地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶 及编码该角蛋白酶的DNA本发明涉及一种地衣形芽孢杆菌的角蛋白酶，特别是一种地衣形芽孢
杆菌L-25角蛋白酶，同时还涉及编码该角蛋白酶的DNA。
中国专利951940678.8公开了一种编码地衣形芽孢杆菌PWD-1角蛋白
酶的DNA，该角蛋白酶可用于水解羽毛，但是，该角蛋白酶的水解活性难
以令人满意，另外还发现这种角蛋白酶的发酵生产过程受一些条件制约，
导致其工业生产的产量受到影响，例如，葡萄糖等碳源(常见的分解代谢
阻遏剂)对PWD-1菌株胞外酶生物合成具有抑制作用，这种阻遏作用会严
重影响该角蛋白酶的发酵生产，有关报道参见，Weickert M.J.和Chambliss
G.H.，Genetic analysis of the promoter region of the Bacillus subtilis alpha-
amylase gene.J.bacteriol.，171，3656-3666(1989)；Fujita Y.和Fujita T.，
Indentification and nucleotide sequence of the promoter region of the
Bacillus subtilis gluconate operon.Nucleic Acids Res.14，1237-1252(1986)；以
及Lin X.等，Expression of Bacillus licheniformis PWD-1 gene in B.subtilis.
J.Industrial Microbiol Biotechnol.19，134-138(1997)。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种在分解代谢
阻遏剂的作用下仍可由其菌株在发酵生产中生物合成且水解活性较高的地
衣形芽胞杆菌L-25角蛋白酶，本发明的进一步目的在于提供一种编码该L-
25角蛋白酶的DNA，本发明的目的还在于提供一种由该DNA衍生的载体，
由该载体转化的宿主细胞以及含有该角蛋白酶的动物饲料制品和皮肤涂敷
药剂。
本发明的目的是通过以下途径来实现的。
地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶，它是一种具有SEQ ID NO：1所示氨
基酸序列的纯化的角蛋白酶。
关于地衣形芽孢杆菌L-25详见《工业微生物和生物技术(J.Industrial
Microbiol & Biotechnol.)杂志》1999年8月23卷中的《从菜籽饼堆肥(canola
meal compost)中筛选和表征降解羽毛的细菌》以及附件1所示的ATCC
(美国菌种保藏中心)。在这篇论文中，对地衣形芽孢杆菌L-25进行了详
细说明，包括土壤的来源、筛选的方法、羽毛降解性质的鉴定以及生长和
蛋白水解活性的影响温度等，而从附件1可以知道，该L-25菌株活体储存
在美国菌种保藏中心(ATCC)。
从地衣形芽孢杆菌L-25中可以采用常规办法分离并提纯角蛋白酶。当
然，也可以采用基因工程技术制备角蛋白酶。
角蛋白水解活性的分析，通过偶氮角蛋白，一种角蛋白衍生物来测定。
偶氮角蛋白的制备是采用Tomarelli等描述的制备偶氮白蛋白的方法，将研
磨的羽毛粉和硫酸、亚硝酸钠(NaNO2)进行反应(见：Tomarelli，R.M.，
Charney J.，和Harding M.L.，The use of azoalbumin as a substrate in the
colormetric determination of peptic and tryptic activity，J.Lab，Clin，Med.，
34，428-433(1949))。50℃下，用5毫克偶氮角蛋白分析角蛋白水解活性(见：
Lin X.，Lee C.-G.，Casale E.S.，和Shih，J.C.H.，Purification and
characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus
licheniformis strain.Appl.Environ Microbiol.，58，3271-3275(1992))。为了
提高可比性，将1单位的角蛋白水解活性定义为50℃下每分钟使得450nm
下吸光值升高0.01。
L-25角蛋白酶能够在羽毛培养基中产生并水解羽毛。37℃下，在60-72
小时培养时间，L-25角蛋白酶产生最高的角蛋白水解活性，在48-60小时
就能完全将羽毛水解。并且L-25能够在菜籽饼或豆粉培养基中产生角蛋白
酶(见图4)。
参照图4，37℃下，地衣型芽孢杆菌L-25在三种培养基——羽毛、菜
籽饼、豆粉中产的角蛋白水解活性与培养时间的关系。样品取自含有对应
培养基的100毫升的烧瓶。角蛋白酶水解活性的测定条件：50℃，15分钟，
加样0.2毫升。
参照图5，比较了L-25和PWD-1产生角蛋白水解活性，L-25的角蛋白
水解活性比PWD-1的高27％。
参照图6，当添加1％的葡萄糖到羽毛培养基中，PWD-1的角蛋白酶
在37℃没有蛋白水解活性产生，培养基中的羽毛保持完整。L-25则相反，
加了1％葡萄糖的羽毛培养基和不加的相比，产生67％的角蛋白水解活性，
37℃，培养4天后，羽毛完全水解。
编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA.
可以再具体为
编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA，其
具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
从L-25菌株分离角蛋白酶基因(kerB)
50℃下，将L-25菌株用50毫升的营养肉汤培养过夜，然后用标准方
法(见：Ausubel F.M.，Brent R.，Kingston R.E.，Moore D.D.，Seidman J.G.，
Smith J.A.，Struhl K.，Preparation and analysis of DNA.In”Current
protocols in molecular cloning.”vol.1.John Wiley & Sons，Inc.，New York，
1987)提取出基因组DNA。设计两个引物(引物1：5’-
CTCCTGCCAAGCTGAAGC-3’；引物2：5’-GATCATGGAACGGTTC-
3’)，以L-25基因组DNA作为模板进行PCR反应。将扩增的角蛋白酶基
因直接克隆进一个克隆载体PCRII(Invitrogen Co.San Diego.Calif)。对该
基因组DNA进行测序。使用通用引物、侧面插入的M13反向引物(17个碱
基)和T7启动子引物(20个碱基)(Promega Co.Madison，WI)，进行测序反应，
分析kerB的核苷酸序列。制备了一对内引物(引物3：5’-
CTGAATTCAAGCGG-3’，和引物4：5’-CGATGGCAGCGATTCC-3’)以
完成kerB的序列分析。
按通常做法，将上述测序反应分别独立进行三次以上，以验证结果的
一致性。
这样，获得了编码地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶的DNA的序列。
将L-25角蛋白酶基因与PWD-1角蛋白酶基因进行比较：
上述测序结果显示kerB和地衣形芽孢杆菌PWD-1角蛋白酶基因(kerA)
具有高度同源性。L-25和PWD-1角蛋白酶在推断的氨基酸序列上有两个
氨基不同。并且发现推定启动子的上游区有几个核苷酸发生了改变。
除上述核苷酸序列以外
显然，那些编码本发明所述的L-25角蛋白酶但由于遗传密码的简并而
在密码子序列上和上述核苷酸序列不同的DNA序列(或寡核苷酸)也是本发
明的一个方面，这种允许不同的核苷酸序列编码同一种蛋白质或肽的遗传
密码简并现象已广泛见于文献中；
另外，那些编码本发明所述的L-25角蛋白酶但由于定点诱变而在密码
子序列上和上述核苷酸序列不同的DNA序列(或寡核苷酸)是本发明的再一
方面，同样，用于改进角蛋白酶特性的定点诱变技术也是众所周知的。
一种复制和表达载体，它含有编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列
的纯化的角蛋白酶的DNA。
这种复制和表达载体可以再具体为
它含有编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的
DNA，并且该DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
载体是一种可复制的DNA构建体。它可用于扩增编码L-25角蛋白酶
的基因，亦可用于表达编码L-25角蛋白酶的基因，还可用于扩大生产而克
隆L-25角蛋白酶的基因，但无论是怎样使用，任何携带有L-25角蛋白酶
基因的载体都具备该角蛋白酶的基本性质。
一种宿主细胞，它由一种复制和表达载体转化或转染，该载体含有编
码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA。
这种宿主细胞可以进一步具体为
它由一种复制和表达载体转化或转染，该载体含有编码如SEQ ID NO：1
所示的氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA，该DNA具有SEQ ID NO：2
所示的核苷酸序列。
已转化的宿主细胞通常地表达L-25角蛋白酶，但为了克隆或扩增L-25
角蛋白酶的基因而转化的宿主细胞无需表达角蛋白酶。合适的宿主细胞包
括那些对熟练的技术人员来说已知的宿主细胞，例如原核生物宿主细胞。
一种动物饲料，其组成要点为，其含有如SEQ lD NO：1所示氨基酸序
列的地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶。
角蛋白酶的生产菌株地衣形芽孢杆菌L-25具有如下使用特性：(1)能够
在分解代谢阻遏剂(如：葡萄糖、肽和氨基酸)存在的情况下产生降解羽毛的
角蛋白酶。具有广泛的底物范围和产角蛋白酶的灵活生长条件。由于具有
这些特性，该角蛋白酶可添加于饲料中直接使用。(2)由于L-25菌株以普通
饲料(如：菜籽饼、大豆粉等)作为发酵材料能够产所述角蛋白酶。因此可以
制备结合特定消化饲料的角蛋白酶产品，直接添加到动物饲料中，无需进
一步分离。除此以外，这种角蛋白酶可以水解动物饲料中的羽毛或其它角
蛋白成分，从而有利于动物消化吸收。
显然，上述这种将L-25角蛋白酶直接应用于动物饲料中的方法以及所
获得的制成品，具有突出的特点和显著的进步。
一种皮肤涂敷药剂，其组成要点为：它含有如SEQ ID NO：1所示氨基
酸序列的地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶。
皮肤患处(例如以鳞屑为主的慢性皮肤病)的角质层通常较厚，涂敷
在表皮的皮肤药剂必须渗透该角质层才能让皮肤吸收，较厚的角质层将对
这种渗透产生很大的阻力而直接影响给药效果，本发明所述的L-25角蛋白
酶添加到皮肤涂敷药剂中，利用其良好的水解特性减薄或去除该角质层，
从而辅助药物较好地渗透到感染区，提高给药效果。而一般皮肤药剂中不
含角蛋白成分，因此添加进该角蛋白酶不会对药物成分构成影响。
综上所述，本发明相比现有技术具有如下优点：具有高的角蛋白水解
活性，并在代谢阻遏剂(如葡萄糖、肽和氨基酸)存在的情况下产生角蛋白酶
并保持良好的水解活性，而这些特点是一个广为人知的羽毛降解地衣形芽
孢杆菌PWD-1所不具备的。当然因如是，本发明所述的L-25角蛋白酶相
比PWD-1角蛋白酶在水解羽毛以及进一步使其转化成可消化的蛋白质等方
面具有更好的工业应用价值。
附图1是编码L-25角蛋白酶的DNA序列图。
附图2是L-25角蛋白酶基因序列与PWD-1角蛋白酶基因序列的对比
图。
附图3是KerB克隆进质粒的示意图。
附图4是地衣形芽孢杆菌L-25在三种培养基----羽毛、菜籽饼、大豆
粉的角蛋白水解活性与培养时间的关系。
附图5是地衣形芽孢杆菌L-25和PWD-1在单纯的羽毛培养基中产
生的角蛋白水解活性与时间的关系。
附图6是地衣形芽子杆菌L-25和PWD-1在含有1％葡萄糖的羽毛培
养基中产生的角蛋白水解活性与时间的关系。
下面结合附图对本发明进行更详尽的描述。
最佳实施例：
L-25角蛋白酶的获得：
从地衣形芽孢杆菌L-25菌株中以常规的分离、提纯方法提纯L-25角
蛋白酶。
当然可以通过在允许所编码角蛋白酶表达的条件下培养宿主细胞并收
集所表达的角蛋白酶而制备。角蛋白酶可以融合到一合适的分泌前导序列
上并且表达进入培养基并从培养基中收集，或角蛋白酶也可以胞内表达，
然后溶化细胞并从胞溶产物中收集角蛋白酶。
从L-25菌株分离角蛋白酶基因(kerB)：
基因组DNA采用标准过程抽提
L-25菌株在100毫升营养汤中培养，37℃，摇培(200rpm)，过夜。细
菌细胞通过4000×g，10分钟，离心收集，再悬浮于9.5毫升含有30毫升
溶菌酶溶液的TE缓冲液，冰浴10分钟。然后，将0.5毫升10％SDS和50
微升的蛋白酶K(20mg/ml)加入溶液，37℃保温1小时。随后，将1.8毫升
的5M NaCl和1.5毫升的CTAB/NaCl溶液(10％CTAB的0.7M NaCl溶液)
加入样品，并彻底混和。65℃，保温20分钟，加入等体积氯仿/异丙醇彻底
抽提，然后离心10分钟。上面的水相转移到一个新的离心管，并用等体积
的苯酚/氯仿/异丙醇抽提两次。加入0.6体积的异丙醇沉淀DNA，4℃，离
心15分钟。分离的DNA溶于TE或去离子水，存储于-70℃。最终DNA
浓度用260nm分光光度计测定。
PCR扩增
准备两个引物：
引物1：5’-CTCCTGCCAAGCTGAAGC-3’；
引物2：5’-GATCATGGAACGGTTC-3’。
1.46kb的角蛋白酶基因(kerB)片段用引物1和引物2激发，以L-25基
因组DNA作为模板进行PCR扩增反应。
对kerB进行测序
将扩增的角蛋白酶基因直接克隆进一个克隆载体PCRII(Invitrogen
Co.San Diego，Calif)。侧面插入M13反向引物(17个碱基)和T7启动子引物
(20个碱基)(Promega Co.Madison，WI)，用于分析kerB序列。KerB的核
苷酸序列分析采用通用引物、M13反向引物和T7启动子进行测序反应。制
备了一对内引物：
引物3：5’-CTGAATTCAAGCGG-3’；
引物4：5’-CGATGGCAGCGATTCC-3’
以完成kerB的序列分析。
最终kerB序列的确定通过3个以上独立的测序反应。
获得的编码L-25角蛋白酶的DNA的序列如附图1所示，将它与众所
周知的地衣形芽孢杆菌PWD-1角蛋白酶基因(kerA)进行比较，如附图2所
示，发现：
L-25角蛋白酶基因(kerB)与PWD-1角蛋白酶基因(kerA)具有极高的相
似性。KerB的编码区只有两个氨基酸与kerA的残基不同，这两个氨基酸
为(前体序列区的Leu-15，成熟酶的Val-273)。前体序列区中Phe-15→Leu-
15，和成熟酶的C-端Ala-273→Val-273的改变并没有改变该位置的疏水性。
两个变化都仅是密码子中一个核苷酸发生了改变：TTC(Phe)→TTA(Leu)，
GCT(Ala)→GTT(Val)。两个角蛋白基因中推定启动子的上游区发生了显著
的改变，70个核苷酸有8个不同(附图2)。
推测，启动子上游区域寡核苷酸的改变会改变某些调控蛋白的结合亲
和力，如：负调控蛋白Hpr和Sin。其它实验室的结果已证实了枯草芽孢杆
菌基因(aprE)和中性蛋白酶基因(nprE)的启动子及其上游区域是Hrp和Sin
的靶序列。
关于载体和宿主细胞：
如附图3所示，用XbaI-SpeI消化切下PCRII中的角蛋白酶基因，插
入质粒pUB18-P43的XbaI位点，从而获得一种含有编码如SEQ ID NO：1
所示的氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA的载体。
按照Dubnau和Gryezan描述的操作过程，将结果质粒转化进蛋白酶-
缺陷型枯草芽孢杆菌DB104感受态细胞，该细胞即为一种含有编码如SEQ
ID NO：1所示的氨基酸序列的纯化的角蛋白酶的DNA的宿主细胞。(见：
Dubnau D.和Davidoff-Abelson R.，Fate of transforming DNA following
uptake by competent Bacillus subtilis.J.Mol.Biol.，56，209-221(1971)；
Gryezan T.J.等，Characterization of Staphylococcus aureus plasmids
introduced by transformation into Bacillus subtilis.J.Bacteriol.，134，318-
329(1978))。
方法为：首先，在含卡那霉素(10μg/ml)的胰蛋白胨血琼脂培养基
(tryptose blood agar base，TBAB)培养皿上筛选转化菌落，再用牛奶一琼脂
培养基平板培养，进一步鉴定。选择有透明圈的菌落用于质粒分离和PCR
分析。结果质粒pLK-8的大小为5.5kb。以pLK8作为模板，使用引物1
和引物2，PCR扩增1.46kb的kerB片断，验证了kerB已经转入新的质粒
在新的载体中存在。
转化进结果质粒pLK-8的DB104菌株FD-8(DB104/pLK-8)培养在羽
毛培养基(含10μg钾/ml)，FD-8细胞迅速生长，将培养基中所有羽毛彻底
水解。而未转化进结果质粒pLK-8的空白DB104培养基中，没有羽毛的水
解发生，培养5天后，介质仍然保持澄清。
一种动物饲料，它含有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的地衣形芽孢
杆菌L-25角蛋白酶。
一种皮肤涂敷药剂，它含有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的地衣形
芽孢杆菌L-25角蛋白酶。
序列表
(一)一般信息
1.申请人：福建福大百特科技发展有限公司。
2.发明名称：地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶及编码该角蛋白酶的DNA。
3.序列数量：2。
4.联系地址：国别：中国
省：福建
城市：福州市
地址：古田路能源巷6号
邮编：350005
5.代理人信息：姓名：林天凯
代理人证号：35201003
6.电信信息：电话：0591-3364424
传真：0591-3363304
(二)SEQ ID NO：1的信息
1.序列特征：
(1)长度：274个氨基酸
(2)类型：氨基酸
(3)拓扑学：线性
2.分子类型：蛋白质
3.假拟：
4.原始来源：
(1)生物体：地衣形芽孢杆菌
(2)菌株：L-25
5.序列描述：SEQ ID NO：1
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met Leu Val
1 5 10 15
Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala Lys Asn Val
20 25 30 35
Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys Thr Ala Ser Val Lys
40 45 50
Lys Asp Val Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile
55 60 65 70
Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp
75 80 85 90
Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr
95 100 105
Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys
110 115 120 125
Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp
130 135 140 145
Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly
150 155 160 165
Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly
170 175 180
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu ASn Ser Ser
185 190 195 200
Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly
205 210 215 220
Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln
225 230 235 240
Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser
245 250 255 260
Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Val Lys
265 270 274
(三)SEQ ID NO：2的信息
1.序列特征：
(1)长度：1460个碱基对
(2)类型：核酸
(3)链型：单链
(4)拓扑学：线性
2.分子类型：DNA(基因组的)
3.假拟：无
4.反义：无
5.原始来源：
(1)生物体：地衣形芽孢杆菌
(2)菌株：L-25
4.序列描述：SEQ ID NO：2
CTCCTGCCAA GCTGAAGCGG TCTATTCATA CTTTCGAACC GAATATTTTT CTAAAACAGT 60
TATTAATAAC CAATAAATTT AAATTGGCCG TTCAAAAAAA TGGGTCTACC ATATAATTCA 120
TTTTTTTTCT ATAATAAATT AACAGAATAA TTGGAATAGA TTATATTATC CTTCTATTTA 180
AATTATTCTG AATAAAGAGG AGGAGAATAA GTAATGATGA GGAAAAAGAG TTTTTGGCTT 240
GGGATGCTGA CGGCCTTAAT GCTCGTGTTC ACGATGGCAT TCAGCGATTC CGCTTCTGCT 300
GCTCAACCGG CGAAAAATGT TGAAAAGGAT TATATTGTCG GATTTAAGTC AGGAGTGAAA 360
ACCGCATCTG TCAAAAAGGA CATCATCAAA GAGAGCGGCG GAAAAGTGGA CAAGCAGTTT 420
AGAATCATCA ACGCGGCAAA AGCGAAGCTA GACAAAGAAG CGCTTAAGGA AGTCAAAAAT 480
GATCCGGATG TCGCTTATGT GGAAGAGGAT CATGTGGCCC ATGCCTTGGC GCAAACCGTT 540
CCTTACGGCA TTCCTCTCAT TAAAGCGGAC AAAGTGCAGG CTCAAGGCTT TAAGGGAGCG 600
AATGTAAAAG TAGCCGTCCT GGATACAGGA ATCCAAGCTT CTCATCCGGA CTTGAACGTA 660
GTCGGCGGAG CAAGCTTTGT GGCTGGCCAA GCTTATAACA CCGACGGCAA CGGACACGGC 720
ACACATGTTG CCGGTACAGT AGCTGCGCTT GACAATACAA CGGGTGTATT AGGCGTTGCG 780
CCAAGCGTAT CCTTGTACGC GGTTAAAGTA CTGAATTCAA GCGGAAGCGG ATCATACAGC 840
GGCATTGTAA GCGGAATCGA GTGGGCGACA ACAAACGGCA TGGATGTTAT CAATATGAGC 900
CTTGGGGGAG CATCAGGCTC GACAGCGATG AAACAGGCAG TCGACAATGC ATATGCAAGA 960
GGGGTTGTCG TTGTAGCTGC AGCAGGGAAC AGCGGATCTT CAGGAAACAC GAATACAATT 1020
GGCTATCCTG CGAAATACGA TTCTGTCATC GCTGTTGGCG CGGTAGACTC TAACAGCAAC 1080
AGAGCTTCAT TTTCCAGTGT GGGAGCAGAG CTTGAAGTCA TGGCTCCTGG CGCAGGCGTA 1140
TACAGCACTT ACCCAACGAA CACTTATGCA ACATTGAACG GAACGTCAAT GGCTTCTCCT 1200
CATGTAGCGG GAGCAGCAGC TTTGATCTTG TCAAAACATC CGAACCTTTC AGCTTCACAA 1260
GTCCGCAACC GTCTCTCCAG CACGGCGACT TATTTGGGAA GCTCCTTCTA CTATGGGAAA 1320
GGTCTGATCA ATGTCGAAGC TGCCGTTCAA TAACATATTC TAACAAATAG CATATAGAAA 1380
AAGCTAGTGT TTTTAGCACT AGCTTTTTCT TCATTCTGTT GAAGACTGTT CAATATTTTG 1440
AATCCGTTTC CATGATCAAG 1460