新的脱乙酰壳多糖 【技术领域】
本发明涉及一种新颖的脱乙酰壳多糖(chitosan)，从真菌制备脱乙酰壳多糖的方法，以及使用脱乙酰壳多糖治疗癌症的方法。
背景技术
壳多糖是为一种极不易溶的聚-β-1，4-D-N-乙醯葡糖胺(Poly-β-1.4-N-acetyl-D-glucosamine)。脱乙酰壳多糖为可溶于酸中的脱乙酰形式的壳多糖。壳多糖普遍存在于海洋无脊椎动物的外骨架结构或昆虫外表皮中。壳多糖和脱乙酰壳多糖均存在于大部分接合菌纲(Zygomycetes as.)的细胞壁中。
脱乙酰壳多糖可以由壳多糖经脱乙酰反应而得，而壳多糖可以从螃蟹壳或虾壳制备而得。然而，这种制备方法难以获得品质一致的脱乙酰壳多糖。而且，螃蟹壳或虾壳的成分会随着季节或环境因素而变化。因此，要从螃蟹壳或虾壳中获得物化性质稳定的脱乙酰壳多糖是非常困难的。脱乙酰壳多糖亦可以从毛霉菌科(Mucoraceae family)的丝状真菌制备。在这种制备过程中，无须进行化学脱乙酰反应。因此，真菌脱乙酰壳多糖的品质较为稳定。
【发明内容】
本发明的目的为提供一种新颖的脱乙酰壳多糖，及从真菌制备脱乙酰壳多糖的方法，使用脱乙酰壳多糖治疗癌症的方法，以及脱乙酰壳多糖用于治疗癌症的用途。
本发明的脱乙酰壳多糖的重均分子量为50,000-140,000克/摩尔，且其脱乙酰化程度为为85％-95％。
重均分子量(Mw)是每一分子量范围内的聚合物重量对分子量地曲线的第一部分(first moment)。其计算方式如下式：
MW=ΣiNiMi2ΣiNiMi]]>
其中，求和是针对所有不同大小的聚合物分子(i＝1至i＝∞)进行，且Ni是重量为Mi的分子的数量(以摩尔计算)。上述Mw的值可以用例如光散射技术、沉淀平衡测量或其它本领域已知的方法测得。
脱乙酰反应涉及将壳多糖分子链上的乙酰基去除，而留下氨基(-NH2)。脱乙酰化程度(DD)代表多糖分子中游离氨基的含量，其可以用任何已知的方法测得，例如：茚三酮试验(ninhydrin test)、线性电位滴定法、胶体滴定法、近红外线光谱分析、核磁共振光谱分析、溴化氢滴定法、红外线光谱分析、紫外线分光光度法、一次微分(first derivative)紫外线分光光度法、酶测定法或其它本领域已知方法等。
本发明的脱乙酰壳多糖可以从，例如，真菌来制得。适用的真菌包括毛霉菌科的真菌，例如放射毛霉属(Actinomucor genus)。本发明真菌的一个具体实例为豆腐乳放射毛霉菌(Actinomucor taiwanensis)。脱乙酰壳多糖可如下获得：在15-24℃培养真菌，继之从该培养中分离出脱乙酰壳多糖。
脱乙酰壳多糖可以在包含药学可接受载体的药物组合物中用于治疗癌症。一方面，本发明提供一种用于治疗乳腺癌(breast cancer)的方法。该方法包括对有相应需要的受试者给药有效剂量的脱乙酰壳多糖，例如重均分子量为50,000-140,000克/摩尔，且脱乙酰化程度为85％-95％的脱乙酰壳多糖。另一方面，本发明提供一种治疗宫颈(cervical)癌的方法，通过对有相应需要的受试者给药有效剂量的本发明的脱乙酰壳多糖来实现。
本发明提供一种新颖的具有抗癌活性的脱乙酰壳多糖。下文详述本发明的一个或多个实施方案。本发明的其它特征、目的及优点，可以从下列说明以及权利要求中清楚地看出。
【具体实施方式】
本发明基于下述意外发现：从豆腐乳放射毛霉菌制备出的脱乙酰壳多糖可在体外(in vitro)抑制人类子宫颈上皮癌细胞(Human Cervix Epithelioidcarcinoma cell，HeLa)及人类乳腺癌细胞(MCF-1)的生长。
相应地，本发明提供一种从真菌制备脱乙酰壳多糖的方法。该方法涉及在15-24℃进行真菌培养并从该真菌培养中分离出脱乙酰壳多糖。
可用于本发明的真菌包括毛霉菌科(例如放射毛霉属)的真菌。这些真菌可以由各种公开的真菌保藏库获得。例如：下述实施例中所使用的豆腐乳放射毛霉菌可以来自生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection andResearch Center，BCRC，BCRC31159)，该生物资源保存及研究中心是隶属于食品工业发展研究所，其位于中国台湾的新竹市食品路331号。
可以按照本领域已知的方法培养真菌。例如：将真菌接种于YM琼脂培养基中，将接种有真菌的培养基于25-37℃培养3至6日。将上述真菌产生的孢子悬浮于液体中，得到每毫升104-107菌落单位(cfu/ml)的菌液。将该菌液直接接种于发酵培养基上。
该发酵培养基的初始pH值可以为pH3-6，例如pH3-5，其可以包含：葡萄糖5-50g/L(例如20g/L)；蛋白胨(Peptone)5-60g/L(例如10g/L)；酵母提取物0.1-5g/L(例如1g/L)，以及其它适当成分。该培养基可以进一步包含0.01-30g/L(NH4)2SO4；0-3g/L K2HPO4；0-3g/L NaCl；0-15g/LMgSO4·7H2O；0-0.3g/L CaCl2。将真菌于15-24℃进一步培养2到4日。
脱乙酰壳多糖可以依据美国专利6255085B1所述的方法以碱处理及酸处理从真菌菌丝中分离纯化出。将细胞团从发酵液中分离出来，再以蒸馏水清洗。然后将细胞用0.5N-2N氢氧化钠溶液处理，将该碱混合液置于121℃中保温15分钟。以离心方式使固体物沉淀，并以蒸馏水及乙醇清洗离心得出的固体沉淀。将经过清洗的该固体沉淀物以2％醋酸溶液处理，置于95℃中保温12小时。将上述步骤得到的悬浮液以离心方式分离，可以得到酸可溶性上清液。用2N氢氧化钠溶液将该上清液的pH值调整至pH10，使得能够将脱乙酰壳多糖沉淀分离出。最后，将该纯化出的脱乙酰壳多糖以蒸馏水清洗后冷冻干燥。
脱乙酰壳多糖的重均分子量(Mw)及脱乙酰化程度(DD)可以分别用例如GPC/SEC3及一次微分紫外线分光光度法测得，或利用任何本领域已知的方法测量得知。如下文实施例所述，利用上述方法所制备的真菌脱乙酰壳多糖，其Mw为50,000-140,000克/摩尔，其DD为85％-95％。
意外的是，10ppm浓度(约10-7M)的真菌脱乙酰壳多糖对HeLa细胞及MCF-7细胞生长具有强效细胞毒活性，而甲壳脱乙酰壳多糖则并未表现出此效果。并且，真菌脱乙酰壳多糖对于人类胚胎肺细胞(MRC-5)或其它肿瘤细胞系，例如：人类胃肿瘤细胞系(AGS)及人类肝癌细胞系(Hep G2)并没有细胞毒活性。
因此，本发明提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体及有效剂量的脱乙酰壳多糖，其中该脱乙酰壳多糖的重均分子量为50,000-140,000克/摩尔，且脱乙酰化程度为85％-95％。该药物组合物可以用于治疗或预防乳腺癌或宫颈癌。该药学上可接受的载体包括：溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂(isotonic)及吸收延缓剂。上述的有效剂量指为达到治疗效果所需的剂量。用于动物及人类的药物剂量(每平方米体表面积所需毫克量)如Freireich等(1996)于Cancer Chemother.Rep.50：219所述。体表面积可以从受试者的体长及重量近似测得，见ScientificTables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970之p537所述。然而，如本领域技术人员所知，所谓有效剂量还可能因为给药方式及赋形剂(excipient)用法等因素而异。
本发明脱乙酰壳多糖可以使用各种常规方法配制成适于不同给药途径的药剂形式。例如，其可以配制成用于口服的胶囊、胶封(gel seal)、或片剂。其中，胶囊可以包含任何的常规药学上可接受的物质，例如动物胶(gelatin)或纤维素。片剂可以按照常规制备方法，将脱乙酰壳多糖与固体载体及润滑剂压合而成。固体载体的实例可以为淀粉或糖皂土(sugar bentonite)。本发明脱乙酰壳多糖亦可以以硬壳片剂或胶囊的形式给药，其包含：诸如乳糖或甘露糖醇等结合剂，常规填料，和片化(tableting)剂。该药物组合物可以经由非胃肠道途径给药。上述非胃肠道剂型可以为：活性药剂的水溶液，等渗盐水或5％葡萄糖，或其它任何已知的药物可接受的赋型剂。环糊精(cyclodextrin)或其它本领域熟知的溶解剂均可作为用于传递治疗制剂的药物赋形剂。
本发明的药物组合物的疗效可以于体内(in vivo)和体外(in vitro)进行评估。参见下述的实施例。简言之，所述组合物抑制宫颈癌或乳腺癌生长的效果可以在体外进行测试。就体内研究而言，可以对动物注射该药物组合物，然后估计该药物组合物的抑癌效果。依据这些结果，可以决定给药途径以及适当的剂量范围。
本发明还提供一种用于预防及治疗乳腺癌或宫颈癌的方法，其对有相应需要的受试者给药有效剂量的脱乙酰壳多糖(例如上述的真菌脱乙酰壳多糖)。接受该治疗的受试者可以为癌症患者，亦可以是由于遗传因素或环境因素而易患乳腺癌或宫颈癌的个体。本发明的方法可以单独实施，亦可以与其它药物或治疗合并使用。
一般而言，脱乙酰壳多糖悬浮于药学上可接受的载体中(例如生理盐水)，其给药方式可以为：口服、静脉注入(intravenous infusion)、皮下注射或植入、肌肉注射或植入、鞘内注射或植入、腹膜内注射或植入、直肠内注射或植入、阴道内注射或植入、鼻内注射或植入、胃内注射或植入、气管内注射或植入、或肺内注射或植入。上述药物组合物的有效剂量是取决于诸多因素：给药方式、配方性质(thenatore of the formulation)、受试者健康状况、受试者身体特质(包括体型、体重、体表面积、年龄、性别)、所给的其它药物，以及负责医师的判断。适合的剂量范围为0.01-100.0mg/kg。由于可以使用的脱乙酰壳多糖多种多样，以及不同给药方式可产生的效力不同，该有效剂量值亦存在相当大的差异。例如，口服剂型所需要的剂量可能比静脉内注射要高。上述有效剂量可以利用本领域已知常规用于最优化的经验性方法来调整。使用适当的传输载体(例如聚合微粒或可植入装置)将该药物胶囊化，可以增加传输的效率，尤其是口服传输的效率。
下文所述实施例仅是作为例示，并非用以限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，所做些许更动与润饰都在本发明保护范围之内。本文所引述文献全文引入以作参考。
真菌脱乙酰壳多糖的制备
(1)真菌脱乙酰壳多糖A的制备
从培养4日的斜面培养取得豆腐乳放射毛霉菌孢子悬浮液，将之直接接种于装有400ml新鲜发酵培养基的1升摇瓶中。于22℃，以200rev/min振荡发酵50小时。上述发酵培养基每升包含以下成分：10克蛋白胨、20克葡萄糖、1克酵母提取物、5克(NH4)2SO4、1克K2HPO4、1克氯化钠、5克MgSO4·7H2O及0.1克氯化钙。该发酵培养基的初始pH值调整为pH4。
将细胞团由该发酵液中分离出来，再用1N氢氧化钠溶液于121℃处理15分钟。将该混和液中不溶于碱的物质以2％醋酸溶液悬浮，于95℃中保温12小时，使得其中的脱乙酰壳多糖能够溶解。将该酸溶性上清的pH值调整至pH10，使得能够将溶解的脱乙酰壳多糖通过沉淀分离出。将沉淀物该纯化(即真菌脱乙酰壳多糖A)清洗并干燥。
(2)真菌脱乙酰壳多糖B的制备
从培养4日的斜面培养物取得豆腐乳放射毛霉菌孢子悬浮液，将之直接接种于装有3升新鲜发酵培养基的5升发酵罐中。于22℃中，以400rpm的搅拌速度和3L/min的通气量发酵培养50小时。上述发酵培养基每升包含以下成分：10克蛋白胨、20克葡萄糖、1克酵母提取物、5克硫酸胺、1克磷酸氢二钾、1克氯化钠、5克MgSO4·7H2O及0.1克的氯化钙。该发酵培养基的初始pH值调整为pH4。
将细胞团由该发酵液中分离，并从中纯化出脱乙酰壳多糖(真菌几丁聚糖B)，其实施步骤是如(1)上述。
真菌脱乙酰壳多糖的抗癌活性
HeLa细胞(BCRC60005)及MCF-7(BCRC60436)可以由中国台湾的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)取得。将细胞悬浮液在含有0.05％胰蛋白酶及0.53mM EDTA-4Na的HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution)中进行胰蛋白酶消化处理，以吸管反复吸放该细胞悬浮液以使得细胞团散开，并以血细胞计数器对细胞进行计数。将细胞悬浮于MEM培养基(含10％血清)中，HeLa细胞的浓度为每毫升8.35×103个细胞，而MCF-7细胞的浓度为每毫升1.67×104个细胞。将180μl的细胞悬浮液接种于96格的组织培养盘中，于37℃、5％二氧化碳浓度中培养17至20小时。
将不同的脱乙酰壳多糖溶于含有5×10-3M醋酸的D-PBS(Dulbecco’sphosphate-buffered saline)中，各取20μl的脱乙酰壳多糖溶液分别加入上述组织培养盘的各细胞格中，将细胞于37℃、5％二氧化碳浓度中培养3日。上述细胞培养中所含的脱乙酰壳多糖终浓度为10ppm(约为10-7M)。
以MTT(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑溴化物)法分析细胞活力。将MTT加入D-PBS液中，使其浓度为5mg/ml，各取20μl的该MTT溶液分别加入上述组织培养盘的各细胞格中，再将细胞于37℃、5％二氧化碳浓度中培养4小时。移除该细胞培养基。在各格中加入100μl的DMSO，将该组织培养盘摇动5分钟。测量每一细胞格的光密度，其测试波长为540nm，对照波长为690nm。
本试验所采用的脱乙酰壳多糖包括：真菌脱乙酰壳多糖A、真菌脱乙酰壳多糖B、蟹壳脱乙酰壳多糖I、蟹壳脱乙酰壳多糖II、蟹壳脱乙酰壳多糖III、蟹壳脱乙酰壳多糖IV。
本试验中每一种脱乙酰壳多糖的脱乙酰化程度利用一次微分紫外线分光光度法得知，该方法如Tan等(1998)Talanta 45：713-719所述。
本试验中每一种脱乙酰壳多糖的分子特性是以三项检测(triple-dectection)GPC/SEC3测量的。将脱乙酰壳多糖样品以2.5mg/ml的浓度配制于流动相(mobile phase)中，并于摄氏90度中加热3小时。该流动相pH值为pH4.1，其包含0.35N醋酸及8.2g/L的醋酸钠，且其流动速度为0.7ml/min。样品注射量为100μl，SEC3分离以日本Tosoh的TSK GPC柱GMPWXL进行。上述三项检测分析所用检测仪是折射率检测器(Waters公司)、微差粘度测量检测器(differential viscometer detector)、光散射检测器(Viscotek model T60)。同时使用上述三种检测器，收集检测结果资料，并以TriSEC软件处理检测资料。
表一是显示本试验中每一种脱乙酰壳多糖的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、多分布指数(polydispersity index，Mw/Mn)、断面回转半径(radius ofgyration，Rgw)、重量平均特性粘度(intrinsic viscosity，[η]w)、脱乙酰化程度(DD)。
未预料到，HeLa细胞及MCF-7细胞对真菌脱乙酰壳多糖A和B敏感，而对蟹壳脱乙酰壳多糖(I至IV)则并未表现出敏感的效果。如表二所示，真菌脱乙酰壳多糖A及B能够选择性地抑制肿瘤细胞的生长，且其抑制率在30％以上。另一方面，真菌脱乙酰壳多糖A及B并不显著抑制人类胚胎肺细胞(MRC-5)或其它癌细胞系的生长，例如：人类胃癌细胞系(AGS)及人类肝癌细胞系(Hep G2)。
表1用以进行抗癌活性试验的脱乙酰壳多糖的分子特性及脱乙酰化程度
脱乙酰壳多糖 Mw×10-3 Mn×10-3 Mw/Mn Rgw [η]w DD(％)
(g/mol) (g/mol) (nm) (ml/g)
真菌脱乙酰壳多糖A 116.5 58.0 2.01 18.0 1.70 90.1
真菌脱乙酰壳多糖B 94.4 89.4 1.06 11.0 0.44 87.0
蟹壳脱乙酰壳多糖I 317.2 286.3 1.12 41.1 6.40 79.7
蟹壳脱乙酰壳多糖II 163.5 115.3 1.42 28.9 4.66 83.5
蟹壳脱乙酰壳多糖III 140.7 80.5 1.75 24.7 3.56 78.1
蟹壳脱乙酰壳多糖IV 88.5 48.6 1.83 17.1 1.90 78.5
表2各种脱乙酰壳多糖对于HeLa细胞和MCF-7细胞生长的影响
细胞生长百分比(均值±S.D.)a，b
样品 n＝ HeLa细胞 MCF-7细胞
对照组(不含脱乙酰壳多糖) 6 100±4 100±5
真菌脱乙酰壳多糖A 6 65±3 57±6
真菌脱乙酰壳多糖B 6 69±2 69±4
蟹壳脱乙酰壳多糖I 4 98±11 96±3
蟹壳脱乙酰壳多糖II 4 95±7 98±7
蟹壳脱乙酰壳多糖III 4 94±9 92±6
蟹壳脱乙酰壳多糖IV 4 99±5 98±3
a.该值表示平均细胞生长率(％)，其为4或6个重复试验值的均值及其标准差。
b.平均细胞生长率＝(经脱乙酰壳多糖处理的细胞数)/(对照组细胞数)×100％。
其它实施例
本发明说明书中所述本发明任何特征能够以任何方式进行组合。本发明说明书中所述本发明任何特征可以另一具有类似、相同或相等当的手段替换完成。因此，除非特别述明，否则所公开的任何技术特征仅为诸多相类似或相等当技术手段的例示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，本领域任何技术人员，在不脱离本发明精神和范围内，当可做些许更动与润饰，也在本发明的保护范围内，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定为准。