一种非人灵长类自身免疫脑脊髓膜炎模型建立方法及应用.pdf

本发明公开了一种非人灵长类自身免疫脑脊髓膜炎模型建立方法及应用。具体技术方案为：选用食蟹猴作为非人灵长类实验动物；将MOG34-56(100μg/ml)配制成乳剂(MOG溶液:CFA＝1:1)；将实验猴麻醉后，分10个注射点，皮内注射1ml配制的乳剂；于首次注射(免疫)后的第7天，按同样方法配制MOG-CFA乳剂，按相同剂量和方法进行第二次免疫注射；本发明建立的实验性自身免疫脑脊髓膜炎具有缓解-复发型的发病特点,在多发性硬化疾病的相关领域有广泛的用途。与已有的恒河猴方法和模型相比，本发明方法和模型还具有诱导期短，成本低，猴动物资源丰富等特点，同时还具有啮齿类动物模型无法实现的应用价值。

1.  建立一种非人灵长类自身免疫脑脊髓膜炎模型的方法，所述模型建立方法为：
a、选用食蟹猴作为非人灵长类实验动物；
b、配制免疫诱导乳剂：将MOG34-56肽段(100μg/ml)配制成乳剂(MOG溶液:CFA＝1:1)；
c、第一次免疫注射：每只食蟹猴动物注射1ml配制好的乳剂，分10个注射位点，分别进行皮内注射；
d、第二次免疫注射：第一次免疫注射后的第7天，按上述同样配制乳剂，按第一次免疫注射同样的方法和剂量再次免疫注射。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用MOG34-56肽段间隔7天两次免疫的方法。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为实验模型动物。

4.  如权利要求1所述的方法，在建立非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型中的应用。

5.  如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述动物是非人灵长类动物，列如：猕猴和狨猴等。

6.  如权利要求1所述的方法，在基于非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的应用。

7.  如权利要求6所述的应用，其特征在于：使用生物学、影像学、电子学、物理学、化学、数据分析等方法建立对模型疾病程度、以及发病、恢复、和复发等各期的检测和评估。

8.  如权利要求6所述的应用，其特征在于：评价一种技术、方法、化合物、装置在检测或干预模型疾病中的应用。

9.  如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的技术、方法、装置是检测技术和指标、生物标示物、治疗或预防物质(如化合物、抗体、蛋白质、核酸、核苷等)。

一种非人灵长类自身免疫脑脊髓膜炎模型建立方法及应用
技术领域
本发明涉及非人灵长类动物疾病模型的建立，具体涉及一种非人灵长类自身免疫脑脊髓膜炎模型建立方法及应用。
背景技术
实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是由同种型、同种异型、异种异型致脑炎抗原诱导的、实验敏感动物产生的、由细胞免疫反应介导的、以中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘为特征的迟发型变态反应性自身免疫疾病，其免疫发病机制和病损与人类多发性硬化(multiple sclerosis,MS)相似，被公认为是研究多发性硬化疾病的理想模型。
目前实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型通常是建立在啮齿类动物上的。由于啮齿类在进化关系上与人类相距甚远，实践表明，利用啮齿类动物实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型产生的实验结果在人实验中很难得到验证，评估药物的开发成功率较低，以其为研究对象所获得的实验数据对现实指导意义不大。非人灵长类的解剖特点、免疫等各系统生理功能、及对疾病和治疗药物的反应性等与人类极为相近，是进行免疫学相关疾病研究和治疗、以及进行药物临床前有效性和安全性评价的敏感动物。
随着新药研发技术的发展，尤其是大分子药物(如抗体，核酸，蛋白类药物)技术的成熟，药物特异性作用靶点以及与试验模型交叉反应性是药物研发成功的重要影响因素。非人灵长类动物和人体的亲缘相近，靶点的结构和生物系统相似，有很好的交叉反应性。因此建立非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型将满足多发性硬化治疗药物评价的迫切需要，模型产生的数据对多发性硬化的研究以及对治疗等实际应用具有重要的指导意义。
MOG是一种表达在中枢少突胶质细胞和髓鞘莫表面的跨膜糖蛋白，在体内含量很少却具有很高的免疫原性。研究表明，MOG是唯一能引起脱髓鞘抗体反应，又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。因此，用MOG作为免疫原来诱导产生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)能更好的帮助阐明多发性硬化(MS)的发病机制。
Herbert P.M.Brok等曾报道了使用MOG诱导恒河猴(Macaca mulatta)EAE的模型，其方法为：用恒河猴作为实验动物，将MOG乳剂(MOG PBS溶液:CFA＝1:1)注射于皮内，并于4周后再次皮内注射MOG乳剂(MOG NS溶液:IFA＝1:1)。但该模型的缺点是：1.单次发病；2.诱导方法所需时间长；3.恒河猴个体较大；4.采用较主观的症状评判标准。这些缺点使得该模型无法在科研、药物评估、以及产业化实践中的应用。
本发明利用了中国大量存栏的食蟹猴(Macaca fascicularis)实验动物，创新使用MOG(MOG34-56的肽段)二次快速免疫方法，建立了食蟹猴实验动物EAE模型，其具有缓解-复发反复表现的特点。经多种实验客观检查，本发明建立的模型发病特点和病理学表现与人类多发性硬化有高度的相似性。
发明内容
本发明建立了一种非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓膜炎(EAE)模型的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
a、非人灵长类动物：食蟹猴
b、配制免疫诱导乳剂：将MOG34-56(100μg/ml)配制成乳剂(MOG溶液:CFA＝1:1)；
c、第一次免疫注射：每只食蟹猴动物注射1ml配制好的乳剂，分10个注射位点，分别进行皮内注射；
d、第二次免疫注射：第一次免疫注射后的第7天，按上述同样配制乳剂，按第一次免疫注射同样的方法和剂量再次免疫注射；
本发明所提供的一种非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的建立方法，优选的是：创新的使用MOG34-56肽段进行两次免疫，时间间隔为7天。
本发明所提供的一种非人灵长类实验性自身免疫脑脊髓膜炎模型的建立方法，优选的是：创新使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为实验动物。
本发明的EAE模型应用优点是：
本发明动物模型具有啮齿类动物模型无法实现的应用价值：
a、解剖特点、免疫等各系统生理功能、及对疾病和治疗药物的反应性与人类极为相近；
b、和人亲缘相近，靶点的结构和生物系统相似，为药物特异性(如抗体，核酸，蛋白类药物等)作用靶点提供很好的交叉反应性。
本发明动物模型与恒河猴模型相比更具有实际应用价值：
a、MOG34-56肽段间隔7天两次免疫的方法，缩短了模型的诱导期；
b、发病具有复发-缓解型的反复发病特征，与人类多发性硬化有高度的相似性；
c、与恒河猴相比动物个体小，使用较少受试药物，降低成本；
d、采用猴场大量繁育的食蟹猴，遗传背景清楚，质量控制严格，实验猴资源丰富。
本发明的非人灵长类动物EAE模型在针对多发性硬化疾病的相关领域有广泛的用途，例如：
a、利用模型进行相关的诊断技术和试剂、生物识别物和技术、和转化医学研究工具的研究开发；
b、利用模型的发病率、发病程度、和发病特征，进行相关的各种干预技术开发和药物评价等；
c、利用模型进行相关的评判指标、测量技术、和测定仪器设备开发等；
d、利用模型的动物材料建立相关的数据库、基因库、材料库、和大数据分析等。
附图说明
图1是MOG34-56诱导食蟹猴EAE的诱导方法图
图2是皮内注射MOG34-56乳剂的注射部位及免疫效果图
图3是MOG34-56诱导食蟹猴EAE不同时间的评分图，显示发病-恢复-复发的病程特征
图4是磁共振(MRI)不同轴向扫描显示MOG34-56诱导EAE的食蟹猴脑病变灶图，其与临床评分的对比，显示病变程度与评分高低的关系。
图5是MOG34-56诱导EAE食蟹猴的脑组织切片(H&E染色)图，显示病灶内的出血点(左上角)和炎性细胞浸润(右下角)。
以下通过具体实施案例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
具体实施方式
实验动物：4只食蟹猴(Macaca fascicularis，雄性，4岁，体重3-5千克)；
主要试剂：完全弗氏佐剂(Complete Freund adjuvant，CFA)；MOG34-56肽段；
免疫诱导乳剂的配制：将MOG34-56溶解于生理盐水(NS)中，在4℃条件下用等体积CFA乳化5分钟；
实验方法： 
将配制好的MOG-CFA乳剂，分10个注射位点注射于食蟹猴动物皮内，每只猴注射1ml；
并于首次注射(免疫)后的第7天，按同样方法配制MOG-CFA乳剂，按相同剂量和方法进行第二次免疫注射；
实验结果： 
根据免疫注射后对猴动物症状的观察、评分、脑部核磁(MRI)扫描、以及脑组织病理切片等手段检查：所有4只食蟹猴在首次免疫注射后的4-8周周内均先后出现明显的多发性硬化症状，并呈现发病-恢复-复发的特征；
模型成功率：为100％。