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1、10申请公布号CN104189582A43申请公布日20141210CN104189582A21申请号201410440858X22申请日20140901A61K36/899200601A61K8/97200601A23L1/29200601A23L2/38200601A23G3/48200601A61P35/00200601A61P39/06200601A61Q19/0020060171申请人山西大学地址030006山西省太原市小店区坞城路92号72发明人李卓玉史江颖单树花张丽珍李宗伟74专利代理机构山西五维专利事务所有限公司14105代理人张福增54发明名称谷糠内壳结合态多酚及其制备方法和。
2、应用57摘要本发明提供了一种谷糠内壳结合态多酚及其制备方法，以及该多酚在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。其制备方法是将纯天然谷糠内壳粉碎后，称取适量，用预冷80丙酮充分搅拌混匀后将混合物离心，收集残留固体物质用2MOL/LNAOH消化；消化一定时间后用浓盐酸滴定终止消化，使溶液PH为7；随后加入正己烷和乙酸乙酯萃取数次除去脂质；离心收集上清；将上述提取液旋转蒸发至一定体积，再真空冷冻干燥成粉末，即得到谷糠内壳结合态多酚。体外抗肿瘤实验表明，该结合态多酚具有广谱性抗肿瘤活性，为开发研制新型抗癌保健品或药物提供了可能。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页10申请公布号CN104189582ACN104189582A1/1页21一种谷糠内壳结合态多酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤第一步取谷糠内壳，充分粉碎后，加入预冷的丙酮，4下均匀搅拌1030分钟，3,000RPM离心5MIN后去上清液，留残渣；离心后的残渣可重复提取12次；所述的谷糠和丙酮重量体积比G/ML为12530；第二步在收集的残渣中加入NAOH2MOL/L溶液消化，在室温下充分搅拌至少1小时，再在混合物料中加入HCL使溶液PH为7，终止消化；所述的谷糠残渣和NAOH溶液重量体积比G/ML为1515；第三步终止消化后继续加入与NAO。
4、H溶液等体积的正己烷，搅拌混匀，静置萃取至少10分钟，除去脂质；然后3,500RPM离心5分钟，收集除脂质的清液，收集的清液重复萃取12次；第四步将第三步得到的清液用等体积的乙酸乙酯提取至少10分钟，3,500RPM离心5分钟，除去剩余脂质，收集液体，重复操作35次；第五步将上述提取液在45旋转蒸发至溶剂尽，真空冷冻干燥成粉末即得纯多酚样品，于20保存。2如权利要求1所述的一种谷糠内壳结合态多酚的制备方法，其特征在于，第一步中所述丙酮的浓度为80。3如权利要求1所述的一种谷糠内壳结合态多酚的制备方法，其特征在于，第一步中所述的谷糠和丙酮重量体积比G/ML为125。4如权利要求1所述的一种谷糠内。
5、壳结合态多酚的制备方法，其特征在于，第二步中所述的谷糠残渣和NAOH溶液重量体积比G/ML为110。5如权利要求1、2、3或4所述制备方法制得的谷糠内壳结合态多酚。6如权利要求5所述的谷糠内壳结合态多酚在制备新型抗癌药物中的应用。7如权利要求5所述的谷糠内壳结合态多酚在制备保健品中应用。权利要求书CN104189582A1/3页3谷糠内壳结合态多酚及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及植物多酚的制备和应用，具体属于一种谷糠结合态多酚及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。背景技术0002谷子学名SETARIAITALICA属禾本科的一种植物，去皮后俗称小米。广泛栽培于欧亚大。
6、陆的温带和热带，中国黄河中上游为主要栽培区，其他地区也有少量栽种。谷糠是在谷子经垄谷脱壳，碾米等加工成为精米过程中得到的副产品。谷子变成糙米脱去的第一层壳为谷糠外壳，进一步糙米除去麸皮成为精米，其中麸皮就是谷糠内壳。0003中医经典黄帝内经认为“谷气通于脾”，谷糠昧甘、性平、偏于补气，具有益气健脾、养血安神、补肾健脑的功效，适合于气血不足、脾肾偏亏的失眠患者的食补与治疗之用。目前已有文献表明谷糠中含有大量的营养组分和具有抗氧化活性的生物活性分子，如多酚，多糖以及一些活性蛋白及多肽等。因此，谷糠可以作为一种药食同源的保健食品。0004谷子酚类物质主要以自由态和结合态两种形式存在，其中包括对羟基苯。
7、甲酸和羟基肉桂酸衍生物，此外还有一些黄酮类物质。有研究表明，谷子多酚物质具有抗氧化活性，还有抑菌、消炎、降血脂、降血糖、降胆固醇、增强免疫力和肾保护功能，但尚未看到谷糠多酚抗肿瘤活性研究。本实验以谷糠内壳为材料，提取出一种具有抗肿瘤活性的结合态多酚，该多酚能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。因此，本发明不仅能够应用于抗肿瘤药物和保健品的开发，同时促进谷糠的深度开发和有效利用。发明内容0005本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的谷糠内壳结合态多酚及其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。0006本发明提供的一种谷糠内壳结合态多酚，通过包括如下步骤的方法制得0007第一步取谷糠内壳，。
8、充分粉碎后，加入预冷的丙酮，4下均匀搅拌1030分钟，3,000RPM离心5MIN后去上清液，留残渣；离心后的残渣可重复提取12次；0008所述丙酮的浓度为80；所述的谷糠和丙酮重量体积比G/ML为12530；0009第二步在收集的残渣中加入NAOH2MOL/L溶液消化，在室温下充分搅拌至少1小时，再在混合物料中加入HCL使溶液PH为7，终止消化；0010所述的谷糠残渣和NAOH溶液重量体积比G/ML为1515；0011第三步终止消化后继续加入与NAOH溶液等体积的正己烷，搅拌混匀，静置萃取至少10分钟，除去脂质；然后3,500RPM离心5分钟，收集除脂质之外的液体，收集的清液可重复萃取12次。
9、；0012第四步将第三步得到的清液用等体积的乙酸乙酯提取至少10分钟，3,500RPM离心5分钟，除去剩余脂质，收集液体，重复操作35次；0013第五步将上述提取液在45旋转蒸发至溶剂尽，真空冷冻干燥成粉末即得纯多说明书CN104189582A2/3页4酚样品，命名为BPIS于20保存。0014经体外抗肿瘤活性检测显示，该谷糠多酚可明显抑制多种癌细胞增殖，具有良好的广谱抗癌活性。结果显示用一定浓度该多酚处理人肝癌细胞HEPG2、人宫颈癌细胞HELA、人结肠癌细胞HCT11624小时，平均致死率约为50以上，所以该多酚对人肝癌细胞HEPG2、人结肠癌细胞HCT116和人宫颈癌细胞HELA具有较好。
10、的抑制效果。0015该方法制备的结合态多酚，因其来源于纯天然谷物，加之纯化工艺简单，因此有较大的开发前景和应用价值。如在医药方面，可制备具有抗肿瘤活性的小分子药物；在保健品方面，可制备具有抗肿瘤和抗氧化功能的保健口服液；另外，还可以作为天然食品添加剂应用在糖果、饮料中，还可作为辅料添加在化妆品中。附图说明0016图1谷糠内壳结合态多酚BPIS样品0017图2谷糠内壳结合态多酚BPIS对细胞毒性的影响0018图3癌细胞经谷糠内壳结合态多酚BPIS处理后形态变化图200019图4谷糠内壳结合态多酚BPIS诱导HELA、HEPG2、HCT116细胞凋亡具有剂量依赖性柱形图具体实施方式0020实施例1。
11、0021谷糠内壳结合态多酚BPIS的制备方法，步骤为00221将天然谷子去皮的谷糠内壳烘干，粉碎。00232取谷糠内壳粉末2G，加入预冷的80的20预冷丙酮50ML搅拌10分钟混匀，然后将混合物料3,000RPM、离心5分钟，收集除脂质的液体，4下均匀搅拌，留残渣；离心后的残渣可重复提取12次；00243将2中获得的谷糠残渣中加入20MLNAOH2MOL/L消化，在室温下充分搅拌1小时，再在混合物料中加入HCL，使溶液PH为7，终止消化。00254将3得到的混合液继续加入20ML的己烷，搅拌混匀，静置萃取10分钟除去混合物中的脂质。然后3,500RPM离心5分钟，收集除脂质的清液。将收集的清液。
12、再用正己烷提取一次，收集除脂质的液体。00265将4收集的液体用20ML乙酸乙酯提取10分钟，3,500RPM离心5分钟，除去剩余脂质，收集除脂质液体，重复操作5次。将多酚提取液在45旋转蒸发至10ML，真空冷冻干燥，20保存。0027采用福林酚比色法，以没食子酸为标准品测定谷糠多酚含量。结果发现2G的谷糠内壳粉末中结合态多酚的含量约为5175MG远大于内壳自由态多酚的含量306MG。内壳结合态多酚约占内壳总多酚含量的26，内壳自由态多酚约占内壳总多酚含量的15。谷糠内壳结合态多酚样品如图1所示。0028实施例20029将细胞制成细胞悬液，通过细胞计数，每孔4104个接种到96孔板中，37、5。
13、CO2培养箱培养24小时待细胞贴壁后，弃掉旧得培养基，加入多酚终浓度为03MG/ML的培说明书CN104189582A3/3页5养基，设5个平行孔，将培养板继续培养24小时，每孔加入20L50MG/MLMTT，再孵育4小时。移去板中培养液，每孔加入150L的DMSO溶解活细胞产生的甲瓒结晶，置摇床上振荡10MIN，在酶标仪于波长570NM处测定各孔光吸光度。与对照孔相比如果含多酚提取物的孔吸光度的减少大于10也就是抑制率大于10，则认为该浓度下对细胞有毒性。0030细胞毒性实验结果表明在谷糠内壳结合态多酚BPIS浓度为03MG/ML时，分别处理HEPG2、HELA和HCT116细胞24小时，与。
14、对照相比抑制率分别约为40、34、100，抑制率均没大于10，所以BPIS在该浓度下对细胞没有毒性。如图2所示。0031实施例30032用完全培养基培养细胞、经胰酶消化后制成细胞悬液，每孔1ML接种到12孔板中，适当稀释细胞浓度至3104个/孔，细胞贴壁后，弃掉培养基，加入1ML新培养基和100L不同质量浓度的谷糠多酚，处理24H，在OLYMPUS倒置显微镜下观察肿瘤细胞的形态变化情况20。0033细胞形态观察表明本发明谷糠多酚BPIS以不同终浓度处理癌细胞后的细胞形态。对照组细胞形态没有变化，贴壁生长旺盛，HCT116呈长梭型、HELA细胞呈多角型、HEPG2细胞呈三角梭型。用BPIS浓度为。
15、057MG/ML处理细胞，部分细胞变为圆形，初步显示出凋亡形态。在BPIS浓度达到114MG/ML时，细胞皱缩，形态异常，正常形态的细胞数量明显减少。如图3所示。0034实施例40035选取对数生长期的HEPG2、HELA、HCT116细胞，调整细胞浓度为每孔4,000个细胞/100L培养液，加到96孔培养板中。37、5CO2培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后取出培养板，更换所需多酚浓度的培养基，设5个平行孔。培养板放回培养箱中继续培养24小时，每孔加入20L50MG/MLMTT，继续孵育4小时。吸去板中培养液，每孔加入150L的DMSO溶解活细胞产生的甲瓒结晶，置摇床上振荡10MIN，在酶标仪于。
16、波长570NM处测定各孔光吸光度。0036本发明所得谷糠内壳结合态多酚BPIS，对人癌细胞株进行上述体外抗肿瘤活性检测，结果表明用不同浓度的BPIS057、086、114、143、171MG/ML处理HELA、HEPG2和HCT116细胞24H，086MG/ML的BPIS分别对HELA、HEPG2和HCT116抑制率为26、32和25，与对照组比较有显著性差异P005；114MG/ML的BPIS对HELA、HEPG2和HCT116抑制率分别为71、68和30，与对照组相比具有极显著性差异P001。当浓度在143MG/ML以上，对三种癌细胞的抑制率均达到60以上。如图4所示。说明书CN104189582A1/3页6图1图2说明书附图CN104189582A2/3页7图3说明书附图CN104189582A3/3页8图4说明书附图CN104189582A。