR小鼠15只，5只一组。第一组小鼠每只皮下注射EPF 82μg/ml 0.2ml(相当于人用剂量的46倍)；第二组小鼠每只皮下注射EPO 34u/ml 0.2ml(相当于人用剂量)；对照组注射生理盐水。连续注射30天后眼眶取血，送测血黏度及相关的各项指标共14项，结果EPO组比对照组各项指标有所提高，其中全血中，低切和全血还原黏度中低切比对照高出4-9.4％；而EPF组各项指标与对照组比较很一致，还略有下降，显示EPF不增加血液黏度。
5.急性毒性实验
取体重25g左右ICR小鼠30只，雌雄各半，分成三组对照组(生理盐水组)低剂量组2.86mg/kg(相当于人用剂量200倍)和高剂量组28.6mg/Kg(相当于人用剂量2000倍)一次腹腔注射后观察2周，隔日称体重，体重变化和对照组无明显差异，食欲，精神，活动无不良反应，表明EPF无毒付反应，LD50大于人用剂量2000倍
6.EPF的热稳定性实验
EPF在37℃，50℃，65℃，80℃加热10分钟，活性随温度上升而下降，EPF在60℃保持4，6至12小时，发现4小时后活性逐步丧失，而每ml中加海藻糖40mg可保护EPF的活性，EPF在60℃加热12小时，活性仍无下降趋势。
本发明的效果是：
EPO最大的副作用是会增加血液黏度形成血栓。而EPF没有这样的副作用。EPF N端15个氨基酸序列测定结果经检索与维生素D结合蛋白(DBP)序列相同，但胰蛋白酶切图谱与任何已知蛋白都不同。另外无论分子量，等电点和生物活性都与DBP不同，所以EPF是一种未经报道过的新的生血因子。EPF具有明显促进红细胞生成的作用，和EPO有很强的协同作用，此外还有不增加血黏度，在血液中存留时间长等优点。可作为制备治疗贫血的药物应用。
EPF的特点是天然，人源，安全，高效，价格低廉。EPF可作为治疗多种贫血症的药物，包括肾功能衰竭或血液透析、AIDS相关性贫血、自身免疫性贫血、恶性肿瘤、过量辐射对红细胞的破坏、药源性贫血、急性出血、功能性出血、衰老、早期早熟性贫血、高纬度或长期昏迷造成的缺氧等红细胞群数量不足或缺氧为特征的贫血症
四.附图说明
图1.为Sephacryl S-200凝胶柱分离图谱。血浆在制备白蛋白和球蛋白以后的乙醇沉淀物，经溶解、离心、超滤和DEAE分离后，在凝胶柱上进一步分离。凝胶柱直径2.5cm，高100cm。以pH6.8的0.02mol/L PBS平衡并洗脱共得3个蛋白峰经用网红细胞检查，第1，2峰均无活性，第3峰为活性峰。
图2为Sephacryal第3峰的HPLC反相柱的第一次分离图谱，仪器为惠普1050型高效液相色谱仪
柱子：Livrosphere C18-200 250×4.6mm
流动相A：0.75ml浓氨水，0.35ml冰乙酸/L
B：CH3CN
流速：0.7ml/min
梯度：0-25min B20→40％
27-30min B100％
uv：280nm 样品：40mg/ml A相
进样体积：100μl
在得到的5个蛋白峰中，仅峰4表现促进网红细胞生成的生物活性
图3为HPLC第一次分离中有活性的峰4冻干后第二次再用同一反相柱分离，但改为酸性洗脱条件。
流动相：A：0.1％TFA/H2O
B：CH3CN
流速：0.7ml/min
梯度：0-25min B25-50％
27-30min B100％
uv：280nm
分离得到8个蛋白峰，其中仅第4峰有很强生物活性
图4为EPF的胰蛋白酶酶解图谱。本实验为委托上海基康生物技术有限公司进行，仪器为Applied Biosystems Voyager System 6192，试验条件见图右侧所示，共有5个主要片段，分子量分别为927.7076，950.7271，1467.7167，1639.6518及1899.5811。而维D结合蛋白的酶切图谱只有分子量1326.9183和1388.8725两个主要片段。
图5.为DBP胰蛋白酶酶解图谱，条件同图4。
五.具体实施方式
取分离白蛋白和球蛋白后的血浆乙醇沉淀物100g，溶解在1L 0.02mol/L pH6.8的磷酸缓冲(PBS)中，11000r/min离心20分钟，收集上清液，通过截止分子量10万的膜进行超滤，收集分子量小于10万的滤液，共得8.928g蛋白质，将超滤液通过PBS平衡的DEAE纤维素柱进行层析，先用PBS洗去穿过峰，改用含0.25mol/LNaCl的PBS一次洗脱，洗脱峰除盐浓缩至10mg/ml左右，可得蛋白145mg左右，再经Sephacryl S-200凝胶柱过滤可得三个峰，峰III为EPF约得40mg。经SDS-PAGE检查发现产品除EPF外主要含有白蛋白及的其他血浆蛋白，鉴于制品在冻干时必须加入白蛋白作为保护剂，故白蛋白的存在不影响使用，EPF约占总蛋白的2％左右。
EPF是一种新发现的蛋白质细胞因子，还没有标准品，现将EPF的单位定为每增加网红细胞1/1000为一个单位(u)，比活性定义为每mg蛋白含EPF的单位数(u/mg)。测定条件：见三1所述，取直线范围内的实验剂量，如注射34ug/mg EPF0.12ml/天/鼠，网红细胞增加6.49％，即64.9u。0.12ml注射液中含蛋白质4.08ug，所以比活应确定为：15906.86u/mg。