血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的应用及其功能肽段 本发明涉及血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的应用及其功能肽段。
心血管病被称为是威胁人类健康与生命的第二杀手，血栓的产生与发展既是心血管疾病发生的重要环节，又是造成中风，心肌梗塞的直接原因。溶栓药物的开发研究一直在心血管疾病防治的研究中处于重中之重的位置，而且在相当长时期内都将是生物工程研究与产品开发的重点。
机体存在着凝血与纤溶(使凝血块溶解)两个对立与统一的系统，维持和调节两者间的平衡，保证血液循环的畅通。基于机体具有的这种凝血与纤溶机制，人们研究与开发防止血栓形成和溶(血)栓方法和药物。目前国内外最广泛使用的有效的溶栓生物制品有组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，尿激酶(uPA)，链激酶等，它们都是基于这样的机制：血液中不具活性的血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)在其激活因子(tPA，uPA)的作用下转变为具有活性的血纤维蛋白酶(plasmin)，后者能够溶解由血纤维蛋白形成地凝血块[1.Machovich，R.，Litwiller，R.D.and Owen，W.G.(1992)Biochemistry.31，11558-11561；2.Hoylaerts，M.，Rijken，D.C.，Lijnen，HR.and Collen，D.(1982)J.Biol.Chem.257，2912-2919.]。但是，现有上述溶栓药物普遍存在药效持续时间短，给药量小时疗效不佳，而大剂量使用又会损伤机体凝血机制的缺点。
事实上，在体外实验中，如果没有某些辅助因素(cofactors)存在，血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纤溶活性很低。因此，在机体内应该存在有促进或激活纤溶体系的活性物质。目前发现的相关辅助因素或因子有三类：形成血凝块的纤维蛋白本身(fibrin)，某些细胞膜表面受体聚合体(如annexin II complex)，某些高温等激烈处理产生的不可逆变性蛋白[1.Machovich，R.and Owen，W.G.(1997)Arch.Biochem.Biophy.344，343-349；2.Ellis，V.(1997)TCM，7(7)，227-234.]。然而，它们都不是天然的可溶性血清活性因子，与人体的亲和和相容性均存在着问题，显然不宜开发为临床应用的促溶(血)栓活性物质药物。
本发明的目的是提供血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的应用。
本发明的另一个目的是提供上述血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的功能肽段。
血清β2-糖蛋白I可以作为促溶栓活性物质而得到广泛应用，特别是应用于制造各类的溶栓药物。
血清β2-糖蛋白I与磷脂的复合物或载有血清β2-糖蛋白I的脂质体、与组织纤维蛋白溶酶原激活剂或尿激酶结合的复合物以及该复合物进一步与磷脂结合的复合物，均具有溶栓的作用，可以利用其作为活性成分，生产具有溶栓功能的药物。
血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的功能肽段为：Gly1-Pro62，其主要作用肽段为Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60。利用该肽段可以生产具有溶栓功能的药物。
血清β2-糖蛋白I作为促溶栓活性物质的结构域V的功能肽段为：Cys270-Ala320，其主要作用肽段为Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320。利用该肽段也可以生产具有溶栓功能的药物。
本发明的促溶(血)栓活性物质(promoting fibrinolysis activators，血清β2-糖蛋白I)是由血清提取纯化和基因工程生产的β2-糖蛋白I(β2-GlycoprotainI)，也称载脂蛋白H(apolipoprotein H，简称ApoH)。该分子为一种单链蛋白分子，具有326个氨基酸，分子量为43-50KD。其氨基酸序列及提纯、制备方法见Lozier，J.，Takahashi，N.and Putnam，F.W.(1984)Proc.Natl.Sci.USA，81，3640-3644.
研究表明，ApoH的相关肽段Gly1-Pro62(CCP1)[Schwarzenbacher，R.，Zeth，K.，Diederichs，K.，Gries，A.，Kostner，G.M.，Laggner，P.And Prassl R.(1999)EMBO J.，18，6228-6239.]的主要作用肽段为Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44(CCP1-1)，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60(CCP1-2)。ApoH的结构域V(domain V，Ser244-Cys326，D.V)[Schwarzenbacher，R.，Zeth，K.，Diederichs，K.，Gries，A.，Kostner，G.M.，Laggner，P.And Prassl R.(1999)EMBO J.，18，6228-6239.]，尤其Cys270-Ala320(D.V-1)，其主要作用肽段为Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288(D.V-2)和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320(D.V-3)。上述肽段在β2-糖蛋白I的功能上起重要作用。
实验证明，在没有其它辅助因素(cofactors)存在的情况下，加入本发明的血清β2-糖蛋白I或其功能肽段，显著促进tPA活化血纤维蛋白溶酶原为血纤维蛋白溶酶，进而激活和显著提高血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纤溶活性。
与不加血清β2-糖蛋白I的对照组相比较，在加入血清β2-糖蛋白I时，tPA促纤溶活性和血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系的纤溶活性均可大大提高，可高达20多倍，其活性的提高与加入的β2-糖蛋白I或其活性片断存在效应剂量关系。
本发明的血清β2-糖蛋白I或其活性片断有双向调节作用，不仅能够提高血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系的纤溶活性，而且在一定剂量下，能够降低由某些辅助因子(如annexinII)对血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系的纤溶活性的增强作用。
下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步说明。
图1为实施例1的对比曲线
图2为实施例1当加入不同浓度的ApoH时的促纤溶活力曲线
图3为实施例2的对比曲线
图4为实施例2当加入不同浓度的ApoH时的促纤溶活力曲线
图5为显示ApoH各活性片段促溶纤活性的直方图
在下面的所有实施例中，以荧光强度表示促纤溶活力，用I360/465nm表示，其中360nm是激发光，465nm是发射光，也可以用促纤溶活力的绝对速度K(I/Min2)表示，即强度与时间平方的比值。
实施例1：ApoH对tPA-依赖的血纤维蛋白溶酶纤溶活性的影响
实验反应体系为：
250nM(100-500nM均可)血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)
25nM(10-50nM均可)tPA
600nM(200-1000nM均可)血纤维蛋白酶的反应底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)
实验组加入1μM ApoH(0.25-5μM均可)
反应温度：恒温30℃(25℃-37℃均可)
荧光光度测量：激发光360nm/发射光465nm
在反应0-60分钟期间内，每隔5分钟，测量一次反应体系的荧光强度。
如图1所示(曲线1为对照组，曲线2为实验组，横坐标是反应时间的平方，纵坐标为荧光强度I360/465nm)，较之于不加ApoH的对照组，在加入了ApoH时，反应产物的荧光强度所表示的血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系的纤溶活性可大大提高，最高可达20多倍。当用上述操作方法，实验组中加入0.2-10.0μM不同浓度的ApoH时，如图2所示(横坐标为ApoH的浓度，纵坐标为促纤溶活力K(I/Min2)，图中的各点表示实际测得的不同ApoH浓度下促纤溶活力K(I/Min2)的数字)，表明纤溶活性的提高与加入的β2-糖蛋白I存在效应剂量关系，但当β2-糖蛋白I的浓度达到一定时，反应速度不再增加，保持稳定，与上述的β2-糖蛋白I促纤溶的作用原理相吻合。
实施例2、ApoH对tPA促纤溶活性的影响
实验反应体系为：
30nM tPA(10-50nM均可)
700nM(200-1000nM均可)的tPA反应底物(Glutaryl-Gly-Arg-AMC)
实验组加入0.5μM ApoH(0.25-5μM)
反应温度恒温32℃(25℃-37℃均可)
荧光光度测量激发光360nm/发射光465nm
在反应0-60分钟期间内，每隔5分钟，测量一次反应体系的荧光强度。
如图3所示(曲线3为对照组，曲线4为实验组，横坐标是反应时间的平方，纵坐标为荧光强度I360/465nm)，较之于不加ApoH的对照组，在加入了ApoH时，反应产物的荧光强度所表示的tPA促纤溶活性可大大提高，最高可达20多倍。当用上述操作方法，实验组中加入0.2-5.0μM不同浓度的ApoH时，如图2所示(横坐标为ApoH的浓度，纵坐标为促纤溶活力K，图中的各点表示促纤溶活力K(I/Min2))，表明纤溶活性的提高与加入的β2-糖蛋白I存在效应剂量关系。
实施例3：ApoH各活性片段的促溶纤活性
400nM(100-500nM均可)血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)
40nM(10-50nM均可)tPA 200-1000nM血纤维蛋白酶的反应底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)
实验组分别加入1μM ApoH的相关片段：CCP1，CCP1-1，CCP1-2和D.V，D.V-1，D.V-2，D.V-3。
反应温度：恒温30℃(25℃-37℃均可)
荧光光度测量，激发光360nm/发射光465nm
在反应0-60分钟期间内，每隔5分钟，测量一次反应体系的荧光强度。
实验结果表明，较之于不加ApoH的对照组，在加入上述ApoH活性片段时，反应产物的荧光强度所表示的血纤维蛋白溶酶原-tPA/uPA纤溶体系的纤溶活性可有不同程度的提高。如图5所示，为ApoH各活性片段在反应体系中反应60分钟时的直方图，横坐标依次为对照、CCP1、CCP1-1、CCP1-2、D.V、D.V-1、D.V-2和D.V-3，纵坐标为荧光强度I360/465 nm，可以看出，虽然各活性片段之间的纤溶活性有差别，但较对照组均有较大的提高。