由外消旋N－酰基化Β－氨基羧酸制备旋光性Β－氨基羧酸的方法.pdf

本发明描述了通过在水解酶存在下经由生物催化剂对N－酰基化β－氨基羧酸进行对映体选择性水解而由外消旋N－酰基化β－氨基羧酸制备旋光性β－氨基羧酸的方法，其中N－酰基化β－氨基羧酸的N－酰基取代基具有：(I)结构I其中R1、R2分别独立地选自于H、卤素、烷基、OH、烷氧基和芳氧基，R3选自于卤素、烷氧基和芳氧基，(II)结构IIA或IIB或者相应盐的结构，或(III)结构III或者相应盐的结构。

1、  通过在水解酶存在下经由生物催化剂对N-酰基化β-氨基羧酸进行对映体选择性水解而由外消旋N-酰基化β-氨基羧酸制备旋光性β-氨基羧酸的方法，其中N-酰基化β-氨基羧酸的N-酰基取代基具有：
(I)结构I

其中
R¹、R²分别独立地选自于H、卤素、烷基、OH、烷氧基和芳氧基，
R³选自于卤素、烷氧基和芳氧基，
(II)结构IIA或IIB

或者相应盐的结构，或
(III)结构III

或者相应盐的结构。

2、  如权利要求1所述的方法，其特征在于N-酰基化β-氨基羧酸的N-酰基取代基具有结构I，其中R¹、R²分别独立地选自H、氯、溴、氟、甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、叔丁基、甲氧基和乙氧基，而R³选自于氯和甲氧基。

3、  如权利要求2所述的方法，其特征在于R¹和R²分别是H，而R³是氯。

4、  如权利要求2所述的方法，其特征在于R¹为H，而R²和R³分别是氯。

5、  如权利要求2所述的方法，其特征在于R¹和R²分别是H，而R³是甲氧基。

6、  如权利要求1所述的方法，其特征在于R¹、R²和R³分别是氟。

7、  如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于N-酰基化β-氨基羧酸是具有以下结构IV的芳香N-酰基化β-氨基羧酸：

其中N-酰基取代基如权利要求1中所定义，R⁴选自于H、烷基、OH、烷氧基和卤素。

8、  如权利要求7所述的方法，其特征在于N-酰基取代基具有如权利要求1所述的结构I，其中R¹和R²分别是H，R³是氯，而R⁴为H。

9、  如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于N-酰基化β-氨基羧酸是以下结构V的N-酰基化β-氨基羧酸，

其中R⁵代表烷基。

10、  如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于所述水解酶是酰基转移酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。

11、  如权利要求9所述的方法，其特征在于酰基转移酶是I型猪肾酰基转移酶。

12、  如权利要求9所述的方法，其特征在于水解酶是得自于Aspergillus的蛋白酶。

13、  如权利要求11所述的方法，其特征在于蛋白酶得自于Aspergillus oryzae。

由外消旋N-酰基化β-氨基羧酸制备旋光性β-氨基羧酸的方法
技术领域
本发明涉及制备旋光性β-氨基羧酸的方法。
背景技术
旋光性β-氨基羧酸存在于天然物质中，如生物碱和抗生素，它们的分离正逐渐变得更加具有吸引力，特别是由于它们作为制备药物的必须中间产物的重要性(参见inter alia：E.Juaristi，H.Lopez-Ruiz，Curr.Med.Chem.1999，6，983-1004)。游离形式的旋光性β-氨基羧酸以及它们的衍生物都显示出令人感兴趣的药理作用，而且也可用于合成改性肽。
到目前为止，经典的通过非对映异构体盐拆分外消旋体(推荐的路线参见：H.Boesch等人，Org.Proc.Res.Developm.2001，5，23-27)以及特别是非对映异构体选择性加成苯乙基酰胺锂(A.F.Abdel-Magid，J.H.Cohen，C.A.Maryanoff，Curr.Med.Chem.1999，6，955-970)都已作为制备β-氨基羧酸的方法。后一种方法被认为已得到广泛的研究且被优选采用，尽管在该方法中仍存在许多缺陷。另一方面，需要化学计量量的手性试剂，这与催化不对称法相比是一个大的缺陷。另外，为通过脱质子来活化化学计量量的试剂，需要昂贵而且危险的辅助物质，如n-丁基锂。并且，为产生足够的立体选择性，在约-70℃的低温下进行反应是重要的，这表示对反应器材料要求高、额外的花费以及高的能量消耗。
虽然通过生物催化手段来制备旋光性β-氨基羧酸在目前扮演着次要角色，但由于生物催化反应的经济以及生态学优势，其又是特别需要的。省略了使用化学计量量的手性试剂，而代之使用少量、催化量的酶，这些酶包括天然且对环境无害的催化剂。另外，除它们的催化性能和它们的高效率外，与众多合成的含金属的催化剂不同，这些在含水介质中有效使用的生物催化剂具有以下优点：可以省略含金属地进料、特别是那些包含重金属并因而具有毒性的含金属的进料。
在现有技术中，已有许多对β-氨基羧酸进行对映体选择性N-酰基化的描述。
例如，L.T.Kanerva等人在Tetrahedron：Asymmetry，Vol.7，No.6，pp.1707-1716，1996中描述了通过生物催化剂，用在有机溶剂中的2，2，2-三氟乙基酯和得自于Candida antarctica的脂酶SP 526或者得自于Pseudomonas cepacia的脂酶PS中，对各种脂环族β-氨基羧酸的乙基酯进行对映体选择性N-酰基化。
V.M.Sánchez等人研究了通过制备N-乙酰基化β-氨基羧酸酯用得自于Candida antarctica的脂酶对(±)-乙基-3-氨基丁酸酯的外消旋体进行生物催化拆分(Tetrahedron：Asymmetry，Vol.8，No.1，pp.37-40，1997)。
在EP-A-0 890 649中公开了一种制备旋光性氨基酯的方法，其是由外消旋氨基酯起始，在选自于酰胺酶、蛋白酶、酯酶和脂酶中的水解酶存在下，用羧酸酯进行对映体选择性酰化，随后分离氨基酯的未转化对映体。
WO-A-98/50575涉及一种制备手性β-氨基羧酸或其相应酯的方法，该方法使外消旋β-氨基羧酸、酰基供体和青霉素G酰基转移酶在立体选择性地酰化外消旋β-氨基羧酸的对映体的条件下接触，其他对映体基本上未被转化，由此得到手性β-氨基羧酸。
特别希望将已工业应用于α-氨基羧酸的生物催化技术应用于β-氨基羧酸。首先令人感兴趣的是，通过使用水解酶、特别是酰基转移酶的酶促脱乙酰基作用，拆分外消旋N-乙酰基-β-氨基羧酸或在N-乙酰基上被取代的相应衍生物的外消旋体。外消旋起始化合物可容易地借助于乙酸衍生物来制备，而且它们的合成可原位进行，所以N-乙酰基化产物可直接使用在生物催化反应中，无需额外的分离步骤。乙酰基化反应的产率是在定量范围内，而且起始化合物例如氯乙酸、甲氧基乙酸或乙酸酐都是廉价的化学品，都可大量地获得。与其他的酰基衍生物相比，此等乙酰基衍生物的其他优点是在反应后N-乙酰基氨基羧酸可容易地从乙酸(或者其取代的衍生物)中分离。
但是，到目前为止，在β-氨基羧酸上应用该概念未获成功。令人遗憾的是，结果表明水解酶、特别是酰基转移酶似乎不适合于该类型的反应。H.K.Chenault，J.Dahmer，G.M.Whitesides，J. Am.Chem.Soc.1989，111，6354-6364证实，非环状或者环状N-酰基-β-氨基羧酸都不适合作为底物。对于非环状化合物，研究了N-乙酰基化合物。该结果已被发明人自己的用其他水解酶、特别是用酰基转移酶的实验证实。
到目前为止，仅存在用青霉素酰基转移酶对外消旋N-苯乙酰基-β-氨基羧酸进行对映体选择性水解的描述(V.A.Soloshonok，V.K.Svedas，V.P.Kukhar，A.G.Kirilenko，A.V.Rybakova，V.A.Solodenko，N.A.Fokina，O.V.Kogut，I.Y.Galaev，E.V.Kozlova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，Synlett 1993，339-341；V.Soloshonok，A.G.Kirilenko，N.A.Fokina，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，V.P.Kukhar，V.K.Svedas，E.V.Kozlova，Tetrahedron：Asymmetry 1994，5，1119-1126；V.Soloshonok，N.A.Fokina，A.V.Rybakova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，A.E.Sochorinsky，V.P.Kukhar，M.V.Savchenko，V.K.Svedas，Tetrahedron：Asymmetry1995，6，1601-1610；G.Cardillo，A.Tolomelli，C.Tomasini，Eur.J.Org.Chem.1999，155-161)。该方法的缺陷是在进行对映体选择性水解后难以重新处理产物混合物。在分离游离的β-氨基羧酸后，得到难以拆分的由苯乙酸和N-苯乙酰基-β-氨基羧酸组成的混合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备旋光性β-氨基羧酸的新的、简单而且经济的可行的方法。
该目的令人惊奇地通过在水解酶存在下经由生物催化剂对N-酰基化β-氨基羧酸进行对映体选择性水解而由外消旋N-酰基化β-氨基羧酸制备旋光性β-氨基羧酸的方法得以实现，其中N-酰基化β-氨基羧酸的N-酰基取代基具有以下结构：
(I)结构I

其中
R¹、R²分别相互独立地选自于H；卤素，优选氯、溴和氟；优选具有1-10个碳原子的烷基，特别是甲基，乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基和叔丁基；OH；优选具有1-10个碳原子的烷氧基，特别是甲氧基和乙氧基，以及具有6-14个碳原子的芳氧基，特别是苯氧基；以及R³选自于卤素，优选氯，优选具有1-10个碳原子的烷氧基，特别是甲氧基，以及优选具有6-14个碳原子的芳氧基，特别是苯氧基；
(II)结构IIA或IIB

或者相应的盐的结构，或
(III)结构III

或者相应的盐的结构。
与先前文献中的发现以及发明人自己的研究结果相反，非常出人意料地发生特殊的N-酰基化β-氨基羧酸与水解酶之间的反应。
对于具有结构I的酰基取代基，如果R³是氯，其中R¹或R²合适地也是氯，或者如果R³是甲氧基或者如果R¹、R²和R³分别是氟，则对映体选择性的水解可以特别有效地进行。示例性的N-酰基取代基是N-氯乙酰基、N-二氯乙酰基、N-甲氧基乙酰基和N-三氟乙酰基。这些N-酰基取代基的其他优点是在水解过程中产生的乙酸衍生物由于具有较低的分子量可容易地从产物混合物中分离。
具体而言，该方法适合于通过具有以下结构IV的N-酰基化β-氨基羧酸的转化来制备旋光性芳香β-氨基羧酸，

其中N-酰基取代基与以上定义相同；R⁴选自于H；具有1-10个碳原子的烷基，特别是甲基、乙基、丙基和丁基；OH，优选具有1-4个碳原子的烷氧基，特别是甲氧基和乙氧基；以及卤素。特别有利的是，N-酰基取代基具有权利要求1中所述的结构I，其中R¹和R²分别是H，R³是氯，而R⁴为H。
根据本发明的方法特别适合于由相应的外消旋N-酰基化3-氨基-3-苯基丙酸制备旋光性3-氨基-3-苯基丙酸(β-氨基-β-苯基丙酸)。
根据本发明的方法还可有利地用于通过转化以下结构V的N-酰基化β-氨基羧酸来制备旋光性脂肪族β-氨基羧酸，

其中R⁵代表烷基，特别是甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基或叔丁基，或取代的烷基，特别是取代的甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基或叔丁基。取代基优选选自于卤素、苄基以及包含N-、O-和S-的取代基。
用作起始物的外消旋N-酰基化β-氨基羧酸通常是用合适的酰氯或酸酐进行转化由外消旋β-氨基羧酸得到的。也可原位制备外消旋N-酰基化β-氨基羧酸并将它们直接用于生物催化反应中。
在根据本发明的方法中，可以使用许多酶作为水解酶，合适的水解酶例如是酰基转移酶、蛋白酶、脂酶或酯酶，优选为酰基转移酶。使用I型猪肾酰基转移酶被证明特别合适。但是该反应也可使用蛋白酶，优选得自于Aspergillus的蛋白酶，更优选得自于Aspergillus oryzae。
所用的酶可以天然或者固定形式使用。也可以使用遗传工程酶。
根据本发明的方法优选在水溶液中实施。pH值通常在6-10之间，优选在7-9之间。
在水溶液中，相对于反应混合物中的总量，N-酰基化β-氨基羧酸的浓度优选为2-40重量％，更优选为5-20重量％。
除在水溶液中进行外，根据本发明的方法也可在有机溶剂中进行，优选在水混溶性溶剂如甲醇和乙醇中进行，还可以在有机溶剂与水的合适混合物中进行。
酶的添加量取决于水解酶的类型以及酶制剂的活性。用于反应中的酶的最佳量可容易地由本领域技术人员通过简单的预实验来确定。
N-酰基化β-氨基羧酸在酶催化下的水解通常在10-60℃、特别是在20-40℃之间的温度下进行。
反应进程可容易地通过常规方法来观察，例如通过HPLC。外消旋体的拆分在有50％的外消旋N-酰基化β-氨基羧酸转化时敏感地结束。通常情况下，这可通过例如过滤、优选超滤从反应室中移出酶来完成。
对映体选择性水解外消旋N-酰基化β-氨基羧酸的结果是，可从一种对映体中产生相应的β-氨基羧酸，而其他的对映体基本上未发生转化。现在出现的混合物由N-酰基化β-氨基羧酸和β-氨基羧酸组成，可容易地通过常规方法进行分离。对于分离该混合物，特别合适的是例如合适ph值时的萃取和/或过滤法。
如果在分离所希望的对映体后残留的、非所希望的对映体根据现有技术中已知的方法进行外消旋化并重新引入该方法中，则可以使本发明的方法更为经济。
该循环的结果是，可以从外消旋N-酰基化β-氨基羧酸中得到总共50％以上的所希望的对映体。
根据本发明的方法不仅适合于制备旋光性β-氨基羧酸，而且还可以是例如与制备药物或者植物保护剂有关的复杂多步合成的一部分。
将参考以下实施例来说明本发明。
实施例1(对比例)
在反应器中，由900μl的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝8.0)、100μl的0.1M外消旋N-乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸水溶液和5mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)组成的溶液在30℃下搅拌24小时，然后通过HPLC(柱：Nautilus；洗脱剂：H₂O和乙腈，体积比为80∶20，并含有0.1体积％的三氟乙酸；220nm，1ml/min；进样：900μl洗脱剂+100μl反应混合物)测定转化率。该转化率为＜1％。
实施例2
在反应器中，由950μl的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝8.0)、50μl的10％(w/vol.％)外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸在丙酮中的溶液、以及5mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)在30℃下搅拌24小时，然后通过HPLC(柱：Nautilus；洗脱剂：H₂O和乙腈，体积比为80∶20，并含有0.1体积％的三氟乙酸；220nm，1ml/min；注射：900μl洗脱剂+100μl反应混合物)测定转化率。该转化率为14％。
实施例3
在反应器中加入50ml由磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)组成的溶液以及127mg的外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸(0.5mmol)。随后添加120mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)，并使反应混合物在室温(约25℃)下反应。5天后的转化率为9％，而在19天后为46％(根据反应样品的HPLC)。
实施例4
在反应器中添加50ml的127mg外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸水溶液(0.5mmol)，该溶液通过NaOH调节至pH＝8.2，然后升温至30℃。随后添加120mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)，并使反应混合物在30℃的温度下反应。5天后，转化率为24％(根据反应样品的HPLC)。13天后，首先通过超滤从酶组分中分离反应混合物。得到澄清的滤液，并由其测定转化率以及相对于所形成的旋光性3-氨基-3-苯基丙酸的对映体选择性。转化率为35％，而对于对映体选择性，测定ee值＞98％。
实施例5
在反应器中，由950μl的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.5)、50μl的10％(w/vol.％)外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸在丙酮中的溶液、以及5mg得自于Aspergillus oryzae的蛋白酶(生产商：Sigma，蛋白酶XXIII)组成的溶液在30℃下搅拌4天，然后如实施例2所述通过HPLC测定转化率。该转化率为6％。
实施例6：最优化制备(S)-3-氨基-3-(苯基)丙酸
在100mL的反应器中，将60.4mg的外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸(纯度：＞98％；0.25mmol)添加至12.5ml的水中，并用NaOH调节至pH＝7.75。之后，添加2.5mL的0.001M氯化钴(II)溶液，用12.5mL的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液)补充液体(topping-up)，然后使形成的溶液升温至37.5℃。随后添加60mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)，并使反应混合物在37.5℃的反应温度下反应。1天后，转化率为43.2％，而2天后为48.7％(根据反应样品的HPLC)。之后，通过超滤从酶组分中分离反应混合物。得到澄清的滤液，然后由其测定相对于所形成的旋光性(S)-3-氨基-3-苯基丙酸的对映体选择性。对于对映体选择性，测定ee值为99.0％。
实施例7：最优化制备旋光性3-氨基-3-(2-苯硫基)丙酸
在100mL的反应器中，将63mg的外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-(2-噻吩基)丙酸(纯度：98.3％；0.25mmol)添加至12.5ml的水中，并用NaOH调节至pH＝7.75。之后，添加2.5mL的0.001M氯化钴(II)溶液，用12.5mL的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液)补充液体，然后使形成的溶液升温至37.5℃。随后添加60mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)，并使反应混合物在37.5℃的反应温度下反应。1天后，转化率为49.2％，而2天后为50.0％(根据反应样品的HPLC)。之后，通过超滤从酶组分中分离反应混合物。得到澄清的滤液，然后由其测定相对于所形成的旋光性3-氨基-3-(2-噻吩基)丙酸的对映体选择性。对于对映体选择性，测定ee值为99.0％。
实施例8：最优化制备旋光性3-氨基-3-(p-氟苯基)丙酸
在100mL的反应器中，将66.1mg的外消旋N-氯乙酰基-3-氨基-3-(p-氟苯基)丙酸(纯度：98.2％；0.25mmol)添加至12.5ml的水中，并用NaOH调节至pH＝7.75。之后，添加2.5mL的0.001M氯化钴(II)溶液，用12.5mL的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液)补充液体，然后使形成的溶液升温至37.5℃。随后添加60mg的I型猪肾酰基转移酶(生产商：Sigma)，并使反应混合物在37.5℃的反应温度下反应。1天后，转化率为32.9％，而2天后为45.6％(根据反应样品的HPLC)。之后，通过超滤从酶组分中分离反应混合物。得到澄清的滤液，然后由其测定相对于所形成的旋光性3-氨基-3-(p-氟苯基)丙酸的对映体选择性。对于对映体选择性，测定ee值为95.0％。