《牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用.pdf（18页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104095844A43申请公布日20141015CN104095844A21申请号201410367239222申请日20140730A61K31/365200601A61P1/1620060171申请人重庆理工大学地址400054重庆市巴南区红光大道69号72发明人李傲王锐郑一敏张晓珣王俊张洪志74专利代理机构重庆志合专利事务所50210代理人胡荣珲54发明名称牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用57摘要本发明涉及一种牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用，本发明采用牛蒡子苷元，低剂量时将活化的HSC细胞阻滞于G0/G1期，抑制活化的HSC增殖；较高。
2、剂量时诱导活化的HSC发生凋亡，通过多种机制减少活化型HSC数量，从而逆转肝纤维化和轻度肝硬化。本发明克服现有技术治疗肝纤维化和轻度肝硬化的中药制剂制剂的稳定性和可控性较差，临床疗效不好，价格较高等问题，牛蒡子苷元用于治疗肝纤维化或肝硬化具有安全、有效、可控性较好的优点，因此可用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物。51INTCL权利要求书1页说明书12页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图4页10申请公布号CN104095844ACN104095844A1/1页21牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的用途。2根据权利要求1所述的应用，其特。
3、征在于所述肝纤维化是因化学因素或感染所致。3根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肝硬化为肝硬化失代偿早期。4根据权利要求13任一所述的用途，其特征在于牛蒡子苷元制备的药物以口服剂型给药。5根据权利要求4所述的用途，其特征在于牛蒡子苷元制备的药物用药量为012MG/KGD。6根据权利要求5所述的用途，其特征在于牛蒡子苷元制备的药物用药量为01505MG/KGD。权利要求书CN104095844A1/12页3牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用技术领域0001本发明涉及一种牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的应用。背景技术0002肝纤维化、肝硬化是一种或多种病因长期或反复作。
4、用引起的慢性、进行性、弥漫性肝脏损害疾病。肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化，甚至向肝癌发展所必经的中间环节。不同原因炎症、病毒感染、血吸虫、酒精、中毒、代谢障碍、胆汁淤积、循环障碍、工业毒物或药物均可造成肝细胞慢性损伤，并激活肝内枯否细胞分泌多种细胞因子，随同血小板、肝血窦内皮细胞和肝细胞等分泌的细胞因子，共同激活肝星状细胞HEPATICSTELLATECELL,HSC。作为产生胶原纤维和其他非胶原纤维基质蛋白的主要来源，当肝脏损伤使HSC活化后，活化的HSC大量增殖，合成分泌大量的细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX,ECM，并且使组织金属蛋白酶抑制物TISSUEINHIBITOR。
5、SOFMETALLOPROTEINASES,TIMPS表达增高，胶原酶的活性降低，造成胶原降解障碍，ECM大量沉积，导致肝纤维化的形成和发展。若进一步引起肝小叶改建，假小叶和结节形成，则致肝硬化。0003多年以来，人们一直认为肝纤维化和肝硬化无法逆转，而肝脏移植手术成为治疗的唯一手段。近年来大量研究表明，肝纤维化，甚至肝硬化都是可以逆转的，而逆转的关键，在于减少活化HSC的数量。肝脏中活化的HSC数量是由HSC增殖和凋亡共同决定的，从理论上讲，减少活化HSC数量有数条途径1抑制HSC增殖；2诱导HSC凋亡，直接减少HSC数量；3逆转HSC的激活，让HSC由活化型变回静止型等，但FRIEDMAN。
6、S的研究表明，HSC活化后很难将其由活化逆转为静息状态，而通过抑制活化的HSC增殖，诱导HSC凋亡，减少活化型HSC数量的治疗方式，不仅减少了胶原合成的来源，同时也减少了TIMPS的分泌来源，降低对金属蛋白酶的抑制作用，促进ECM的降解，有利于肝纤维化和轻度肝硬化的逆转。0004针对肝纤维化治疗，过去主要集中在糖皮质激素、秋水仙碱、干扰素等，这些药物都有不同程度的抗肝纤维化作用，但因毒副作用较大，或因疗效不理想，临床应用受到限制。我国很早就有着利用传统中医药治疗肝纤维化的记载，目前常见治疗肝纤维化和轻度肝硬化的中药制剂常为复方制剂，如小柴胡汤、丹芪和肝冲剂复方861、复方鳖甲软肝片、扶正化瘀胶。
7、囊等，以活血祛瘀、益气养阴为主要功效，但它们都存在有来源药材复杂，有效成分不清楚，制剂稳定性和可控性较差，临床疗效不够理想，价格较高等普遍性问题，所以真正经过国家药品监管机构批准上市抗肝纤维化的中药并不多。0005牛蒡子来源于菊科两年生草本植物牛蒡子属牛蒡ARCTIUMLAPPAL的干燥成熟果实，为常用中药，有疏风散热、解毒透疹、利咽消肿等功效,其分子式C21H24O6，分子量为37241，结构式为0006说明书CN104095844A2/12页40007现代药理学研究表明牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等广泛的药理活性，其主要活性成分为牛蒡子苷元ARCTIGENIN,ATG，广大学者对牛蒡子的。
8、研究日益得到关注，在国内，有学者开展了牛蒡子苷元用于治疗肝癌以及自身免疫性肝炎方面的研究，结果发现，牛蒡子苷元可明显抑制肝癌细胞SMMC7721增殖并诱导其凋亡，而SMMC7721病理诊断为肝细胞性肝癌，这种由肝细胞发生的肝癌是原发性肝癌中最常见的组织学类型，但这种类型常不伴有肝硬化的发生；此外，原发性肝癌的病因尚不清楚，流行病学调查认为，慢性病毒性肝炎、黄曲霉素污染、藻类毒素及污染水源、接触化学物质与应用药物以及遗传等多种因素均与肝癌的发生有关，其中又以病毒性肝炎作为原发性肝癌诸多致病因素中的主要病因。0008在关于牛蒡子苷元用于治疗自身免疫性肝炎以及抗乙型和丙型病毒性肝炎病毒的研究中，也仅。
9、涉及牛蒡子苷元对免疫性肝炎大鼠的血清转氨酶含量和肝脏指数有降低作用，但没有牛蒡子苷元可以直接逆转肝脏纤维化进程的内容记载。0009引发肝纤维化有多种因素，除免疫性因素和病毒感染因素外，几乎所有的慢性肝病，如铜铁代谢障碍、慢性血吸虫病、慢性酒精中毒、药物或毒物损伤、血色素沉着症、原发性和继发性胆汁性肝硬化、肝脏血液循环障碍、非酒精性脂肪性肝炎最终均可引起肝纤维化。虽然目前最有效的肝纤维化治疗措施，仍是积极地根除或控制慢性肝病的始发因素，如抗肝炎病毒治疗，血吸虫病治疗、戒酒、祛铁和祛铜等对因治疗，但由于有的病人还同时兼具几种以上的病因，如乙型肝炎和酒精、血吸虫病合并乙型肝炎，由此产生的对因治疗就显。
10、得非常棘手和复杂。同时，慢性肝病往往在诊疗初期，肝脏内已有纤维化的形成，因此同期开展的药物治疗往往需要针对纤维化本身进行。现有的研究已证实，肝脏中的HSC激活是纤维化发生的核心，抑制HSC增殖和诱导HSC凋亡，已经被提议作为预防和治疗肝纤维化时消除活化型HSC的对策。因此，理想的抗肝纤维化药物，可不依赖于清除复杂的肝纤维化发病原因，而直接以活化的HSC为靶点，通过减少活化型HSC数量的方式对抗纤维化。0010关于牛蒡子苷元抗肝纤维化、轻度肝硬化的疗效评定和作用机制至今未见报道。发明内容0011本发明目的在于克服现有技术治疗肝纤维化和轻度肝硬化的中药制剂制剂的稳定性和可控性较差，临床疗效不好，价。
11、格较高等问题，研制一种安全、有效、可控性较好的治疗肝纤维化或肝硬化药物，因此可用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物。0012本发明的技术方案是0013牛蒡子苷元在制备治疗肝纤维化或肝硬化药物中的用途。说明书CN104095844A3/12页50014所述肝纤维化是因化学因素或感染所致。0015所述肝硬化为肝硬化失代偿早期。0016牛蒡子苷元制备的药物用药量为012MG/KGD。0017牛蒡子苷元制备的药物用药量较好的技术方案是01505MG/KGD。0018本发明所述药物由牛蒡子苷元和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物，以口服的方式给予需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其以药学常规方法制。
12、备成常规的固体制剂，所制成的制剂可以是片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、丸剂、分散片、颗粒剂、混悬剂、溶液剂、崩解剂、泡腾剂、冲剂、滴丸、咀嚼片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊等。除了牛蒡子苷元作为治疗成分外，该口服剂型可以含有一种或多种药理非活性的常规载体介质。例如加入淀粉、糊精、糖粉、乳糖等填充剂；水、淀粉浆、阿拉伯胶、明胶浆、甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙二醇、硅酸镁铝等粘合剂；干燥淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等崩解剂；硬脂酸镁、高熔点蜡、氢化植物油等润滑剂。0019以上组成可在生产时作相应比例的缩小或扩大，如规模大生产可以以公斤或吨作为单位，小规模生产可以以克作为单位。0020申请人通过。
13、实验验证，牛蒡子苷元能明显抑制造模大鼠体重的减轻，恢复受损肝细胞功能，降低肝组织中胶原蛋白和血清中纤维化标志物的含量，并能改善肝组织病理变化，提示其能有效抑制化学损伤引起的肝纤维化。考虑到肝纤维化可由感染细菌、病毒、寄生虫等或化学因素引起，但其病理特点基本一致，所以在动物实验时考察药物对肝纤维化治疗效果时，常常选用化学性损伤模型作为感染或化学因素导致肝纤维化的代表模型。0021进一步细胞体外研究结果还发现，在低剂量01252M时，牛蒡子苷元通过将活化的HSC细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制活化的HSC增殖；在较高剂量14M时，牛蒡子苷元还可以诱导活化的HSC发生凋亡，通过多种机制减少活化型HS。
14、C数量，逆转肝纤维化和轻度肝硬化。0022此外，通过反映肝功能的血液生化指标和病理组织学检查结果进行判断，当连续给予大鼠高剂量的牛蒡子苷元4周后，未发现有明显的肝损伤；同时，体外细胞毒实验结果也证实，当给予4倍治疗剂量后，仍未发现牛蒡子苷元对人肝细胞有明显的毒性，以上结果均提示，与其他抗肝纤维化药物相比，本发明药物具有相对安全的优点。0023本发明药物在使用时可根据病人的情况调整用量，例如，患者的肝损伤程度、发病时间、年龄、并发症等，根据实验例结果，申请人推荐对于成年人，作为口服时的临床剂量为012MG/KGD，更优选01505MG/KGD。0024以下通过实验例来进一步阐述本发明药物的有益效。
15、果，但是本发明不限于这些具体实施例。附图说明0025图1为牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理组织学影响HE染色，200；图中，A溶剂对照组；B单给牛蒡子苷元组3MG/KG；C模型对照组；D牛蒡子苷元低剂量组1MG/KG；E牛蒡子苷元高剂量组3MG/KG；F秋水仙碱01MG/KG阳性对照组；说明书CN104095844A4/12页60026图2为牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理组织学影响MASSONSTRICHROME染色，200；图中，A溶剂对照组；B单给牛蒡子苷元组3MG/KG；C模型对照组；D牛蒡子苷元低剂量组1MG/KG；E牛蒡子苷元高剂量组3MG/KG；F秋水。
16、仙碱01MG/KG阳性对照组；0027图3为BRDUELISA法检测牛蒡子苷元对人肝星状细胞增殖的影响分别处理12H,24H和48H；0028图4为牛蒡子苷元对活化的人肝星状细胞周期的影响，图中A流式细胞术检测牛蒡子苷元对人肝星状细胞周期影响的典型谱图，分别为DMSO24H,48H组、PDGFBBDMSO24H,48H组和PDGFBB05M牛蒡子苷元24H,48H组。B各处理组细胞位于G0/G1期、S期和G2/M的比例；0029图5为通过ANNEXINV/PI双染法，流式细胞术检测牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡典型谱图，分别为DMSO12H,24H,48H组、PDGFBBDMSO12H,。
17、24H,48H处理组和PDGFBB2M牛蒡子苷元12H,24H,48H处理组；0030图6为1琼脂糖凝胶电泳，检测牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡后的DNA片段，其中，道1，DNAMARKER；道2，DMSO处理48H；道35，PDGFBBDMSO分别处理12H,24H和48H；道68，PDGFBB2M牛蒡子苷元分别处理12H,24H和48H；0031图7为牛蒡子苷元对正常人肝细胞LDH释放的测定。具体实施方式0032实施例1牛蒡子苷元对实验性肝脏纤维化大鼠模型的治疗作用00331实验材料及仪器003411主要试剂及药物0035四氯化碳化学纯，成都市科龙化工试剂厂，批号为20120220；。
18、苯巴比妥上海信谊药厂有限公司，批号为130602；秋水仙碱COLCHICINE，COL购自SIGMA公司，货号为C3915；型前胶原氨基末端肽PC，批准文号为国药准字S20093002、透明质酸HA，批准文号为国药准字S20083010和层黏连蛋白LN，批准文号为国药准字S20080004放射免疫分析药盒，由北京北方生物技术研究所提供；谷丙转氨酶ALT，批号为20140410、谷草转氨酶AST，批号为20140406、白蛋白ALB，批号为20140407、总胆红素TBIL，批号为20140405和羟脯氨酸HYP，批号20140408测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供；本发明中牛蒡子苷元根。
19、据中国专利申请号2010100176797记载的方法制备，购自南京泽朗医药科技有限公司，批号为20130710，使用前经质谱和核磁共振波谱解析，确证其结构；并利用氢谱和高效液相色谱法检测纯度99，以DMSO溶解并稀释至相应浓度。003612主要仪器00375810高速冷冻离心机，德国EPPENDORF公司产品；MULTISKANGO型全波长酶标仪，美国THERMO公司产品；GC1500型放射免疫记数仪，科大创新股份有限公司中佳分公司产品。003813实验动物0039雄性SD大鼠，SPF级，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，合格证号SCXK渝20120005，初始体重2002。
20、0G。说明书CN104095844A5/12页700402实验方法004121肝纤维化模型制备、分组及给药0042大鼠72只，随机均分为6组，分别为溶剂对照组、单用牛蒡子苷元高剂量组3MG/KG、模型对照组、牛蒡子苷元低剂量组1MG/KG、牛蒡子苷元高剂量组3MG/KG、阳性对照组秋水仙碱，01MG/KG。大鼠在造模第1周饮用003苯巴比妥苯巴比妥30MG，溶于100ML水中以诱导混合功能氧化酶活性，增加CCL4代谢产物的产生，提高造模成功率并缩短造模周期。除溶剂对照组和单用牛蒡子苷元高剂量组按公斤体重皮下注射等量花生油外，其他组首次皮下注射40四氯化碳花生油混合液，5ML/KG体重，以后每次。
21、注射2ML/KG体重，2次/周，连续注射8周诱导出肝纤维化模型。自造模第5周起，按L0ML/KG体积分别灌胃给予不同剂量的药物，每天1次，连续4周，溶剂对照组和模型对照组灌胃给予等体积的药物溶媒5DMSO。004322标本制备0044实验动物于第8周末次给药1H后，大鼠在麻醉下股动脉放血处死，称量大鼠体重和肝、脾湿重。高速离心机室温下3000转/分，离心15MIN分离血清；按试剂盒说明测量血清中肝功能指标活性ALT、AST、ALB和TBIL。按试剂盒说明放射性免疫法检测血清肝纤维化指标型前胶原氨基末端肽PC、透明质酸HA和层黏连蛋白LN。同时，准确称取01G肝左叶组织，按试剂盒说明碱水解法检测。
22、羟脯氨酸HYP含量；肝左叶经4多聚甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋、切片，苏木素伊红HE染色观察肝组织炎症、细胞变性和纤维化情况，MASSONSTRICHROME染色法观察肝组织胶原纤维增生情况。004523统计学方法0046定量实验结果以均数方差表示。采用SPSSVERSION190STATISTICALSOFTWARECHICAGO,IL,USA，采用单因素方差分析比较各组间差异。当差异显著时P005，组间两两比较采用TUKEYPOSTHOC法，当P005，认为差异有统计学意义；等级资料在比较各组间差异时，采用KRUSKALWALLISH检验，当差异显著时P005，组间两两比较采用MANNW。
23、HITNEYU检验，当P005，认为差异有统计学意义。00473实验结果004831牛蒡子苷元对肝纤维化模型大鼠体重和肝脾脏指数的影响0049与溶剂对照组比较，模型组大鼠的肝、脾指数均显著升高P005；而单独给予高剂量牛蒡子苷元3MG/KG，与溶剂组比较，差异无显著性意义P005；与模型组比较，牛蒡子苷元低剂量1MG/KG和高剂量3MG/KG能显著提高四氯化碳损伤后所降低的体重，同时明显降低大鼠肝、脾指数P005；秋水仙碱组01MG/KG大鼠肝、脾指数与模型组比较，也显著降低P005，而其体重与模型组比较，差异无显著性意义P005，结果见表1。0050表1牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠。
24、体重和肝脾指数的影响均数标准差，N80051说明书CN104095844A6/12页80052与溶剂对照组比较，P005；与模型对照组比较,P005005332牛蒡子苷元对肝纤维化模型大鼠血清肝功能指标的影响0054与溶剂对照组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平显著升高，ALB浓度显著降低P005，显示模型组有严重的肝细胞损伤；而单独给予高剂量牛蒡子苷元3MG/KG，与溶剂对照组比较，差异无显著意义P005；与模型组比较，牛蒡子苷元低剂量1MG/KG和高剂量3MG/KG能显著降低血清中ALT、AST和TBIL水平，升高ALB浓度P005，提示牛蒡子苷元对纤维化大鼠肝脏损伤有保护。
25、作用；而秋水仙碱组01MG/KG血清中AST和TBIL含量也明显降低P005，而血清中ALT水平与模型组比较，差异无显著性意义，结果见表2。0055表2牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清中肝功能指标的影响均数标准差，N8005600570058与溶剂对照组比较，P005；与模型对照组比较,P005005933牛蒡子苷元对肝纤维化模型大鼠肝脏病理组织学的影响0060HE染色结果见图1，可见溶剂对照组和单独给予牛蒡子苷元高剂量组3MG/KG大说明书CN104095844A7/12页9鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周整齐排列。模型组可见肝细胞脂肪变性、坏死；大量的纤维组织向肝小叶内。
26、伸展，并与邻近汇管区及肝静脉相连，纤维间隔较厚，分割包绕肝实质，形成大小不一的假小叶。牛蒡子苷元低剂量1MG/KG、高剂量3MG/KG和秋水仙碱01MG/KG均能明显减轻四氯化碳所致的慢性肝纤维化程度，对炎细胞浸润、胶原纤维的增生，肝小叶的破坏和假小叶的形成也有明显的抑制作用。0061MASSONSTRICHROME染色结果见图2，溶剂对照组和单独给予牛蒡子苷元高剂量3MG/KG大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，仅在汇管区与中央静脉区血管壁附着蓝色，无明显胶原增生。模型组大鼠肝小叶结构被破坏，肝组织汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，有大量假小叶形成，分割包绕肝实质。牛蒡子苷元低剂量1。
27、MG/KG、高剂量3MG/KG和秋水仙碱01MG/KG能不同程度地减少炎症细胞的浸润，汇管区、小叶内、小叶间胶原纤维间隔减少、变细，仅纤维间隔内可见脂肪空泡形成，部分较细的蓝色纤维走行于血管周围，无假小叶形成。0062根据纤维化程度将病变分为级0级，正常肝组织；级，胶原纤维从中央静脉或汇管区向外延伸；级，胶原纤维延伸明显，纤维间隔开始形成；级，胶原纤维不全分隔包绕肝小叶；级，胶原纤维包绕分隔肝小叶，以大方形假小叶为主；级，肝小叶结构完全被破坏，假小叶形成大方形假小叶及小圆形假小叶各占50；级，肝内布满小圆形假小叶，假小叶内有粗大增生的胶原纤维。根据肝纤维增生程度，溶剂对照组和单独给予牛蒡子苷元。
28、高剂量组3MG/KG中分别8只大鼠肝脏无纤维增生，模型对照组8只大鼠中1只为肝纤维化级，7只为中度级至重度肝硬化级，牛蒡子苷元低剂量1MG/KG和高剂量3MG/KG分别8只大鼠，秋水仙碱01MG/KG组6只大鼠肝脏内轻度纤维增生级，各组的肝脏纤维化分级结果见表3。0063表3牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏纤维化程度的影响00640065与溶剂对照组比较，P005；与模型对照组比较,P005006634牛蒡子苷元对肝纤维化模型大鼠血清标志物和肝组织中羟脯氨酸HYP含量的影响0067与溶剂对照组比较，模型组大鼠血清中HA，LN，PC水平以及肝组织中HYP含量说明书CN104095844。
29、A8/12页10明显升高P005，说明纤维化模型成功建立；单独给予高剂量牛蒡子苷元3MG/KG后，大鼠血清中HA，LN，PC水平和肝组织中HYP含量，与溶剂对照组比较，差异无显著意义P005；与模型组比较，牛蒡子苷元低剂量1MG/KG和高剂量3MG/KG能显著降低大鼠血清中HA，LN，PC水平和肝组织中HYP含量P005，而秋水仙碱组01MG/KG血清中纤维化标志物水平和肝组织中HYP含量也明显降低P005，提示牛蒡子苷元和秋水仙碱具有抗肝纤维化作用，结果见表4。0068表4牛蒡子苷元对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清标志物和肝组织HYP含量的影响均数标准差，N80069组别LNG/LPCG/L。
30、HAG/LHYPG/G肝组织溶剂对照组72663805429507214173866146202842单给ATG组773112155408725177293408154102470模型对照组1027510879162646536884685382626919ATG低剂量组88677097500563427203824262573670ATG高剂量组87453526679583383694261241533883COL阳性对照组836161948054114038545182533563330070与溶剂对照组比较，P005；与模型对照组比较,P0050071实施例2BRDUELISA法检测牛蒡。
31、子苷元对活化肝星状细胞的增殖抑制作用00721实验材料及仪器0073DMEM培养基为HYCLONE公司产品，胎牛血清为GIBCO公司产品，基于BRDU的细胞增殖ELISA试剂盒来自商业化试剂盒德国ROCHE公司，牛蒡子苷元的来源同实验例1，MULTISKANGO型全波长酶标仪，美国THERMO公司产品；3541型恒温CO2培养箱，美国THERMO公司产品。00742实验方法007521细胞培养0076人肝星状细胞LX2细胞株引自中国典型培养物保藏中心，LX2细胞株为正常人肝脏分离出肝星状细胞，经过转染SV40T基因后，在低血清长期培养筛选后建立的永生细胞株，用DMEM培养基含10灭活胎牛血清，。
32、100U/ML青霉素和100G/ML链霉素于37，含5CO2的培养箱内常规传代培养。007722药物处理及细胞增殖能力检测0078取对数生长期的LX2细胞，按照5103个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔200L，细胞培养过夜后，以无血清的DMEM同步化培养24H，此后，分组换液，分别加入终浓度50NG/ML的重组人血小板源性生长因子BBPDGFBB，PEPROTECH公司和不同浓度的牛蒡子苷元0125,025,05,1,2M，同时设溶剂对照组05DMSO,每组设说明书CN104095844A109/12页113个复孔，背景对照组只加入等量的培养液，不加入细胞，培养12H,24H和4。
33、8H。在终止培养前4H每孔加入终浓度10MBRDU溶液，在细胞培养箱中继续孵育4H后离心弃去上清液，每孔加入FIXDENAT溶液以固定DNA并暴露BRDU表位，30MIN后加入辣根过氧化物酶标记的BRDU抗体。孵育90MIN后去掉抗体溶液，并加入底物溶液显色反应30MIN，在酶标仪上用370NM参比波长492NM测定吸光度值，结果以3个复孔吸光度A值的均值表示，并计算细胞增殖抑制率抑制率IRPDGF诱导组A均值给药组细胞A均值/PDGF诱导组A均值背景组A均值100，并通过SPSS190软件计算各给药组在12,24和48H的半数抑制浓度IC50及95可信限范围007923统计学方法0080同实。
34、验例100813实验结果0082采用BRDU掺入的ELISA法，以01252M浓度的牛蒡子苷元分别处理经PDGFBB活化的HSCS，药物处理时间分别为12H，24H和48H，结果表明，牛蒡子苷元对活化HSCS增殖有明显的抑制作用，并呈浓度和时间依赖关系。通过PROBIT回归分析，获得牛蒡子苷元抑制细胞增殖的的IC50值分别为0291M24H；95可信限范围CL02190386M，和0253M48H；95可信范围CL01160553M，而牛蒡子苷元处理12H后的IC50未能检出，结果见图3。0083将数据进行转换后以细胞增殖抑制率IR表示。所有实验均平行重复操作6次，并利用SPSS190软件，对。
35、药物处理不同时间的IC50值及95可信限范围进行计算和估计。0084实施例3流式细胞术检测牛蒡子苷元对活化肝星状细胞周期的影响00851实验材料及仪器0086DMEM培养基为HYCLONE公司产品；胎牛血清为GIBCO公司产品；碘化丙啶PI为SIGMA公司产品；RNASEAROCHE公司；牛蒡子苷元的来源同实验例1；FACSCALIBUR型流式细胞仪，美国BD公司产品。00872实验方法008821细胞培养0089人肝星状细胞LX2细胞株的培养同实验例2。009022药物处理及细胞周期检测0091取对数生长期的LX2细胞，在6孔培养板以5104个细胞/孔进行接种，每孔2ML。细胞培养过夜，在无。
36、血清DMEM培养基中饥饿同步化24H以后，分组换液，分别加入终浓度50NG/ML的PDGFBB和05M的牛蒡子苷元，同时设溶剂对照组05DMSO，继续作用24H和48H后收集细胞。收集细胞时，将培养瓶中的细胞用细胞刮刮下后，转移至离心管，1000转/分离心5MIN，细胞沉淀，用PBS液洗细胞两次，2ML的预冷保存于4的70冰乙醇固定细胞，固定细胞时逐滴加入冰乙醇，并不断振荡确保细胞悬浮均匀不成团块，于4固定过夜，离心沉淀，弃上清，加入含100G/MLRNA酶A和50G/ML碘化丙啶的PBS重悬细胞，充分混匀，4静置30MIN，采用FACSCALIBUR流式细胞分析仪进行细胞周期分析。每个样品细。
37、胞取样数为1104个，并通过CELLQUEST软件分析不同时期的细胞数量占细胞总量的比例。说明书CN104095844A1110/12页12009223统计学方法0093同实验例1。00943实验结果0095为观察牛蒡子苷元引起的人肝星状细胞增殖抑制作用，是否与其引起特定细胞周期阻滞作用有关，流式细胞术结果表明，在溶剂对照组中，分别有87324H和86848H的细胞分布于G0/G1期，6024H和6648H的细胞分布于S期；经过PDGFBB刺激活化24H和48H后，肝星状细胞在S期的百分比例分别提高到226和323，同时G0/G1期的百分比例下降到730和605，提示PDGFBB诱导后，DNA。
38、合成活跃的增殖细胞数量明显增加；而经牛蒡子苷元处理后，位于S期的细胞数目明显减少到10524H和16148H，而相应G0/G1期细胞所占比例相应增加到83624H和80848H，这些结果显示牛蒡子苷元可将活化的人肝星状细胞阻滞于G0/G1期，结果见图4。所有实验均平行操作3次。与溶剂对照组比较，P005；与PDGFBB溶剂处理组比较，P005。0096实施例4牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡作用00971实验材料及仪器0098DMEM培养基为HYCLONE公司产品；胎牛血清为GIBCO公司产品；ANNEXINFITC/PI试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品；DNALADDER抽提试剂。
39、盒离心柱式为碧云天生物技术研究所产品；DNAMARKER为上海近岸科技有限公司产品；CHEMIDOCXRS凝胶成像系统，美国BIORAD公司；FACSCALIBUR型流式细胞仪，美国BD公司产品。00992实验方法010021细胞培养0101人肝星状细胞LX2细胞株的培养同实验例2。010222药物处理及ANNEXINV/PI双染法检测细胞凋亡情况0103取对数生长期的LX2细胞，在6孔培养板以1105个细胞/孔进行接种，每孔2ML。细胞培养过夜，在无血清DMEM培养基中饥饿同步化24H以后，分组换液，分别加入终浓度50NG/ML的PDGFBB和2M的牛蒡子苷元，同时设溶剂对照组05DMSO，。
40、继续作用12H，24H和48H后，将细胞在42000转/分离心5MIN，弃上清，用预冷的PBS再洗涤1次。加入500L的BINDINGBUFFER悬浮细胞；加入5LANNEXINVFITC混匀后，加入5LPROPIDIUMIODIDEPI，混匀，室温下避光反应15MIN；在激发波长488NM，发射波长530NM下用流式细胞仪检测。ANNEXINVFITC的绿色荧光通过FITC通道FL1检测，PI红色荧光通过PI通道FL2检测。010423DNA电泳检测细胞凋亡梯状带0105药物分组及处理方式同上，在处理结束后，将细胞在42000转/分离心5MIN，弃上清，用预冷的PBS再洗涤1次。加入4LRN。
41、A酶A500U/ML，室温放置5MIN，加入20L蛋白酶K20MG/ML，混匀后加入200L样品裂解液，70孵育10MIN；加入200L无水乙醇，混匀后加入DNA纯化柱内，分别加入500L洗涤液、600L洗涤离心，50L洗脱液12000转/分离心获得纯化的DNA，加入DNA上样缓冲液，用1琼脂糖凝胶，40V恒压电泳；EB染色，凝胶成像仪进行检测。010624统计学方法0107同实验例1说明书CN104095844A1211/12页1301083实验结果010931牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡ANNEXINV/PI双染法0110磷脂酰丝氨酸在活细胞中位于细胞膜内侧，在发生细胞凋亡的的早期。
42、阶段，磷脂酰丝氨酸会翻转到外侧，以荧光素FITC标记的膜联蛋白ANNEXIN就可以与磷脂酰丝氨酸结合，但因为细胞膜仍保持完整，所以不能被PI染色。晚期凋亡和坏死细胞因磷脂酰丝氨酸外翻和膜通透性改变，可以被ANNEXIN和PI标记。所以在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示正常细胞，为ANNEXINPI；右上象限显示晚期凋亡细胞和坏死细胞，为ANNEXINPI；而右下象限显示早期凋亡细胞，为ANNEXINPI。流式细胞术结果表明，溶剂对照组在培养12H，24H和48H后，早期细胞凋亡率分别为86，93和90，经过PDGFBB刺激活化后，早期细胞凋亡率明显下降，分别为60，72和57P005；。
43、同时，经过PDGFBB刺激人肝星状细胞24H和48H后，细胞晚期凋亡和坏死率分别为74和125，较溶剂对照组的129和186显著下降P005，提示PDGFBB具有抗人肝星状细胞凋亡作用。经过2M牛蒡子苷元分别处理24H和48H后，人肝星状细胞早期凋亡率显著上升至169和185，与PDGFBB刺激活化组的72和57相比，差异显著P005；同时，细胞晚期凋亡和坏死率也由74和125显著上升至265和395P005，提示牛蒡子苷元具有明显诱导活化的肝星状细胞发生凋亡的能力，结果见图5和表5。0111表5ANNEXINV/PI双染法检测牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡情况均数标准差，N301120。
44、113与溶剂对照组比较，P005；与PDGFBB溶剂处理组比较，P005011432牛蒡子苷元诱导活化的人肝星状细胞凋亡DNA电泳法0115细胞凋亡最突出的生化特征是由于凋亡细胞核酸内切酶的活化，使染色质核小体之间的连接处断裂，裂解成长度为180200BP及其倍数的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现梯状电泳图谱。与31的流式细胞术结果一致，通过DNA水平电泳结果发现，正常人肝星状细胞在溶剂处理48H后，仅在下端出现少量DNA片段降解后的梯带，提示此时有少量细胞出现凋亡；通过PDGFBB激活处理12H，24H和48H，均未发现DNA凋亡梯状带；被PDGFBB活化的肝星状细胞，在经过2M牛蒡子苷元。
45、处理24H和48H后，可以观察得到典型的DNA梯状条带，提示牛蒡子苷元具有诱导活化的肝星状细胞凋亡的能力，结果见图6。0116实施例5牛蒡子苷元对正常人肝细胞的毒性检测01171实验材料及仪器0118RPMI1640培养基为HYCLONE公司产品；胎牛血清为GIBCO公司产品；乳酸脱氢酶说明书CN104095844A1312/12页14LACTATEDEHYDROGENASE，LDH细胞毒性检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品；牛蒡子苷元的来源同实验例1，MULTISKANGO型全波长酶标仪，美国THERMO公司产品；3541型恒温CO2培养箱，美国THERMO公司产品。01192实验方法01。
46、2021细胞培养0121正常人肝脏细胞L02细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用RPMI1640培养基含10灭活胎牛血清，100U/ML青霉素和100G/ML链霉素于37，含5CO2的培养箱内常规传代培养。012222药物处理及LDH酶活性检测0123细胞在96孔培养板中以密度为5103个/孔进行接种，并用含有10FBS的RPMI1640培养基培养过夜，在无血清RPMI1640培养基中饥饿同步化24H以后，分组换液，分别加入0125M,05M,2M,8M和16M的牛蒡子苷元，同时设溶剂对照组05DMSO，继续作用48H后，收集各孔的上清液120L，加入到一新的96孔板相应孔中。
47、，随即进行样品测定。各孔分别加入60LLDH检测工作液，混匀，室温避光孵育30MIN，然后在490NM处测定吸光度。通过一系列LDH标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线相应公式计算出样品中LDH的酶活性。01243实验结果0125肝细胞损伤往往被认为是发生肝脏纤维化的诱发因子，因此，药物可以通过保护肝细胞的方式来阻止肝脏纤维化进程，至少其本身应没有肝细胞毒性。细胞凋亡或坏死后，常造成细胞膜结构的破坏，导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养基中的LDH活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。在本部分研究中，经过不同浓。
48、度牛蒡子苷元处理后，测定对正常人肝细胞中LDH释放活力的影响，从而评价其细胞毒性。0126培养人肝细胞L02细胞株，分别加入025M、05M、2M、8M和16M的牛蒡子苷元，以及溶剂DMSO培养48H后，通过分光光度法检测LDH酶促底物产生的吸光度，并通过标准曲线计算各组培养基上清中LDH活性U/L，所有实验均平行操作3次。经过不同浓度的牛蒡子苷元处理肝细胞48H后，甚至在非常高的浓度16M，也没有出现明显的LDH释放增加，这意味着，在低于16M的浓度下，牛蒡子苷元未见明显的肝细胞毒性，结果见图7。说明书CN104095844A141/4页15图1图2说明书附图CN104095844A152/4页16图3说明书附图CN104095844A163/4页17图4说明书附图CN104095844A174/4页18图5图6图7说明书附图CN104095844A18。