聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料， 其合成方法及应用 【技术领域】
本发明属于材料学领域，涉及一种纳米材料及其制备和应用，进一步的，本发明涉及一种聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料，其合成方法以及应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)的兴起及其发展为人类的多种疾病带来了更为有效的治疗手段，尤其是对于各种恶性肿瘤、单基因遗传性疾病、以及多种难治性、致死性疾病。然而，基因治疗的临床应用仍有许多障碍还有待克服。其中，载体问题，以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性等问题是基因治疗研究领域亟待解决的最关键的问题之一。介导基因转移的载体一般分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体由于存在诱发人体肿瘤和免疫排斥等缺陷，而传统的非病毒载体，虽然安全，但转导效率极低，难以获得有意义的基因表达。
与病毒载体以及传统的非病毒载体相比，聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料在介导基因转移方面有以下方面的明显优势：(1)由于纳米材料是小分子非生物材料，没有免疫原性，不会引起机体的免疫反应；(2)与病毒载体不同，纳米材料无遗传毒性与细胞毒性，不会导致细胞的转化与细胞死亡；(3)由于其特殊的表面星状，或树枝状结构及表面电荷，具有很高的基因转移效率；(4)纳米材料可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中地整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；(5)纳米材料可保护转导基因不受机体血浆，或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，从而有利于目的基因在转导进入靶细胞后，能更好、更稳定地发挥其作用。造血干细胞被公认为是基因治疗最理想的靶细胞之一，有资料显示，基因治疗临床方案近三分之一涉及到造血干细胞，充分显示了造血干细胞作为基因治疗靶细胞的魅力。因此，本发明所合成的纳米材料可有效的将目的基因转入造血干细胞，这将极大地推动基因治疗的发展。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是，由于现有技术中，介导基因转移的载体一般分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体由于存在诱发人体肿瘤和免疫排斥等缺陷，而传统的非病毒载体，虽然安全，但转导效率极低，难以获得有意义的基因表达，本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料，它是一类高度枝化的球型结构的单分散纳米颗粒，分子大小为50-90纳米。进一步的，本发明所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料的分子大小为70-80纳米。
本发明所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料的分子表面有极高的阳性官能团密度，内部有空腔。
本发明所要解决的技术问题还在于提供一种聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料的合成方法，包括：以丙烯酸甲酯和乙二胺为起始单体，通过合成5代(G5)的聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM dendrimer)，然后采用透析方法对所得的5代的聚酰胺-胺型树枝状高分子进行纯化，获得高度枝化的球型结构的单分散纳米颗粒，即为所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料。
本发明所要解决的技术问题还在于提供上述聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料在造血干细胞基因转染上的应用。可将本发明的纳米颗粒以一定浓度与一定比例的质粒DNA混合，将该目的基因转染到经CD34免疫磁珠纯化后的造血干细胞内，目的基因所合成的蛋白在造血干细胞内长期表达。
进一步的，本发明所述的纳米颗粒的浓度为5mg/ml。
本发明所述的纳米颗粒与质粒DNA混合的比例可以为10∶1-2∶1；更佳的，所述的纳米颗粒与质粒DNA混合的比例为5∶1。
本发明以丙烯酸甲酯和乙二胺为起始单体，合成5代的PAMAMdendrimer。本发明所述的PAMAM dendrimer的合成由两步反应组成：(A)麦克尔加成；(B)亲核取代，反应式见下。重复进行这两步反应，可以合成不同代数的聚合物。
首先进行0.5代(G0.5)的合成，然后进行1代(G1)的合成，重复以上两步反应。经过5代反应后，得到G5。
接着进行纯化步骤，将所得的混合物用蒸馏水溶解，微孔滤膜过滤，然后装入透析袋中透析，在磁力搅拌下，不断更换新鲜蒸馏水，直到透析袋外的溶液pH值为中性。接着进行旋转蒸发至干，真空干燥，即得到纯化的G5。此纯化方法的原理是基于各代dendrimer的分子量(见表1)大小不同，代数越高直径越大G＜5的分子可以从透析袋中扩散出来，G5则留在透析袋内，因此得到分离。
表1各代树枝状高分子的分子量的比较(计算值)：
G3 G4 G5
3252 6900 14196
本发明的聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料可应用于造血干细胞基因转染。在本发明的一个实施方式中，所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物纳米材料分子可有效地将目的基因转染到经CD34免疫磁珠纯化后的造血干细胞内，使目的基因所合成的蛋白在造血干细胞内长期表达。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，以下的例子只是作为对本发明的说明，不用于限制本发明的范围。
实施例1
G5聚酰胺-胺型树枝状高分子的合成
1.原料的预处理
甲醇加入镁粉，回流4h后蒸馏纯化。乙二胺加入氢氧化钠，放置24h，蒸馏纯化。丙烯酸甲酯加入无水氯化钙，回流4h后蒸馏纯化。
2.G5 PAMAM dendrimer的合成
0.5代(G0.5)的合成：取乙二胺0.7ml(10mmol)于圆底烧瓶中，加入20ml甲醇，缓慢滴加丙烯酸甲酯9.0ml(100mmol)，室温电磁搅拌3d。反应完毕后，旋转蒸发除去甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得淡黄色粘稠液体3.8g。产率94.1％。
1代(G1)的合成：取上步反应得到的G0.5 3.8g，加入甲醇40ml，缓慢滴加乙二胺20ml，室温电磁搅拌3d。反应完毕后，旋转蒸发除去甲醇和过量的乙二胺，得淡黄色粘稠液体4.5g。产率92.7％。
重复以上两步反应。经过5代反应后，得到G5。将所得的混合物用蒸馏水溶解，微孔滤膜(0.8μm)过滤。然后把滤液装入透过分子量为8000-12000的透析袋中透析，在磁力搅拌下，不断更换新鲜蒸馏水，直到透析袋外的溶液pH值为中性为止。收集透析袋里的溶液，旋转蒸发至干，真空干燥，即得到G5。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)：1.2(m，6H，CH2)，2.2(s，5H，CH2)，3.21-3.25(m，2H，CH2)，3.7(m，4H，NH)。FTIR(KBr)υ(cm-1)：3286(υN-H)，2942(υCH2)，2838(υCH2)，1652(υC＝O)，1556(βN-H)，1356(υC-N)，700(γC-N)。
实施例2造血干细胞基因转染
1.造血干细胞的纯化
采集时间不超过4小时的脐带血用Ficoll分离出单个核细胞，用CD34免疫磁珠分离出CD34阳性造血干细胞，采用流式细胞仪检测纯度达到95％。在含有造血干细胞生长因子的无血清培养液中培养一天。
2.造血干细胞的基因转染
含有目的基因的质粒DNA用无内毒素质粒抽提试剂盒纯化后，用TE缓冲液稀释到1ug/ul，将制备的纳米颗粒配成5mg/ml的水溶液，将纳米颗粒与质粒DNA按5∶1的比例混匀，滴加到造血干细胞培养体系中，在37℃二氧化碳培养箱中培养2小时后，离心洗涤一次，重新加入含造血干细胞生长因子的培养液培养，检测目的基因表达蛋白以确定转染效率。