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1、10申请公布号CN104169437A43申请公布日20141126CN104169437A21申请号201280070541022申请日2012122111306776320111223EPC12Q1/6820060171申请人生物梅里埃公司地址法国玛西勒托勒72发明人弗郎索瓦帕耶赛琳尚邦凯西圣帕特里克74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人王思琪郑霞54发明名称甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的MECA变体菌株的检测57摘要本发明提供用于检测携带变体MECA基因的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌METHICILLINRESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUS的改。
2、进的检测。该检测对于消除由于患者样品中MRSA中这一变体的存在的某些假阴性结果尤其有用。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014082286PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0768562012122187PCT国际申请的公布数据WO2013/093106EN2013062751INTCL权利要求书6页说明书39页序列表6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书6页说明书39页序列表6页附图1页10申请公布号CN104169437ACN104169437A1/6页21一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌METHICILLINRESIST。
3、ANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUS,MRSA的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中所述SCCMEC盒包含MECA变体元件,所述方法包括利用包含以下的寡核苷酸组对所述样品进行扩增反应A第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和B第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与MECA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,和任选地,C第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的。
4、杂交区域之间的区域中特异性地杂交,其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述MRSA,则所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域被扩增,且其中如果使用所述第三寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述MRSA,则检测到所述第三寡核苷酸的杂交。2根据权利要求1所述的方法,其中所述金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端接合区是右末端接合区。3根据权利要求1所述的方法,其中所述第三寡核苷酸与以下特异性地杂交金黄色葡萄球菌染色体DNA的区域;金黄色葡萄球菌染色体DNA的ORFX的区域;SCCMEC盒DNA的右末端接合区的区域;。
5、或所述MECA变体的区域。4根据权利要求1所述的方法,其中所述第一寡核苷酸与金黄色葡萄球菌染色体DNA的ORFX的区域特异性地杂交。5根据权利要求1所述的方法,其中所述第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO9和10;和/或所述第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO6、7、14、15、16、17、20和21和/或如果使用所述第三寡核苷酸,则所述第三寡核苷酸包含如SEQIDNO8、11、18和19所列的核酸序列。6根据权利要求1至5的任一项所述的方法,所述方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCMEC盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第二寡核苷。
6、酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA,其中所述SCCMEC盒包含MECA,所述第二寡核苷酸组包含A第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;B第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述包含MECA的MRSA的SCCMEC盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,和任选地,C第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,权利。
7、要求书CN104169437A2/6页3其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述包含MECA的MRSA,则所述右接合点被扩增,且其中如果使用所述第三接合寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述包含所述右末端接合点的MRSA,则检测到所述第三接合寡核苷酸的杂交。7根据权利要求6所述的方法,其中所述第三接合寡核苷酸具有能够在以下中特异性地杂交的核酸序列所述SCCMEC盒的右末端接合区的区域,或ORFX。8根据权利要求6所述的方法,其中所述第一寡核苷酸具有能够在ORFX中特异性地杂交的核酸序列。9根据权利要求1至8的任一项所述的方法,所述方法还包括,。
8、通过在扩增反应中利用用于扩增MECA元件的第三寡核苷酸组,扩增包含MECA的金黄色葡萄球菌,所述第三寡核苷酸组包含A第一MECA寡核苷酸,所述第一MECA寡核苷酸具有能够在MECADNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二MECA寡核苷酸,所述第二MECA寡核苷酸具有能够在MECADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一MECA寡核苷酸和所述第二MECA寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述MECADNA的部分被扩增且其中,任选地,所述第三寡核苷酸组还包含第三MECA寡核苷酸,所述第三MECA寡核苷酸具有能够在所述MECA的在所述第一MECA寡核苷酸的杂交区域与所述第二M。
9、ECA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果使用所述第三MECA寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述包含MECA的MRSA,则检测到所述第三MECA寡核苷酸的杂交。10根据权利要求1至9的任一项所述的方法,所述方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含A第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,。
10、其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增且其中,任选地,所述第四寡核苷酸组还包含第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果使用所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,那么如果所述样品包含所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域,则检测到所述第三寡。
11、核苷酸的杂交。权利要求书CN104169437A3/6页411一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中所述SCCMEC盒包含MECA或MECA变体元件,所述方法包括利用以下对所述样品进行扩增反应A第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含1第一MECA变体寡核苷酸,所述第一MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和2第二MECA变体寡核苷酸,所述第二MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地3第三MECA变体。
12、寡核苷酸,所述第三MECA变体寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一MECA变体寡核苷酸的杂交区域和所述第二MECA变体寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,其中如果所述样品包含所述包含MECA变体元件的MRSA,则检测到所述第三MECA变体寡核苷酸的杂交;和B第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含1第一MECA寡核苷酸,所述第一MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,2第二MECA寡核苷酸,所述第二MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,和任选地3第三MECA寡核苷酸,所述第三MECA寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一MECA。
13、寡核苷酸的杂交区域和所述第二MECA寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,其中如果所述样品包含所述包含MECA的MRSA,则检测到所述第三MECA寡核苷酸的杂交;其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述MRSA,则所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域被扩增。12根据权利要求11所述的方法,其中所述第一MECA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO6、7、14、15和20;和/或所述第二MECA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO16、17和21和/或如果使。
14、用所述第三MECA变体寡核苷酸,则所述MECA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO8、18和19。13根据权利要求1至11的任一项所述的方法,其中所述MECA变体是MECALGA251。14根据权利要求11所述的方法,所述方法还包括,通过在扩增反应中利用用于扩增SCCMEC盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端接合点的第三寡核苷酸组,扩增在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA,所述第二寡核苷酸组包含A第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和。
15、B第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述包含MECA的MRSA的权利要求书CN104169437A4/6页5SCCMEC盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果所述样品包含所述包含MECA的MRSA,则所述右接合点被扩增,和任选地,C第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果所述样品包含所述包含所述右末端接合点的MRSA,则检测到所述第三接合寡核苷酸的杂交。15根据权。
16、利要求14所述的方法,其中所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述SCCMEC盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,或具有能够在ORFX中特异性地杂交的核酸序列。16根据权利要求14所述的方法,其中所述第一接合寡核苷酸具有能够在ORFX中特异性地杂交的核酸序列。17根据权利要求11至14的任一项所述的方法,所述方法还包括利用用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含A第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡。
17、核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,所述金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增,和任选地C第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中如果所述样品包含所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的所述区域,则检测。
18、到所述第三寡核苷酸的杂交。18根据权利要求10至17的任一项所述的方法,其中所述金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA选自由SPA、ORFX和NUC组成的组。19根据权利要求1至18的任一项所述的方法,所述方法还包括将所扩增的样品与嵌入染料接触,其中如果所述样品包含所述MRSA,则检测到所述染料向扩增产物的嵌入。20一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中所述SCCMEC盒包含MECA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含A第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡。
19、萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和B第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与MECA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,和任选地权利要求书CN104169437A5/6页6C第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交。21根据权利要求20所述的试剂盒,其中所述第一寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO9和10;和/或所述第二寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO6、7、14、15、16、17、20和21,和/或如果存在所述第三寡核苷酸,所述第三寡核苷酸。
20、包含如SEQIDNO8、18和19所列的核酸序列。22根据权利要求20或权利要求21所述的试剂盒,所述试剂盒还包含以下寡核苷酸组的一种或更多种第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含A第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二接合寡核苷酸,所述第二接合寡核苷酸具有能够在所述SCCMEC盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组用于扩增MECA元件,所述第三寡核苷酸组包含A第一MECA寡核苷酸,所述第一MECA寡核苷酸具有能够在MECADNA的区域中特异性地杂交的核。
21、酸序列;和B第二MECA寡核苷酸,所述第二MECA寡核苷酸具有能够在MECADNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组用于扩增金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA,所述第四寡核苷酸组包含A第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列。23一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色。
22、葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中所述SCCMEC盒包含MECA或MECA变体元件,所述试剂盒包含A第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含1第一MECA变体寡核苷酸,所述第一MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和2第二MECA变体寡核苷酸,所述第二MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地,3第三MECA变体寡核苷酸,所述第三MECA变体寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交;和B第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含。
23、1第一MECA寡核苷酸,所述第一MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第一区域特异性地权利要求书CN104169437A6/6页7杂交的核酸序列,和2第二MECA寡核苷酸,所述第二MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和任选地,3第三MECA寡核苷酸,所述第三MECA寡核苷酸能够在所述MRSA的在所述第一寡核苷酸的杂交区域和所述第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交,每个组被定向使得,当样品与所述寡核苷酸组被置于扩增条件下时,如果所述样品包含所述MRSA,则可发生扩增。24根据权利要求23所述的试剂盒,其中所述第一MECA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核。
24、酸序列SEQIDNO9和10,和/或所述第二MECA变体寡核苷酸包含选自以下组成的组的核酸序列SEQIDNO6、7、14、15、16、17、20和21,和/或所述第三MECA变体寡核苷酸包含如SEQIDNO8、18和19所列的核酸序列。25根据权利要求20至24的任一项所述的试剂盒,其中所述MECA变体是MECALGA251。26根据权利要求23所述的试剂盒,所述试剂盒还包含以下寡核苷酸组的一种或更多种第三寡核苷酸组,所述第三寡核苷酸组包含A第一接合寡核苷酸,所述第一接合寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌染色体DNA在右末端接合区中的区域中特异性地杂交的核酸序列;和B第二接合寡核苷酸,所述第二接。
25、合寡核苷酸具有能够在所述包含MECA的SCCMEC盒的右末端接合区的区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一接合寡核苷酸和所述第二接合寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在所述MRSA的存在下,其中所述SCCMEC盒包含MECA,SCCMEC盒右插入接合点被扩增;和任选地,C第三接合寡核苷酸,所述第三接合寡核苷酸具有能够在所述MRSA的在所述第一接合寡核苷酸的杂交区域与所述第二接合寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列;和/或第四寡核苷酸组,所述第四寡核苷酸组包含A第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的区域中特异。
26、性地杂交的核酸序列;和B第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在金黄色葡萄球菌特异性染色体DNA的第二区域中特异性地杂交的核酸序列,其中所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸和所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,在MRSA的存在下,金黄色葡萄球菌特异性DNA的部分被扩增,和任选地,C第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸,所述第三金黄色葡萄球菌寡核苷酸具有能够在所述金黄色葡萄球菌DNA的在所述第一金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域与所述第二金黄色葡萄球菌寡核苷酸的杂交区域之间的区域中特异性地杂交的核酸序列。权利要求书CN104169437A1/39页8甲氧西林抗性。
27、金黄色葡萄球菌的MECA变体菌株的检测发明领域0001本发明涉及甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌METHICILLINRESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUS,MRSA的分子检测。更具体地,本发明涉及包括带有MECA基因变体的另外菌株的MRSA的改进的检测。0002发明背景0003在1961年,金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS的一个菌株首次显示对甲氧西林的抗性。现在,甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA是导致医院感染和社区感染的最流行的抗生素抗性病原体之一。MRSA菌株的出现是由于移动的遗传元件葡萄球菌盒染色体MECSTAPHYLOCOCCALCASSETTEC。
28、HROMOSOMEMEC,SCCMEC被获取并插入到易感金黄色葡萄球菌菌株的染色体中。事实上,这一SCCMEC元件携带MECA基因,该基因造成甲氧西林抗性STAPHYLOCOCCALCASSETTECHROMOSOMEMEC;ITO等人,2001,ANTIMICROBAGENTSCHEMOTHER45513231336;HIRAMATSU,等人,2001,TRENDSMICROBIOLOCT;91048693。MECA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PENICILLINBINDINGPROTEIN,称为PBP2A或PBP2。不同于天然PBP,这一PBP2A具有对内酰胺抗生素的低亲和性,这允许甚至在。
29、内酰胺抗生素的存在下继续合成细胞壁。0004SCCMEC元件可被掺入到金黄色葡萄球菌和其他凝固酶阴性的葡萄球菌,主要是表皮葡萄球菌SEPIDERMIDIS和溶血性葡萄球菌SHAEMOLYTICUS的染色体中。SCCMEC的特征是存在末端反向和同向重复TERMINALINVERTEDANDDIRECTREPEAT、一组位点特异性重组酶基因CCRA和CCRB、和MECA基因复合体ITO等人,1999,ANTIMICROBAGENTSCHEMOTHER4314491458;KATAYAMA等人,2000,ANTIMICROBAGENTSCHEMOTHER4415491555。这一MECA基因盒SCC。
30、MEC插入金黄色葡萄球菌基因组的位点是已知的且序列是保守的ITO等人,2001,ANTIMICROBAGENTSCHEMOTHER4513231336。在插入金黄色葡萄球菌染色体中之后,SCCMEC具有左末端接合点LEFTEXTREMITYJUNCTION和右末端接合点RIGHTEXTREMITYJUNCTION参见图1,以及分别包括SCCMEC盒和染色体DNA的周围的左末端接合区和右末端接合区,在接合点处SCCMEC序列与金黄色葡萄球菌染色体序列是连续的。此前已经分析了围绕SCCMECDNA的左边界和右边界即,分别为ATTL和ATTR的区域的核苷酸序列、以及围绕SCCMECDNA整合位点即,。
31、ATTBSCC,SCCMECDNA的细菌染色体附着位点的区域的核苷酸序列。对整合位点的序列分析揭示,ATTBSCC位于新的开放阅读框ORFORFX的3端。ORFX编码159个氨基酸的多肽,最近被注释为23SRRNA甲基转移酶HTTP/WWWUNIPROTORG/UNIPROT/Q6I7F2。已经另外研究了SCCMEC的MECA区域的结构OLIVEIRA,DC,等人,2000,ANTIMICROBAGENTSCHEMOTHER44719061910。0005通常,在患者的MRSA检验中,重复地从患者获取鼻拭样并培养,以确定是否存在MRSA菌株。正在开发更新的方法,其允许直接从鼻拭样和以短得多的时。
32、间量鉴定MRSA。样品也在演变,许多文章显示对在同一患者取样多个解剖部位以增加检测MRSA携带者的可能性的兴趣。部位可以是鼻加咽喉、腋窝、腹股沟和或会阴。METHICILLIN说明书CN104169437A2/39页9RESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUSCOLONISATIONATDIFFERENTBODYSITESAPROSPECTIVE,QUANTITATIVEANALYSIS,MERMEL等人2011,JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY。0006扩增是公知的技术,且已经开发了多种方法,包括基于转录的扩增诸如转录介导的扩增TRANSCRIPTI。
33、ONMEDIATEDAMPLICATION,TMA;美国专利号5,766,849;5,399,491;5,480,784;5,766,849;和5,654,142和基于核酸序列的扩增NUCLEICACIDSEQUENCEBASEDAMPLIFICATION,NASBA;5,130,238;5,409,818;5,654,142;和6,312,928、和循环核酸扩增技术热循环诸如聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR;美国专利号4,683,195;4,965,188;4,683,202和连接酶链式反应LIGASECHAINREACTION,LCR;美国专利号5,79。
34、2,607。已知的扩增方法还包括链置换扩增STRANDDISPLACEMENTAMPLICATION,SDA、自主序列复制SELFSUSTAINEDSEQUENCEREPLICATION,3SR、Q复制酶、和级联滚环扩增CASCADEROLLINGCIRCLEAMPLICATION,CRCA。0007利用核酸的检测方法也是本领域中公知的。通常为了多种检测目的标记核酸。例如,美国专利号4,486,539KOURLISKY;4,411,955WARD;4,882,269SCHNEIDER和4,213,893CARRICO中描述的方法,阐述了用于检测特异性核酸序列的标记的检测探针的制备。还描述了用于。
35、不同检测方法,诸如靶捕获、HPA、TAQMAN、分子信标和夹心杂交的探针设计例如,美国专利号4,486,539、和美国专利号4,751,177;5,210,015;5,487,972;5,804,375;5,994,076。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的,并已在除了许多其他出版物之外例如,SAMBROOK等人MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,第2版COLDSPRINGLABPRESS,DEC1989;美国专利号4,563,419RANKI和4,851,330KOHNE以及在DUNN,等人,CELL12,第2326页1978中描述。0008开发的以基于。
36、MECA基因和金黄色葡萄球菌特异性染色体序列的检测来检测并鉴定MRSA的早期分子方法已经被描述。SAITO等人,1995,JCLINMICROBIOL3324982500;UBUKATA等人,1992,JCLINMICROBIOL3017281733;MURAKAMI等人,1991,JCLINMICROBIOL2922402244;HIRAMATSU等人,1992,MICROBIOLIMMUNOL36445453。然而,在仅基于盒接合点的检测的试验中,对包含SCCMEC的右末端的小片段的甲氧西林易感金黄色葡萄球菌分离株已经观察到假阳性参见RUPP,J等人,JCLINMICROBIOL44623。
37、172006。另外,RAMAKRISHNAN和RICCELLI描述了利用具有与SCCMEC盒插入位点的左接合点附近的区域,包括部分SCCMEC盒序列和插入区域中的部分金黄色葡萄球菌序列左末端接合区互补的序列的寡核苷酸探针检测MRSA的方法美国专利公布号US20060057613。0009用于确定对特别是由金黄色葡萄球菌携带的甲氧西林抗性的概念已被公布0010SCCMEC右末端接合点扩增概念HIRAMATSU等人WO97/31125;EP0887424;美国专利号6,156,507;以及另外的,HULETSKY和ROSSBACHWO02/0990342002;HULETSKY等人JCLINMIC。
38、ROBIOL4251875188420040011由和合作者描述的免疫富集IMMUNOENRICHMENT概念FRANCOIS,P等人JCLINMICROBIOL4112542602003;WO02082086,其中免疫富集随后是扩增三种标志物MECA基因、金黄色葡萄球菌特异性标志物、和表皮葡萄球菌特说明书CN104169437A3/39页10异性标志物0012SCCMEC右末端接合点扩增和MECA扩增的组合JAY,等人US20090203013;WO2009085221,其通过引用全文并入。0013SCCMEC右末端接合点概念基于覆盖SCCMEC整合位点的右末端接合区的区域的扩增。原理如下S。
39、CCMEC盒通常在称为ORFX的金黄色葡萄球菌特异性开放阅读框上游整合金黄色葡萄球菌染色体;扩增例如,PCR检验组合了位于盒的右部SCCMEC盒的“右末端接合区”的多个正向引物、一个反向引物和探针,后二者位于金黄色葡萄球菌染色体ORFX中,即,SCCMEC与ORFX的右末端接合点下游ORFX的“右末端接合区”。HIRAMATSU等人描述了具有在盒的右末端接合区中的两个正向引物以扩增当时描述的主要SCCMEC类型的检测一个引物用于SCCMECI和II型,且第二引物用于III型。HULETSKY等人陈述,如果仅使用HIRAMATSU描述的两个正向引物,没有检测到多种MRSA菌株,且他们确定了新类型。
40、的盒,称为MREJ型,该新类型的盒在SCCMEC盒的右部分具有序列变化。市售可得的INFECTIODIAGNOSTICSINC检测组合了位于盒的右部分的五个正向引物一个引物设计用于检测MREJI和II型,且其他四个引物用于MREJIII、IV、V和VII型、位于ORFX中的一个反向引物、和覆盖ORFX区域的相同部分和鉴定已鉴定的ORFX变体所需的三个通用探针。这一检测以实时PCR的方式进行。然而,报道的HULETSKY等人2004这一检测的特异性显示,46的MSSA检测的569中的26个被错误鉴定。用利用单基因座右末端SCCMEC盒ORFX接合点PCR检验的另一市售检测也报道了假阳性结果RUP。
41、P,J,等人,JCLINMICROBIOL44623172006。0014US20090203013提出了MRSA假阳性的主要来源并提供了检测此前未被当时可获得的检测处理的MRSA的改进的检测。这一申请假设,此前的分子方法鉴定的假阳性在一些情况下可由MSSA菌株中在缺失包含MECA的染色体区域后存在残余SCCMEC右末端片段或存在不包含MECA的SCCMEC来解释。另外,其假设,一部分假阳性可能是由于非特异性扩增;事实上,由于反向引物和探针位于MRSA和MSSA二者共同的ORFX中,正向引物非特异性退火到MSSA染色体上将导致MSSA的扩增和检测。该申请提出了假阳性的两种来源并提供了改进的检测。
42、。利用这一原理的检验已推向市场NUCLISENSMRSA,BIOMRIEUX,SA,MARCYLETOILE,FRANCE。0015此前,在用于检测金黄色葡萄球菌中甲氧西林抗性的检验中,确定MECA基因存在于SCCMEC盒中,导致菌株抗甲氧西林,或确定MECA基因不存在从盒中切除或无盒,其中总结出,菌株是对甲氧西林易感的。考虑到公共数据库中对于来自MRSA或来自其它甲氧西林抗性病原体的MECA基因可获得的许多序列,显示MECA基因是充分保守的,仅发现一些特定的突变。0016最近检测到一种甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌,通过常规PCR和微阵列测序发现其缺少MECASHORE,AC等人,ANTIMIC。
43、ROBAGENTSCHEMOTHERDOI101128/AAC00187112011年6月2日和GARCIAALVAREZ,L等人,LANCETDOI101016/S14733099117012682011年6月3日METHICILLINRESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUSWITHANOVELMECAHOMOLOGUEINHUMANANDBOVINEPOPULATIONINTHEUKANDDENMARKADESCRIPTIVESTUDY。全基因组测序揭示了具有高度趋异的BLAZMECAMECRIMECI的30KBSCCMEC元件,并指出,SCCMEC元件中存在的该MEC元。
44、件说明书CN104169437A104/39页11与金黄色葡萄球菌MECA同系物具有70序列同一性;另外,该SCCMEC元件与此前鉴定的SCCMECXI型INTERNATIONALWORKINGGROUPONTHECLASSICATIONOFSTAPHYLOCOCCALCASSETTECHROMOSOMEELEMENTS的网站上列出的序列类型425牛MRSA菌株LGA251几乎相同。SCCMEC元件被整合在ORFX中与所有其他SCCMEC元件相同的核苷酸位置。该菌株另外包括E类复合体、由CCRA1CCRB3组成的8型盒染色体重组酶CCR复合体、砷抗性操纵子和侧翼的同向重复。目前的检测方法将不会。
45、将这一菌株鉴定为MRSA。0017SHORE等人使用FR823292菌株作为参考菌株并使用MECA_M10/0061引物。GARCIAALVAREZ等人研究了LGA251基因组中趋异的MECA,这一MECA变体位于称为“TYPEXISCCMEC”的新盒中。他们使用LGA251菌株作为参考菌株并使用MECA_LGA251引物。事实上,2个出版物指代同一客体。两种MECA变体共有非常高的相似性百分比99,且同时显示与迄今已知的所有MECA序列弱的总体相似性。0018随着新的亚型和菌株被鉴定,检测此类亚型和菌株的手段变得必不可少。当目前现有的检验先前意外地没有检测到其并因而可导致假阴性结果时,这是特。
46、别重要的。本发明通过提供可检测此类菌株的检验满足了关于检测包含变体MECA的菌株的这一需求。此外,这一新发明在同一检验中证实了金黄色葡萄球菌菌株和甲氧西林抗性基因二者的存在。这一检验可单独使用,或可与用于其他SCCMEC类型的现有检验组合使用。发明内容0019本发明提供一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中SCCMEC盒包含MECA变体元件,所述方法包括0020利用包含以下的寡核苷酸组对样品进行扩增反应0021A第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合。
47、区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和0022B第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与MECA变体的区域特异性地杂交的核酸序列,0023其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。0024本发明另外提供一种扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的方法,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中SCCMEC盒包含MECA或MECA变体元件,所述方法包括0025利用以下对样品进行扩增反应0026A第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组。
48、包含00271第一MECA变体寡核苷酸,所述第一MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和00282第二MECA变体寡核苷酸,所述第二MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和0029B第二寡核苷酸组,所述第二寡核苷酸组包含说明书CN104169437A115/39页1200301第一MECA寡核苷酸,所述第一MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和00312第二MECA寡核苷酸,所述第二MECA寡核苷酸具有能够与MECA的第二区域特异性地杂交的核酸序列,0032其中第一寡核苷酸和第二。
49、寡核苷酸各自被定向使得,在扩增条件下,如果样品包含MRSA,则MRSA的在第一寡核苷酸的杂交区域和第二寡核苷酸的杂交区域之间的区域被扩增。0033本发明还提供一种用于扩增甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中SCCMEC盒包含MECA变体元件,所述试剂盒包含第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含0034A第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸具有能够与金黄色葡萄球菌染色体DNA在末端接合区中的区域特异性地杂交的核酸序列,和0035B第二寡核苷酸,所述第二寡核苷酸具有能够与MECA变体的区域特异性地杂交的核酸序列。0036另外,本发明提供一种用于扩增样品中甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA的试剂盒,所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA中包含SCCMEC盒的插入,其中SCCMEC盒包含MECA或MECA变体元件,所述试剂盒包含0037A第一寡核苷酸组,所述第一寡核苷酸组包含00381第一MECA变体寡核苷酸,所述第一MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第一区域特异性地杂交的核酸序列,和00392第二MECA变体寡核苷酸,所述第二MECA变体寡核苷酸具有能够与MECA变体元件的第二区域特异性地杂交的核酸序列;和0040B第二寡核苷酸组,所。