人PON1基因rs662位点多态性检测方法及试剂盒技术领域
本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。
背景技术
SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变
异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生
俱来的遗传特征，不随环境发生变化，也不是某种疾病特异或者非特
异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如
下：1.研究物种起源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获
得生物大分子的信息，推断生物进化历史，阐明物种进化关系。应用
于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关系。2.
研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切
相关，包括身高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可
以用于疾病预防措施。通过研究人体对毒物的耐受性，发现易于对某
种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触，保护该易
感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，
筛查出容易出现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有
机溶剂，保护此类易感人群免受毒物侵害。4.药理学中可以用于药
物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某种药物毒
副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个
体对药物效果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。
对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)基因位于染色体7q21.3，该基
因其编码的是一种广谱非专一性酯酶，其表达产物在体内广泛分布，
能水解对氮磷类有机磷化合物和高密度脂蛋白上的氧化型磷脂。PON1
基因rs662位点多态，在人群中存在两种等位基因A和G，形成三种PON1
基因的基因型：AA型(人体基因组rs662多态位点的两个等位基因碱
基均为A)，AG型(人体基因组rs662多态位点的两个等位基因碱基分
别为A和G)和GG型(人体基因组rs662多态位点的两个等位基因碱基
均为G)。
聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR—RFLP)技术是一种
快速、简便、准确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性)基因型的经典
方法。该方法通过引物来对模板进行扩增反应，形成足够数量和稳定
的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片段长度，最
终测定出SNP。PON1基因rs662多态位点采取PCR—RFLP技术进行
检测，所需内切酶为Sau3AI，BfuCI，AlwI，MboI，DpnII等，其价
格较昂贵，因此需要开发新的检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的人PON1基
因rs662位点多态性检测的可靠手段。
根据本发明的第一方面，提供了一种人PON1基因rs662位点多
态性的检测方法，包括：
提供待测人基因组DNA；
提供扩增人PON1基因rs662位点附近序列的上游引物和下游引
物，其中上游引物具有错配碱基T；
以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行
PCR扩增反应以获得含TCRA片段的扩增产物，其中R为人PON1基因
rs662位点上的待定碱基A或G；
提供限制性内切酶；
利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切(反应)以获得相应
的酶切产物；以及
根据所得酶切产物来确定人PON1基因rs662位点上的待定碱基
R是A还是G，其中，限制性内切酶为仅能够切开TCGA片段与TCAA
片段之一的限制性内切酶。
根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基
T与R之间相隔一个碱基C。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使
酶切反应进行得极其顺利，不会出现酶切不充分等现象。并且，如此
设置上游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了PCR的灵敏度和
特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。
在本发明的具体实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱
基与R相邻。例如，上游引物末端可以是……TC等结构。
在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开
TCGA片段的TaqαI或其同裂酶。这类TaqαI酶价格低廉，能大大降
低测定成本。
根据本发明的实施例，所得酶切产物包括三种片段类型：具有总
片段长度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切
断后具有较短片段的扩增产物(较短片段通常不能有效观测到)。通
过观测(判断)酶切产物所包含的片段类型来确定人PON1基因rs662
位点上的待定碱基是A还是G。例如，在采用TaqαI酶的情况下，根
据总片段和切断后较长片段这两个片段的观察结果来进行判断：如果
观察到酶切产物只有一种具有总片段长度的未切断扩增产物，则待定
碱基为A；如果观察到酶切产物只有一种具有较长片段(小于总片段
长度)的切断产物，则待定碱基为G；如果观察到上述二者，则待定
碱基既包括A又包括G。
在本发明的一个实施例中，判断(或观测)酶切产物所包含的片
段类型是通过凝胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。这
种情况下，优选参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经紫外
灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中
第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二
参照图像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本
发明采用的参照图是由合成的125bp和86bp两个碱基片段同时经
凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNAladder的复合参
照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发
明的这种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类
型，同时最大限度地避免了误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1～
2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断准确性。
在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度
而使得扩增产物的总片段长度在100bp至300bp之间，并且上游引
物的片段长度至少为35bp，优选长度40～60bp(在该优选区间扩
增反应尤其顺利充分)，使得酶切切掉部分片段长度占总片段长度的
百分比超过20％。本发明的这种设计可以使得具有总片段长度的未切
断扩增产物与切断后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位
置区别显著。但是，如果总片段过长，则电泳位移将不明显；过短则
图像会变得模糊一片，无法准确区分。上游引物的片段长度范围保证
了PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足
现象。
在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火温度的
范围在55～70℃之间，优选温度60～69℃(该温度可提高扩增反应
的特异性)，使得设计的PCR产物纯度较高。本发明的这种设计可以
使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳切开。但是，如
果温度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难以区分判断；如果
温度过高，则影响PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效
果。
在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的
范围在10～60s之间，优选时间15～30s(该时间可提高扩增反应
的效率和扩增产物的特异性)，使得设计的PCR反应时间较短，扩增
产物纯度较高。本发明的这种设计可以使PCR扩增产物条带清楚，无
杂带出现，易于电泳切开，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，
则特异条带不能完全扩增而使得扩增产物较少，电泳后难以区分判
断；如果时间过长，则增加非特异条带的出现几率，出现杂带影响观
察效果。
在本发明中，PCR反应成分可以包含DNA模板、上下游引物、Taq
DNApolymerase(DNA聚合酶或亦可称作“Taq酶”)、缓冲液、Mg2+
等。在本发明的优选实施例中，PCR扩增反应中可以使用TaqDNA
polymerase(DNA聚合酶)及其TaqAntibody。TaqAntibody是Taq
DNApolymerase的单克隆抗体，其与TaqDNApolymerase结合后抑
制DNA聚合酶活性，两者的亲和力非常高，即使在65℃下仍然可以
封闭TaqDNApolymerase的活性，因此可以非常有效地抑制引物的
非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，具有极高的扩增灵
敏度和特异性。TaqAntibody只需要在95℃加热30s即可完全失活，
释放TaqDNApolymerase活性，保证了后续PCR扩增反应能够顺利
进行。
PCR反应中可以加入pH值为8.1～8.7的Tris-HCL缓冲液，在
72℃延伸反应时调整PCR溶液pH值在6.8～7.8之间，从而使Taq酶
在偏碱性环境中更好地发挥活性。另外，PCR溶液中还可以加入明胶
(0.01％)以减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性及保护作
用，促进PCR反应。
另外，PCR溶液中Mg2+浓度在1.5～2.0mmol/L之间时，可以很好
地控制PCR反应的产率和特异性。
PCR反应引物的终浓度一般为0.1～1μM左右，浓度太高会导致
非特异性扩增，太低则扩增产物太少。
此外，PCR反应中还可以加入助溶剂二甲亚砜(DMSO)和硫酸铵以
降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。这可能与消除引
物和模板的二级结构，降低DNA解链温度使DNA变性完全有关。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于人PON1基因rs662位
点多态性检测的试剂盒，其包含：
用于PCR扩增人PON1基因rs662位点附近序列的上游引物和下
游引物，其中上游引物具有错配碱基T以获得含TCRA片段的扩增产
物，其中R为人PON1基因rs662位点上的待定碱基A或G；以及
仅能够切开TCGA片段与TCAA片段之一的限制性内切酶。
上述试剂盒中还可以包括其它成分，例如PCR反应Mix(包括4
种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、TaqAntibody、缓冲液，
DMSO和硫酸铵)和用于实施测定的说明书等。
本领域技术人员可以理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面
和第二方面的相关特征可以相互组合。
本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
附图说明
图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其
中Marker是：标准参考位置；泳道1：AA基因型；泳道2：AG基因
型；泳道3：GG基因型。
具体实施方式
下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，以下详
细描述仅用于说明而非限定本发明。
(1)待测DNA的获取
采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的PON1基因
rs662位点多态性的测定。
对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人
体的体液或者组织获得离体样本，还可以是经过预先降解处理的基因
组。为了方便实施，通常优选从血液提取离体样本。其中所述的组织
包括人体中含有全部或至少PON1基因的组织，而与是否表达该PON1
基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公
知的，并且可以参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2
版进行。
(2)引物设计与合成
查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得PON1基因全
序列和rs662多态位点信息。
rs662多态位点r前后部分碱基序列(碱基序列以5'→3'表示，大
小写意义相同)如下(SEQIDNO：1)：
![]()
根据基因序列进行上游引物和下游引物设计，其中，上游引物
引入错配碱基。在最终所得扩增产物上，上游引物的错配碱基T与R
之间相隔一个碱基C。
在本发明中，上游引物具有错配碱基T，且长度为35～60bp。
其中一个实施例中，引物如下，
上游引物:5'TATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTTC3'
(SEQIDNO:2),
下游引物:5'AATCCTTCTGCCACCACTC3'(SEQIDNO:3)，其中上
游引物下划线碱基为错配碱基。
(3)制备PCR扩增产物
根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序
和条件，制备PCR扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50～
80ng)、上下游引物(终浓度为0.1～1μM)、2×PCRMix7.5μL
(包括4种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、TaqAntibody、
缓冲液，DMSO和硫酸铵)和双蒸水共同组成15μL反应体系，调整溶
液pH为7.3左右。PCR反应条件为:95℃预变性30s，95℃变性30
s→62℃退火30s→72℃延伸20s共30个循环，72℃延伸7min。PCR
反应后获得稳定的扩增产物。
(4)酶切反应
本发明可以采用内切酶TaqαI，该内切酶价格比多态位点附近碱
基无错配情况下可采用的内切酶Sau3AI，BfuCI，AlwI，MboI，DpnII
价格低廉。如表1所示。
表1:NEB公司几种内切酶识别序列及其价格
![]()
注：N＝A或C或G或T
其中一个实施例中，取PCR产物10μL，加入5U内切酶TaqαI、
2μL10×酶切缓冲液和7.5μL双蒸水组成20μL反应体系，65℃
水浴中酶切4～12h，即得酶切产物，酶切产物经1倍浓缩后电泳观
察。
(5)电泳测试
其中一个实施例中，PCR产物经TaqαI酶切后如果不能切开则仍
为125bp，如果被切开则出现86bp和39bp(由于TaqαI酶切产生
粘性末端使其互补链碱基数目不同，因此切开后片段长度以基因序列
上单链碱基数目为准来计算)，其中39bp片段电泳图中难以分辨。
将酶切产物在2～4％琼脂糖凝胶中3～8V/cm条件下，电泳40～
80min，于紫外灯下拍照测定。酶切电泳图见图1，依据125bp和
86bp片段的有无判断来判断基因型：AA型为125bp一个片段，AG
型有125bp、86bp片段，GG型为86bp一个片段。
下面是实施本发明的若干实施例。
实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rs662多态性
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器
试剂：2×PCRMix(包括4种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNA
polymerase、TaqAntibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵)，限制性内切
酶TaqαI(NEB公司)，琼脂糖(Biowest公司)，引物由上海Sangon
公司合成。
仪器：9600型PCR仪(PE公司)，微型电泳槽(PHarmaciaBiotech,
EPS1000),GelDoc2000凝胶成像仪(Bio-RAD公司)。
1.2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
EDTA-K2抗凝管采集人外周血1mL，参考《实用流式细胞术彩色
图谱》中白细胞的分离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯
化钠盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待测人基因组DNA模板。
1.3序列查找及引物设计
在NCBI网站查找PON1基因序列和rs662多态位点信息来设计
引物。具体如下：
上游引物:5'TATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTTC3'
(SEQIDNO:2)；
下游引物:5'AATCCTTCTGCCACCACTC3'(SEQIDNO:3)
1.4PCR扩增
取基因组DNA(50～80ng)、上下游引物(终浓度为0.1～1μM)、
2×PCRMix7.5μL(包括4种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、
TaqAntibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵)，灭菌双蒸水补足15μL
反应体系，调整溶液pH为7.3左右。
PCR反应条件为:95℃预变性30s，95℃变性30s→62℃退火30
s→72℃延伸20s共30个循环，72℃延伸7min。PCR反应后获得稳定
的扩增产物。
1.5酶切鉴定
取PCR产物10μL，加入5U内切酶TaqαI、2μL10×酶切缓
冲液和灭菌双蒸水组成20μL反应体系，65℃水浴中酶切4h后，即
得酶切产物。
上述酶切产物经1倍浓缩后在3％琼脂糖凝胶5V/cm条件下，
电泳45min，于紫外灯下拍照鉴定多态类型。
2结果
2.1PCR扩增结果
扩增后序列(位于SEQIDNO：1碱基序列的461-585处，共125
bp)，所获得的扩增产物序列如下(SEQIDNO：4)：
![]()
扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序
列，r代表A/G多态即SNP位点rs662。
2.2酶切结果
经内切酶TaqαI酶切后的产物序列分别如下：
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
86bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个
碱基)序列(SEQIDNO：5)：
![]()
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
39bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个
碱基)序列(SEQIDNO：6)：
tatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt39
酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，结果示于图1中。rs662
位点扩增后出现125bp片断。经TaqαI酶切后电泳会出现125bp、
86bp和39bp三种片断(其中39bp在电泳图中不易分辨)。
酶切后电泳进行基因型判断：如图1所示，AA型为125bp一个
片段，AG型有125bp和86bp两种片段，GG型为86bp一个片段。
2.3PON1基因rs662位点多态结果
共检测54例人员，检测结果发现rs662位点出现AA型10例、
AG型28例和GG型16例。
实施例2人外周血全血标本测定PON1基因rs662多态性
主要试剂及仪器同实施例1。参考《分子克隆技术》中酚-氯仿
抽提法提取外周血基因组DNA，并作为待测人基因组DNA模板。
序列查找同实施例1，设计引物序列如下：
上游引物:5'TTTTATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTTC3'
(SEQIDNO:7)；
下游引物:5'TTCAGAGAGTTCACATACTTGCCAT3'(SEQIDNO:8)
取基因组DNA(50～80ng)、上下游引物(终浓度为0.1～1μM)、
2×PCRMix10μL(包括4种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、
TaqAntibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵)，灭菌双蒸水补足20μL
反应体系，调整溶液pH为7.3左右。
PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s→58℃退
火30s→72℃延伸20s共30个循环，72℃延伸10min。
酶切鉴定同实施例1。
结果：
扩增后序列(位于SEQIDNO：1碱基序列的458-642处，185bp)，
所获得的扩增产物序列如下(SEQIDNO：9)：
![]()
扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，
r代表A/G多态即SNP位点rs662。
经内切酶TaqαI酶切后的产物序列分别如下：
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
143bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个
碱基)序列(SEQIDNO：10)：
![]()
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
42bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个
碱基)序列(SEQIDNO：11)：
ttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt42
酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs662位点扩增后出现
185bp片断。经TaqαI酶切后电泳会出现185bp、143bp、42bp
三种片段(其中42bp在电泳图中不易分辨)。
酶切后电泳进行基因型判断：AA型为185bp一个片段，AG型有
185bp和143bp两种片段，GG型为143bp一个片段。
共检测96例人员，检测结果发现rs662位点出现AA型16例、
AG型50例和GG型30例。
实施例3人外周血血凝块标本测定PON1基因rs662多态性
主要试剂及仪器同实施例1。参考《分子克隆技术》中酚-氯仿
抽提法提取血凝块基因组DNA。
PCR反应所采用的上游引物是SEQNO：12，下游引物是SEQNO：
13。
上游引物:5'ACTTTTATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTTC
3'(SEQIDNO:12)；
下游引物:5'TCCTTCTGCCACCACTC3'(SEQIDNO:13)
PCR扩增除退火温度是57℃外，其余反应条件同实施例1；酶切
反应条件同实施例1。酶切产物经1倍浓缩后在2.5％琼脂糖凝胶5
V/cm条件下，电泳35min，于紫外灯下拍照鉴定。
结果：
扩增后序列(位于SEQIDNO：1碱基序列的456-583处，共128
bp)，所获得的扩增产物序列如下(SEQIDNO：14)：
![]()
扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，
r代表A/G多态即SNP位点rs662。
酶切后的产物序列分别如下：
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
84bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个
碱基)序列(SEQIDNO：15)：
![]()
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
44bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个
碱基)序列(SEQIDNO：16)：
acttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt44
酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs662位点扩增后出现
128bp片断。经TaqαI酶切后电泳会出现128bp、84bp、44bp三
种片段(其中44bp在电泳图中不易分辨)。
酶切后电泳进行基因型判断：AA型为128bp一个片段，AG型有
128bp和84bp两种片段，GG型为84bp一个片段。
多态结果：共检测80例人员，检测结果发现rs662位点出现AA
型15例、AG型41例和GG型24例。
实施例4人口腔黏膜细胞测定PON1基因rs662多态
主要试剂及仪器同实施例1。参考《分子克隆技术》中酚-氯仿
抽提法提取口腔黏膜细胞基因组DNA。
PCR反应所采用的上游引物是SEQNO：17，下游引物是SEQNO：
18。
上游引物:5'AGCACTTTTATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCC
CTACTTTC3'(SEQIDNO:17)；
下游引物:5'TCCATTAGCAAAATCAAATCCTTCT3'(SEQIDNO:18)
PCR扩增除退火温度是60℃外，其余反应条件同实施例1；酶切
反应条件同实施例1。上述酶切产物经1倍浓缩后在3.5％琼脂糖凝
胶5V/cm条件下，电泳50min，于紫外灯下拍照鉴定。
结果：
扩增后序列(位于SEQIDNO：1碱基序列的453-601处，共149
bp)，所获得的扩增产物序列如下(SEQIDNO：19)：
![]()
扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，
r代表A/G多态即SNP位点rs662。
酶切后的产物序列分别如下：
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
102bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个
碱基)序列(SEQIDNO：20)：
![]()
该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段
47bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个
碱基)序列(SEQIDNO：21)：
agcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt47
酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs662位点扩增后出现
149bp片断。经TaqαI酶切后电泳会出现149bp、102bp和47bp
三种片段(其中47bp在电泳图中不易分辨)。
酶切后基因型判断：AA型为149bp一个片段，AG型有149bp
和102bp两种片段，GG型为102bp一个片段。
多态结果：共检测78例人员，检测结果发现rs662位点出现AA
型12例、AG型40例和GG型26例。