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非肽类新生血管生成抑制剂
    本发明涉及的是一类以N-取代邻苯二甲酰亚胺为分子骨架的非肽类新生血管生成抑制剂，通过在分子骨架上引入相应的酸性和碱性取代基，从而使这类非肽化合物具有与Arg-Gly-Asp(RGD)三肽相似的空间结构。该类化合物具有显著的抑制血管内皮细胞增殖及抗新生血管生成活性。

    血管生成(angiogenesis)是指从已存在的血管床中产生新生血管系统的过程。在正常生理情况下，血管生成被严格控制于某些短暂的、特定的生理过程，如：生殖过程、发育过程及伤口愈合过程等，而存续的血管生成是某些病变如：肿瘤组织的恶性生长、糖尿病性视网膜病变、关节炎、骨质疏松等的特性。研究表明，肿瘤诱导的新生血管生成与肿瘤细胞的增殖、侵润和转移密切相关，一方面，肿瘤通过诱导新生血管生成为其提供充足的营养物质，另一方面，新生血管的形成提供了肿瘤细胞远位转移的通道。因此有效地抑制肿瘤诱导的新生血管生成，切断肿瘤细胞的营养供应和转移途径，将能有效地防治癌症；另外与传统的抗肿瘤药物相比，抗肿瘤新生血管生成药物是通过减少或阻断肿瘤组织的血液供应而使肿瘤细胞增殖周期延长，促进肿瘤细胞坏死而起作用，而不是直接杀死肿瘤细胞，故无明显毒副作用，并且可克服化疗过程中的抗药性问题，而抗药性是目前化疗手段失败的重要原因之一。

    目前对于肿瘤诱导的新生血管生成机制已有了一些了解，Brooks等人发现，新生血管生成依赖于血管内皮细胞之间、血管内皮细胞和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)间地相互粘附，该粘附过程是经αvβ3整合素介导的，该整合素在新生血管组织中显著表达。新生血管生成过程中血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、侵润和迁移都受到αvβ3整合素受体的调节。整合素αvβ3受体的配基为纤连蛋白(fibronectin)、层连蛋白(laminin)等细胞外基质成分中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列，当整合素αvβ3与RGD结合后，可激活Ca2+依赖的信号传导，导致血管内皮细胞迁移；使用抗αvβ3单抗(LM609)可阻止碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和人各种肿瘤片段诱导的新生血管生成，而对已存在的血管无影响。近年国外学者做了大量的以外源性的含RGD序列的短肽，如：GRGDS、RGD三聚肽polyRGD、环肽(cRGDfV)等来竞争性抑制αvβ3受体与内源性配基结合的研究工作，发现了一些具有明显抗新生血管生成的短肽。SAR研究表明，RGD序列中的精氨酸(Arg)侧链中的胍基和天冬氨酸(Asp)侧链的羧基为与整合素受体配合的药效基团。由于肽类药物都存在体内易降解、生物利用度低、需静脉给药、大量制备困难等不足，给进一步研究带来困难，并且抑制肿瘤新生血管生成需长期用药，以口服方式给药将是非常重要的。基于上述弊端，筛选具有高活性，高选择性，可以口服给药的非肽类新生血管生成抑制剂具有非常重要的意义。

    反应停(沙利度胺，thalidomide)是五十年代上市的镇静、催眠药物，后又被推荐用于治疗妇女的妊娠反应，由于其强烈的致畸作用，至六十年代中期撤出市场时，已使近万名海豹肢畸形胎儿出生，酿成近代药物史上规模最大、危害最严重的药害事件。根据最近的一些研究结果提示，其致畸作用可能是抑制了胎儿四肢新生血管的形成。D’amato等用兔角膜微囊筛选发现，当给兔口服反应停(200mg/kg)可抑制bFGF诱导的角膜新生血管生成，其抗新生血管生成活性与致畸性具有相关性。Neubert等发现，反应停及其类似物(EM-12)能显著下调灵长类哺乳动物胚胎四肢芽细胞上的一些粘附受体分子，使一些粘附受体消失或以低密度在胚胎上表达，细胞表面粘附受体的下调可能改变了细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，实验结果显示，对β3整合素的下调作用最为显著。另一些研究还显示，反应停可抑制单核细胞或巨噬细胞产生TNF-α，而TNF-α为血管生成因子，可诱导新生血管生成。

    经系统文献检索，与本发明相关的文献报道如下：

    [1]Harris AL.Antiangiogenesis for cancer therapy.The Lancet，

       1997，349(Suppl II)：13-15

    [2]Brooks PC，Clark RAF，Cheresh DA.Repuirement of vascular integrin

       αvβ3 for angiogenesis.Science，1994，264：569-571.

    [3]Brooks Pc，Montgomery AMP，Rosenfeld M，et al.Integrin αvβ3

       antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of

       angiogenic blood vessels.Cell，1994，79：1157-1164.

    [4]Amato RJD，Loughnan MS，Flynn E，et al.Thalidomide is an

       inhibitor of angiogenesis.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：4082-

       4085.

    本发明的目的在于提供一类具有高活性，高选择性，可以口服给药的非肽类小分子新生血管生成抑制剂，使之能克服肽类药物存在的体内易降解、生物利用度低需静脉给药、大量制备困难等弊端，可望进一步开发成为临床治疗药物。该类化合物具有显著的抑制血管内皮细胞增殖和抗新生血管生成活性，这对因新生血管生成而引起的疾病如：肿瘤组织的恶性生长、糖尿病性视网膜病变、关节炎、骨质疏松等的治疗，将会取得突破性效果。

    本发明的技术方案：用RGD三肽优势构象为模板，以反应停为先导化合物，合成了N-取代邻苯二甲酰亚胺分子骨架，在相应键距部位引入阳离子基因(如：胍基、哌嗪基等)和阴离子基因(如：羧基)。该化合物的特点为：一方面保留有RGD配体与整合素αvβ3受体的选择性亲合作用，抑制其与内源性配基的结合；另一方面又保留反应停的某些作用，即下调整合素β3的表达，减少新生血管部位受体数目和抑制TNF-α的产生，通过这种双重作用达到具有强的抑制新生血管生成活性。经文献检索和专利查新，目前尚未见有与本发明的化合物类型相同的报道。

    本发明设计的化合物结构通式如下所示：

    其中：

    X1-X2为C(O)-N；C(O)-CH；CHR1-N；-CHR1-CH；O-CH；S-CH；

    R1为H，C1～6烷基或苄基；

    R2为H，C1～6烷基，芳环-R3，芳杂环-R3，C3～6环烷基-R3，(CH2)mCOR4；R3为H，C1～4烷基，卤素，OR1，SR1，NR1，NO2，CN，CF3，COR4等；R4为OR1，SR1，NR1；R5为W-U-，Y-(CHR6)m-U-或Z-C(O)-；R6为H，C1～6烷基，芳环-R3，芳杂环-R3，C3～6环烷基-R3；m为0～2；n为0～4；U为NR1C(O)，C(O)-NR1，O-CH2，S-CH2，CH2-O，CH2-S，CH2CH2-，CH＝CH，C≡C；W为Ra为H，OH，NO2，N(R6)2，C(O)N(R6)2，CH2N(R6)2，R6HN-C(＝NH)，

    R6HN-C(＝NH)NH；Y为NH2，NHR6，N(R6)2，C(O)N(R6)2，OH，＝N-OR6，X3为O，S，NH；Z为

    Rb为H，C1～4烷基，芳环-R3，芳杂环-R3；

    RC为H，N(R1)2，C1～4烷基，C(O)N(R1)2，OH，OR1，芳环-R3，芳杂环-R3；本发明目标化合物的制备：本发明中化学结构通式中所包含的部分化合物可用下述的两种通法制备。

    方法1：a.)CH3COOH，reflux；b.)Et3N/toluene；c)150～200℃；d.)B-NH2，THF(DMF)，DCC(EDCI)，DMAP，HOBT；e.)SOCl2，reflux；f.)B-NH2，Py(Et3N)，CH2Cl2；g.)CH3COOH，5％Pd/C；h.)CF3COOH/CH2Cl2；or HCl/CH2Cl2。

    中间体(2)与(3)的缩合反应常用三种方法进行，即以乙酸为溶剂，将酸酐与氨基物混合，加热回流反应；以甲苯回流带水进行缩合；不加溶剂，将酸酐与氨基物混合，升温到150～200℃直接将生成的水蒸除。前两种方法反应条件较温和，收率高，并且当氨基物(3)为手性化合物时，在反应过程中消旋程度小；而最后一种方法由于反应温度高，产品颜色较深而影响质量，使收率也大大降低，当与手性氨基物(3)反应时，因反应条件激烈而发生部分消旋。中间体(4)与氨基物缩合形成酰胺需将羧基活化，常用活化方法有：酰氯法、混合酸酐法、DCC(EDCI)法等，当中间体(4)和氨基物中含有其它影响反应的基团时，应加以保护。中间体(5)的脱保护基条件依保护基性质而定，当保护基为苄基或类似物时，用催化氢解脱保护基；当保护基为叔丁酯或类似物时，用CF3COOH、HCl等脱保护基。方法2：a.)(1)KOH/C2H5OH，(2)ClCOOC2H5/DMF；b.)ClCOOC2H5/Et3N/DMF；c.)ClCOOC2H5/toluene/PTC/K2CO3；d.)Na2CO3/CH3CN；e.)NaOH/HCl；f.)Ac2O，reflux；g.)(1)CH3COOH，reflux or(2)Et3N/toluene；h.)RaneyNi/H2；or Pd/C。i.)B-COOH，DMF，DCC(EDCI)，DMAP，HOBT；j.)CH3COOH，5％Pd/C；k.)CF3COOH/CH2Cl2；or HCl/CH2Cl2。

    中间体(6)的制备可通过两条路线进行合成，即以N-乙氧羰基-4-硝基邻苯二甲酰亚胺(3)与相应氨基物反应，或以酸酐(5)与相应氨基物缩合而成。方法1反应条件温和，反应速度快，一般室温反应0.5～2小时即可以较高收率得到(6)；而方法2与Scheme(1)中方法相同。硝基的还原方法可根据底物的性质，采用Pd/C还原或RaneyNi还原，后者在底物中存在苄基或类似物时，一般不会发生氢解。目标物的合成与Scheme 1中的方法类似。本发明化合物的生物学活性研究：

    血管内皮细胞增殖是血管生成的重要步骤，因而能抑制内皮细胞增殖的化合物就有可能抑制新生血管生成。本发明中目标化合物的生物学活性研究采用抑制脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)增殖的药理模型来进行初步筛选，筛选实验中以RGDS四肽作为阳性对照物，细胞增殖的检测方法采用四氮唑盐还原法(MTT法)，筛选结果用血管内皮细胞增殖百分抑制率作为衡量目标物生物学活性的指标。实验结果显示，部分化合物具有显著的抑制内皮细胞增殖活性，并且其活性强于RGDS四肽。为了排除目标物因细胞毒活性对内皮细胞的杀灭而导致的假阳性结果，本发明还研究了化合物对乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞毒作用，结果表明，目标物的细胞毒作用不显著。实施例

    实施例一：5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸的合成1.β-氨基丙酸苄酯对甲苯磺酸盐(2)的制备

    β-氨基丙酸20.0克，苯甲醇90.0mL、对甲苯磺酸51.3克、苯500mL加入反应瓶中，回流搅拌反应8.0小时，反应结束后，减压回收溶剂，残余物用乙醇-乙醚(v/v＝1∶1)重结晶，得白色片状结晶70.0克，mp137～139℃，收率89.0％。2.5-羧基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸苄酯(3)的制备

    中间体(2)35.2克、4-羧基邻苯二甲酸酐19.3克、三乙胺32.0mL、甲苯500mL加入反应瓶中，回流搅拌反应5.0小时，反应结束后，减压回收甲苯，残余物用乙酸重结晶，得白色针状结晶30.0克，mp108～110℃，收率85.0％。1HNMR(CDCl3)：8.46(2H，m，Ar-H6，Ar-H4)，7.93(1H，d，J＝7.7Hz，Ar-H7)，7.30(5H，s，CH2Ph)，5.1(2H，s，CH2Ph)，4.1(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)，2.80(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)；MS(EI)：354(M+1)。3.5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸苄酯(4)的制备

    2-胺甲基苯并咪唑3.3克、中间体(3)3.53克、三乙胺7.7mL、二氯甲烷60.0mL加入反应瓶中，置冰浴中冷却至0℃，分批加入DCC3.0克，0～5℃保温反应1.0小时后，室温搅拌反应过夜；反应结束后，滤除生成的DCU，滤液依次用25mL×2饱和Na2CO3水溶液、25mL去离子水、20mL饱和NaCl水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥；减压蒸除溶剂得(4)粗品，所得粗品经甲醇-乙醚重结晶，得白色粉末结晶3.8克，mp164～166℃，收率85.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.39(1H，brs，imidazole-NH)，9.62(1H，t，J＝5.4Hz，NHCH2)，8.41(1H，s，Ar-H4)，8.36(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H6)，8.00(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H7)，7.51(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.32(5H，s，CH2Ph)，7.17(2H，m，benzimidazole-H5，6)，5.07(2H，s，CH2Ph)，4.95(2H，d，J＝5.4Hz，NHCH2)，3.89(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)，2.78(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)。4.5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸的合成

    化合物(4)3.80克、甲醇50mL、催化量5％Pd/C加入反应瓶中，于常温常压下通H2反应24小时；反应结束后，过滤，少量甲醇洗涤，滤液减压蒸除溶剂，得白色粉末固体1.50克，mp272～275℃，收率85.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.34(1H，brs，imidazole-NH)，9.59(1H，t，J＝5.4Hz，NHCH2)，8.41(1H，s，Ar-H4)，8.36(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H6)，8.02(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H7)，7.50(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.15(2H，m，benzimidazole-H5，6)，4.74(2H，d，J＝5.4Hz，NHCH2)，3.82(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)，2.64(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)。 

    实施例二：

    (±)-5-[[2-(2-苯并咪唑)乙胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(3-苯基)丙酸的合成1.(±)-3-氨基-3-苯基丙酸苄酯对甲苯磺酸盐(2)的制备

    (±)-3-氨基-3-苯基丙酸19.0克、苄醇46.4mL、对甲苯磺酸26.3克、苯700mL加入反应瓶中，回流搅拌反应8.0小时，反应结束后，减压回收溶剂，残余物用乙醇-乙醚(v/v＝1∶1)重结晶，得白色片状结晶47.0克，mp154～156℃，收率96.0％。2.(±)-5-羧基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(3-苯基)丙酸苄酯(3)的制备

    4-羧基邻苯二甲酸酐9.61克、化合物(2)21.4克、乙酸500mL加入反应瓶中，回流搅拌反应6.0小时，反应结束后，蒸除乙酸，残余物溶于100mL乙酸乙酯中，有机层依次用50mL×2去离子水、50mL饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥、减压蒸除溶剂，得浅黄色固体，所得粗品经乙醇-水重结晶，得白色颗粒结晶17.0克，mp136～138℃，收率80.0％。1HNMR(DMSO-d6)：13.71(1H，brs，COOH)，8.36(1H，m，Ar-H6)，8.18(1H，s，Ar-H4)，7.96(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H7)，7.44～7.28(5H，m，Ph)，7.23～7.17(5H，m，CH2Ph)，5.74(1H，dd，J1＝6.4Hz，J2＝9.4Hz，CH)，5.00(2H，s，CH2Ph)，3.66(1H，dd，J1＝9.4Hz，J2＝16.4Hz，CH2)，3.45(1H，dd，J1＝6.4Hz，J2＝16.4Hz，CH2)；MS(EI)：430(M+1)。3.(±)-5-[[2-(2-苯并咪唑)乙胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(3-苯基)丙酸

    苄酯(4)的制备

    中间体(3)4.29克、氯化亚砜80.0mL加入反应瓶中，回流搅拌反应3.0小时，反应结束后，减压蒸除过量的氯化亚砜，得浅黄色油状物，不经纯化直接用于下步反应。

    将2-苯并咪唑乙胺二盐酸盐3.51克、二氯甲烷200.0mL、三乙胺6.7mL、吡啶10.0mL加入反应瓶中，置冰浴中冷却至0℃，滴加上步反应所制得的酰氯溶于100mL二氯甲烷的溶液，自然升温至室温，搅拌反应过夜；反应结束后，有机层依次用75mL饱和Na2CO3水溶液、50mL去离子水、50mL饱和NaCl水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥；减压蒸除溶剂，得类白色固体3.0克，mp147～149℃，收率52.5％。1HNMR(DMSO-d6)：12.35(1H，s，imidazole-NH)，9.07(1H，t，J＝5.1Hz，NHCH2)，8.25(H，m，Ar-H6，Ar-H4)，7.92(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H7)，7.42(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.36(5H，m，Ph)，7.19(5H，s，CH2ph)，7.14(2H，m，benzimidazole-H5，6)，5.74(1H，dd，J1＝6.4Hz，J2＝9.4Hz，CH)，5.03(2H，s，CH2Ph)，3.75(2H，m，NHCH2)，3.65(1H，dd，J1＝9.4Hz，J2＝16.4Hz，CH2)，3.46(1H， dd，J1＝6.4Hz，J2＝16.4Hz，CH2)3.12(2H，t，J＝6.70Hz，CH2)。4.(±)-5-[[2-(2-苯并咪唑)乙胺基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(3-苯基)丙酸的合成

    参照实施例一中目标物合成方法进行催化氢解，得白色粉末固体，mp142～145℃，收率68.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.36(1H，brs，imidazole-NH)，9.09(1H，t，J＝5.1Hz，NHCH2)，8.28(1H，s，Ar-H4)，8.26(1H，d，J＝8.16Hz，Ar-H6)，7.95(1H，d，J＝8.16Hz，Ar-H7)，7.46(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.37(5H，m，Ph)，7.12(2H，m，benzimidazole-H5，6)，5.70(1H，t，J＝7.18Hz，CH)，3.73(2H，q，NHCH2)，3.42(2H，m，CH2)，3.11(2H，t，J＝7.0Hz，CH2)。

    实施例三：(-)-5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基-N-甲基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-羧基)丁酸的合成1.(-)-谷氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐(2)的制备

    按照实施例一中间体(2)所述方法进行，得白色针状结晶，mp140～142℃，收率97.0％。2.N-甲基-1H-苯并咪唑-2-甲胺(3)的制备

    在反应瓶中加入甲胺乙醇溶液90.0mL，冷却至0℃，分批加入2-氯甲基苯并咪唑3.0克，然后升温至室温，搅拌反应过夜；反应结束后，减压蒸除溶剂，得黄色油状物，加入20.0mL乙醚，室温静置，抽滤、干燥，得白色针状结晶1.8克，mp131～133℃，收率62.1％。1HNMR(DMSO-d6)：12.20(1H，brs，imidazole-NH)，7.48(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.12(2H，m，benzimidazole-H5，6)，3.85(2H，s，CH2)，2.32(3H，s，CH3)；MS(EI)：161(M+)。3.(-)-5-羧基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-苄氧羰基)丁酸苄酯(4)的制备

    按照实施例一中间体(3)所述方法进行，得白色针状结晶，mp162～164℃，收率64.0％。1HNMR(CDCl3)：8.50(2H，m，Ar-H6，Ar-H4)，7 96(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H7)，7.36～7.27(10H，m，2×CH2Ph)，5.20(2H，s，CH2Ph)，5.06(2H，s，CH2Ph)，5.02(1H，m，CH)，2.72～2.55(2H，m，CH2)，2.45(2H，m，CH2)；MS(EI)：503(M+1)。4.(-)-5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基-N-甲基]羰基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-苄氧羰基)丁酸苄酯(5)的制备

    在反应瓶中加入中间体(3)2.42克、中间体(4)5.01克、二氯甲烷200.0mL，搅拌至固体全溶后，置冰浴中冷却至0℃，加入DMAP 0.16克、DCC3.0克，于0～5℃搅拌反应2.0小时后，室温搅拌反应过夜；反应结束后，过滤，少量二氯甲烷洗涤滤饼，有机层依次用35mL×2饱和Na2CO3水溶液、50mL去离子水、50mL饱和NaCl水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥；减压蒸除二氯甲烷，得白色泡沫体4.6克，mp56～59℃，收率71.5％。1HNMR(DMSO-d6)：12.44(1H，brs，imidazole-NH)，8.00(3H，m，Ar-H4，Ar-H6，Ar-H7)，7.56(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.28(10H，m，2×CH2Ph)，7.18(2H，m，benzimidazole-H5，6)，5.17(2H，s，CH2Ph)，5.15(1H，m，CH)，4.99(2H，s，CH2Ph)，4.93，4.65(2H，2s，CH2N)，3.03，2.98(3H，2s，CH3N)，2.48(2H，m，CH2)，2.37(2H，m，CH2)；MS(EI)：644(M+)。5.(-)-5-[[(2-苯并咪唑)甲胺基-N-甲基]羰基J-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-羧基)丁酸的合成

    参照实施例一目标物合成方法进行催化氢解，得白色粉末固体，mp190～192℃，收率76.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.47(1H，brs，imidazole-NH)，8.00(3H，m，Ar-H4，Ar-H6，Ar-H7)，7.56(2H，m，benzimidazole-H4，7)，7.19(2H，m，benzimidazole-H5，6)，4.83(1H，m，CH)，4.94，4.66(2H，2s，CH2N)，3.03，3.00(3H，2s，CH3N)，2.32(2H，m，CH2)，2.28(2H，m，CH2)；MS(FAB)：465.0(M++1)。

    实施例四：5-[(胍乙酰基)氨基]-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸盐酸盐的合成1.N-乙氧羰基-4-硝基邻苯二甲酰亚胺(2)的制备

    将4-硝基邻苯二甲酰亚胺11.52克，溶于60mLDMF中，冷却至0℃，加入三乙胺9.5mL，滴加氯甲酸乙酯7.3mL，控制反应温度为0～5℃，约90分钟加完；自然升温至室温，继续反应4.0小时。反应结束后，将反应液慢慢倾入400mL冰水中并快速搅拌，析出浅黄色固体，室温静置10分钟后，抽滤，少量冰水洗涤，将固体溶于90.0mL氯仿中，用30mL×2冰水洗涤，氯仿层用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩至有固体析出，加入40.0mL石油醚，抽滤、干燥，得类白色粗品，经丙酮-异丙醚(v/v＝1∶1)重结晶后，得白色针状结晶12.40克，mp120～121.5℃，收率78.3％。1HNMR(CDCl3)：8.79(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H4)，8.70(1H，dd，J1＝2.0Hz，J2＝8.0Hz，Ar-H6)，8.19(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H7)，4.53(2H，q，J＝7.2Hz，CH2)，1.47(3H，t，J＝7.2Hz，CH3)；MS(EI)：264(M+)。2.5-硝基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸(3)的制备

    β-氨基丙酸3.61克，Na2CO3·10H2O 11.37克，100mL去离子水加入反应瓶中，搅拌至固体全溶，分批加入中间体(2)10.72克，室温搅拌反应30分钟后，过滤除去少量固体，滤液用2N盐酸调溶液pH至1～2，静置15分钟后过滤，少量冰水洗涤，抽干；所得粗品经水重结晶，得白色颗粒晶体8.0克，mp208～210℃，收率74.7％。3.5-氨基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸(4)的制备

    中间体(3)5.1克，丙酮100mL，催化量10％Pd(OH)2/C加于反应瓶中，常温常压下催化氢化8.0小时，反应结束后，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，滤液减压浓缩至干，残余物中加入50mL乙醚，过滤干燥，得黄色粉末固体3.5克，mp200～202℃，收率77.43％。1HNMR(DMSO-d6)：12.31(1H，brs，COOH)，7.49(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H7)，6.90(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H4)，6.78(1H，dd，J1＝2.0Hz，J2＝8.0Hz，Ar-H6)，6.47(2H，brs，NH2)，3.70(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)，2.51(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)；MS(EI)：235(M+1)。4.5-氨基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸苄酯(5)的制备

    将苄醇40.0mL加入反应瓶中，冷却到-5℃，滴加入SOCl23.6mL，0～5℃反应30分钟后，室温继续反应1.5小时，加入上步中间体(4)克，室温搅拌反应3.5小时，反应结束后，加入适量乙醚-石油醚混合溶剂，搅拌均匀，过滤；所得固体悬浮在50mL冰水中，用饱和Na2CO3水溶液调溶液pH至9～10，100mL×2乙酸乙酯萃取，乙酯层依次用20mL×2冰水、20mL饱和NaCl水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，减压蒸出乙酯后，得黄绿色固体，所得粗品经乙醇-乙醚重结晶，得黄绿色晶体3.63克，mp109～110℃，收率56.0％。1HNMR(DMSO-d6)：7.47(1H，d，J＝8.2Hz，Ar-H7)，7.30(5H，s，CH2Ph)，6.90(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H4)，6.78(1H，dd，J1＝2.0Hz，J2＝8.2Hz，Ar-H6)，6.47(2H，brs，NH2)，5.00(2H，s，CH2Ph)，3.76(2H，t，J＝7.1Hz，CH2)，2.68(2H，t，J＝7.1Hz，CH2)；MS(EI)：324(M+)。5.5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸苄酯盐酸盐(6)的制备

    上步中间体(5)324.0mg，胍基乙酸盐酸盐230.3mg，DMAP 15.0mg，DMF20.0mL加于反应瓶中，冷却至0℃，慢慢滴加313mgDCC溶于5.0mLDMF的溶液，约2小时加完，0～5℃搅拌反应1.0小时后，升温至室温搅拌反应24小时；反应结束后，过滤，滤饼用少量DMF洗涤，滤液减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3∶CH3OH＝10∶1(v/v))，得白色固体300.0mg，mp199～201℃，收率65.0％。1HNMR(DMSO-d6)：11.05(1H，brs，＝NH)，8.19(1H，m，Ar-H4)，7.87(2H，m，Ar-H6，Ar-H7)，7.55(1H，t，J＝12.4Hz，NHCH2)，7.31(5H，s，CH2Ph)，7.34～7.27(4H，brs，NH3+，NH)，5.05(2H，s，CH2Ph)，4.15(2H，d，J＝6.3Hz，NHCH2)，3.83(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)，2.74(2H，t，J＝7.2Hz，CH2)；MS(EI)：423(M-HCl)。6.5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-丙酸盐酸盐的合成

    中间体(6)300.0mg，溶于50mL甲醇中，加入催化量的5％Pd/C，常温常压下催化氢解5.0小时。反应结束后，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤，滤液减压浓缩至干，残余物中加入适量乙醚，过滤干燥，得浅黄色粉末固体188.0mg，mp168～170℃，收率78.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.35(1H，brs，COOH)，11.15(1H，brs，＝NH)，8.21(1H，d，J＝1.5Hz，Ar-H4)，7.94(1H，dd，J1＝1.5Hz，J2＝8.2Hz，Ar-H6)，7.84(1H，d，J＝8.2Hz，Ar-H7)，7.69(1H，brs，NHCH2)，7.40(4H，brs，NH3+，NH)，4.17(2H，d，J＝6.2Hz，NHCH2)，3.79(2H，t，J＝7.4Hz，CH2)，2.59(2H，t，J＝7.4Hz，CH2)。

    实施例五：(±)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-[3-(4-甲氧基)苯基]丙酸盐酸盐的合成1.(±)-3-氨基-3-(4-甲氧基)苯基丙酸苄酯对甲苯磺酸盐(2)的制备

    在反应瓶中加入(±)-3-氨基-3-(4-甲氧基)苯基丙酸30.0克，苯甲醇62.0mL，对甲苯磺酸36.0克，苯300mL，升温回流搅拌反应16小时，反应结束后，减压回收苯，残余物中加入100mL乙醚，过滤干燥，所得粗品用乙醇-乙醚(1∶1)重结晶，得白色片状结晶48.0克，mp170～172℃，收率68.6％。2.(±)-5-硝基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-[3-(4-甲氧基)苯基]丙酸苄酯(3)的制备

    中间体(2)2.29克、Na2CO3·10H2O 0.53克、15.0mL水加入反应瓶中，滴加1.32克N-乙氧羰基-4-硝基邻苯二甲酰亚胺溶于10.0mL乙腈的溶液，室温搅拌反应1.5小时后，减压蒸除乙腈，水层用20mL×2乙酸乙酯萃取，酯层经无水Na2SO4干燥后，减压蒸出乙酯，得浅黄色油状物粗品，所得粗品经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3)，得浅黄色油状物1.64克，收率71.0％。1HNMR(CDCl3)：8.51(2H，m，Ar-H4，Ar-H6)，7.92(1H，d，J＝7.9Hz，Ar-H7)，7.44(2H，d，J＝6.8Hz，Ar-OCH3)，7.21(5H，s，CH2Ph)，6.84(2H，d，J＝6.8Hz，Ar-OCH3)，5.78(1H，dd，J1＝5.4Hz，J2＝10.8Hz，CH)，5.00(2H，s，CH2Ph)，3.88(1H，dd，J1＝10.8Hz，J2＝16.3Hz，CH2)，3.21(1H，dd，J1＝5.4Hz，J2＝16.3Hz，CH2)；MS(EI)：460(M+)。3.(±)-5-氨基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-[3-(4-甲氧基)苯基1丙酸苄酯(4)的制备

    中间体(3)1.64克、乙酸乙酯30mL加于反应釜中，加入适量RaneyNi催化剂，在2～10大气压条件下还原反应10.0小时；反应结束后，过滤，少量乙酸乙酯洗涤滤饼，滤液减压蒸出溶剂，残余物经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3)，得黄绿色油状物1.23克，收率80.0％。1HNMR(CDCl3)：7.46(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H7)，7.42(2H，d，J＝6.8Hz，Ar-OCH3)，7.22(5H，m，CH2Ph)，6.90(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H4)，6.81(2H，d，J＝6.8Hz，Ar-OCH3)，6.70(1H，dd，J1＝2.0Hz，J2＝8.0Hz，Ar-H6)，5.74(1H，dd，J1＝6.2Hz，J2＝9.8Hz，CH)，5.05(2H，s，CH2Ph)，3.75(3H，s，OCH3)，3.73(1H，dd，J1＝9.8Hz，J2＝16.2Hz，CH2)，3.28(1H，dd，J1＝6.2Hz，J2＝16.2Hz，CH2)；MS(EI)：431(M++1)。4.(±)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-[3-(4-甲氧基)苯基]丙酸苄酯盐酸盐(5)的制备

    参照实施例四中间体(6)的制备方法进行，得浅黄色粉末固体，mp82～85℃，收率53.1％。1HNMR(DMSO-d6)：11.13(1H，brs，＝NH)，8.16(1H，d，J＝2.8Hz，Ar-H4)，7.90(1H，dd，J1＝2.8Hz，J2＝8.0Hz，Ar-H6)，7.80(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H7)，7.60(1H，m，NHCH2)，7.40～7.20(4H，brs，NH3+，NH)，7.32(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-OCH3)，7.22(5H，m，CH2Ph)，6.88(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-OCH3)，5.62(1H，dd，J1＝7.2Hz，J2＝9.2Hz，CH)，5.03(2H，s，CH2Ph)，4.16(2H，d，J＝5.6Hz，NHCH2)，3.71(3H，s，OCH3)，3.62(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝16.0Hz，CH2)，3.35(1H，dd，J1＝7.2Hz，J2＝16.0Hz，CH2)；MS(EI)：529(M+-HCl)。5.(±)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-[3-(4-甲氧基)苯基]丙酸盐酸盐的合成

    参照实施例四中目标物的制备方法进行，得类白色粉末固体，mp130～132℃(dec)，收率66.1％。1HNMR(DMSO-d6)：12.36(1H，brs，COOH)，11.15(1H，s，＝NH)，8.20(1H，d，J＝2.8Hz，Ar-H4)，7.95(1H，dd，J1＝2.8Hz，J2＝8.4Hz，Ar-H6)，7.83(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H70)，7.66(1H，brs，NHCH2)，7.50～7.20(4H，brs，NH3+，NH)，7.32(2H，d，J＝9.6Hz，Ar-OCH3)，6.89(2H，d，J＝9.6Hz，Ar-OCH3)，5.59(1H，dd，J1＝7.2Hz，J2＝9.2Hz，CH)，4.16(2H，d，J＝6.0Hz，NHCH2)，3.70(3H，s，OCH3)，3.42(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝16.4Hz，CH2)，3.23(1H，dd，J1＝7.2Hz，J2＝16.4Hz，CH2)。

    实施例六：(-)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-羧基)丁酸盐酸盐的合成1.(-)-5-硝基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-苄氧羰基)-丁酸苄酯(2)的制备

    (-)-谷氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐3.1克、Na2CO3·10H2O 1.78克、20.0mL水加入反应瓶中，冷却至0℃，滴加1.64克N-乙氧羰基-4-硝基邻苯二甲酰亚胺溶于15.0mL乙腈的溶液，室温搅拌反应2.0小时后，减压蒸除乙腈，水层用25mL×2乙酸乙酯萃取，酯层经无水Na2SO4干燥后，减压蒸出乙酯，得浅黄色油状物粗品，所得粗品经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3)，得浅黄色油状物2.50克，收率80.0％。1HNMR(CDCl3)：8.61(1H，d，J＝1.24Hz，Ar-H4)，8.57(1H，d，J＝7.4Hz，Ar-H7)，8.00(1H，dd，J1＝1.24Hz，J2＝7.4Hz，Ar-H6)，7.31(10H，m，2×CH2Ph)，5.18(2H，S，CH2Ph)，5.03(2H，s，CH2Ph)，5.01(1H，m，CH)，2.65(2H，m，CH2)，2.47(2H，m，CH2)；MS(EI)：502(M+)。2.(-)-5-氨基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-苄氧羰基)-丁酸苄酯(3)的制备

    中间体(2)2.50克、丙酮50.0mL、乙酸乙酯20mL、催化量RaneyNi催化剂加于反应釜中，在2～10大气压条件下还原反应12.0小时；反应结束后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3)，得黄色油状物2.10克，收率89.4％。1HNMR(CDCl3)：7.59(1H，d，J＝8.20Hz，Ar-H7)，7.34(10H，m，2×CH2Ph)，7.00(1H，d，J＝2.0Hz，Ar-H4)，6.82(1H，dd，J1＝2.0Hz，J2＝8.2Hz，Ar-H6)，5.19(2H，s，CH2Ph)，5.06(2H，s，CH2Ph)，4.93(1H，m，CH)，2.63(2H，m，CH2)，2.46(2H，m，CH2)；MS(EI)：472(M+)。3.(-)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-苄氧羰基)-丁酸苄酯盐酸盐(4)的制备

    胍基乙酸盐酸盐307.0mg，中间体(3)472.0mg，DMAP 15.0mg，DMF20.0mL加于反应瓶中，冷却至0℃，慢慢滴加313mgDCC溶于5.0mLDMF的溶液，约2小时加完，0～5℃搅拌反应2.0小时后，室温搅拌反应24小时，反应结束后，过滤，滤饼用少量DMF洗涤，滤液减压浓缩至干，得黄色固体，所得粗品经柱层析纯化(洗脱液为CHCl3∶CH3OH＝10∶1(v/v))，得白色粉末固体300.0mg，mp90～92℃，收率49.4％。1HNMR(DMSO-d6)：11.22(1H，s，＝NH)，8.23(1H，d，J＝2.6Hz，Ar-H4)，7.96(1H，dd，J1＝2.6Hz，J2＝7.8Hz，Ar-H6)，7.88(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H7)，7.66(1H，brs，NHCH2)，7.45～7.20(4H，brs，NH3+，NH)，7.28(10H，m，2×CH2Ph)，5.16(2H，s，CH2Ph)，5.01(1H，m，CH)，4.97(2H，s，CH2Ph)，4.18(2H，d，J＝6.0Hz，NHCH2)，2.45(2H，m，CH2)，2.34(2H，m，CH2)；MS(EI)：571(M-HCl)。4.(-)-5-胍乙酰胺基-1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-(4-羧基)丁酸盐酸盐的合成

    中间体(4)300.0mg，溶于40mL甲醇中，加入催化量5％Pd/C，常温常压下催化氢解10.0小时。反应结束后，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤，滤液减压浓缩至干，得一白色泡沫体152.0mg，mp110～112℃，收率72.0％。1HNMR(DMSO-d6)：12.45(1H，brs，COOH)，11.13(1H，s，＝NH)，8.24(1H，d，J＝2.5Hz，Ar-H4)，7.97(1H，dd，J1＝2.5Hz，J2＝8.4Hz，Ar-H6)，7.88(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H7)，7.67(1H，brs，NHCH2)，7.40(4H，brs，NH3+，NH)，4.76(1H，m，CH)，4.17(2H，d，J＝6.2Hz，NHCH2)，2.33(1H，m，CH)，2.28(2H，m，CH2)，2.23(1H，m，CH)。

    实施例七：目标化合物对人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)的抑制活性研究

    将待测样品溶于DMSO中，配成浓度为2×10-3mol/L的溶液，然后用含5％新生小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至所需浓度，供生物学活性筛选。本发明药理筛选用RGDS四肽作为阳性对照物。

    冻存的ECV304血管内皮细胞株经复苏后，将之培样于含10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液中，细胞增殖传代培养至一定数量后，将细胞悬浮在含5％新生小牛血清的RPMI-1640培养液中，接种至96孔培养板内，每孔接种2～3万个细胞，在37℃、5％CO2孵箱中培养24小时后，吸去培养液；加入待测样品(浓度为10-6mol/L)100μL/孔；然后于37℃、5％CO2孵箱中孵育72小时，加入MTT溶于PBS的溶液(浓度为5mg/mL)10μL/孔，在孵箱中继续孵育4.0小时，移去液体，加入DMSO 100μL/孔，振摇10分钟后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度(OD值)，各待测样品对ECV304血管内皮细胞的抑制率按照下式进行计算：各待测样品对ECV304血管内皮细胞的百分抑制率如表所示：

    化合物的结构及其对ECV304血管内皮细胞的抑制活性                  R5＝Y-(CHR6)m-U-  对ECV304细  胞的抑制率    (％)Entry        Y    -(CHR6)m-U-   R2   n   1 H2NC(＝NH)NH    CH2CONH    H   1     41.3   2 H2NC(＝NH)-NH   CH2CH2CONH    H   1     26.2   3 H2NC(＝NH)-NH     CH2CONH    Ph   1     19.3

    实验结果表明，化学结构通式中所包含的部分化合物对人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)的增殖具有显著的抑制活性，并且部分化合物的抑制活性较对照品RGDS显著增强。实施例八：化合物Entry 1和Entry 10对乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制作用

    将乳腺癌细胞(MCF-7)悬浮于含5％去固醇新生小牛血清的RPMI-1640培养液中，接种至96孔培养板内，每孔接种2～3万个细胞，在37℃、5％CO2孵箱中培养24小时后，加入待测样品溶于含5％去固醇新生小牛血清RPMI-1640培养液的溶液(浓度为10-5～10-10mol/L)100μL/孔；然后于37℃、5％CO2孵箱中孵育72小时，加入MTT溶于PBS的溶液(浓度为5mg/mL)10μL/孔；在孵箱中继续孵育4.0小时后，移去孔中的液体，加入DMSO 100μL/孔，振摇10分钟后，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度(OD值)，化合物Entry1和Entry10对乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率按照上式进行计算。

    结果表明在浓度为10-5～10-10mol/L范围内，化合物Entry1和Entry10对乳腺癌细胞(MCF-7)没有抑制作用。