说明书一类昆虫抑咽侧体素的五肽类似物及其应用
技术领域
本发明涉及一类昆虫抑咽侧体素的五肽类似物及其应用，具体涉及在蟑螂 防治中的应用。
背景技术
昆虫生长调节剂(IGRs)对昆虫的生长变态发育生殖等主要生理现象具有 显著的调控作用，因其高效高选择性以及环境友好等特点，在害虫综合防治中发 挥着重要作用。但是由于现阶段农药的不合理使用，导致害虫出现交叉抗性，且 对环境带来负面影响，因此，研究开发结构和作用机理新颖的IGRs就显得十分 必要。
抑咽侧体素(Allatostatins,AST)是一类最早从太平洋折翅蠊 (Diplopterapunctata)体内分离得到的昆虫神经肽。由于在离体条件下具有高效 抑制昆虫保幼激素(JH)生物合成的活性，AST受到广泛关注并被认为是潜在 的昆虫生长调节剂先导。AST普遍存在于各种昆虫当中，常见的如蜚蠊、果蝇、 蚊子、粘虫和蝗虫等。随着研究的深入，AST同时也表现出其它的生物学功能， 如可抑制前肠、中肠、后肠肌肉的收缩和直翅类昆虫卵巢的发育；还能抑制心脏、 背血管、和输卵管等器官中肌肉的收缩等。目前科学家已经分离得到具有不同序 列特征的两大家族抑咽侧体素，分别为FGLamide类抑咽侧体素，也称之为蜚蠊 型抑制咽侧体素和PISCFs类，即蛾型抑咽侧体素。已知的蜚蠊型抑咽侧体素由 6-18个氨基酸组成，在C-末端有共同的“核心五肽”Tyr/Phe-Xaa-Phe-Leu/Ile-NH2(Xaa＝Ala,Asn,Gly,Ser)结构特征。
但是由于天然多肽固有的缺陷，如不易穿透昆虫表皮达到靶点，极易被各种 特异或非特异性的肽酶迅速降解而代谢失活，合成成本高等，导致抑咽侧体素迄 今尚未在害虫防治中得到实际应用。
近年来，人们尝试以AST为先导，创制新型保幼激素合成抑制剂，一些 AST类似物已公开于下列文献中：如1991年，Stay等(Allatostatins,Neuropeptide inhibitors of juvenile hormone synthesis in brain and corpora allata of the cockroach Diplopterapunctata[J].ACS SympSer,1991,453:164-76)，1994年Hayes等 (Structure-activity studies of allatostatin 4on the inhibition of juvenile hormone biosynthesis by corpora allata:the importance of individual side chains and stereochemistry.Peptides 1994,15,1165-1171.)，1998年Nachman等(Synthesis, biological activity,and conformational studies of insect allatostatin neuropeptide analogues incorporating turn-promoting moieties.Bioorg.Med.Chem.1998,6, 1379-1388.)，1997年Piulachs等(Ketomethylene and methyleneaminopseudopeptide analogues of insect allatostatins inhibit juvenile hormone and vitellogenin production in the cockroach Blattellagermanica.Insect Biochem.Molec.Biol.1997,27, 851-858.)，1999年Nachman等(Hemolymph and tissue-bound peptidase-resistant analogs of the insect allatostatins.Peptides 1999,20,23-29.)，1991年Feyereisen等 (US5039792)，2007年Nachman等(US7208476B2)。上述文献中,对AST结 构改造的特点主要有2个：1)大多采用天然氨基酸如Ala，或者非天然氨基酸 如Aic、Cpa以及芳酸等，替换天然AST中的氨基酸，得到结构非常相似的类似 物。2)多数化合物保留了AST原有的离体生物活性，提高了化合物抗酶解的能 力。但是尚存在以下不足之处：化合物的结构复杂(模拟了五肽以上的活性肽)， 部分结构甚至比天然肽复杂，合成成本高，不适合作为新农药进行开发。
发明人近年来也一直致力于AST结构修饰以期发现结构新颖的高活性化合 物，有关发明已申请了相关专利(CN 101519430；CN 101519431；CN 101519432； CN 101519433；CN102093251A)。
发明内容
基于前期抑咽侧体素核心五肽(Y/FXFGLa)模拟物的研究结果，本发明引 入天然或非天然含有亲水侧链或疏水侧链的氨基酸来替换其第二位置的氨基酸， 本发明公开了一类具有良好抑制保幼激素活性的AST类似物。
一类昆虫抑咽侧体素的五肽类似物，结构式如下：
其中：
式A中，Xaa选自Asp，Ser，Thr，Cys，氨基丙二酸，Asn，Glu，Gln，Asp(OMe)， Ala，Abu，Val，Aib，β-Ala或Nle；X选自氢，单取代或多取代的卤素，硝基， 三氟甲基，氰基，羟基，甲基或甲氧基。
优选的，式A中，Xaa选自Asp，Ser，Cys，氨基丙二酸，Asn或Glu；X 选自4-F，4-Cl，4-Br，4-NO2，4-CF3，4-CN或4-OH。
更优选的，抑咽侧体素类似物为下述(1)至(6)中的任意一种化合物：
(1)式A中，Xaa为Asp，X为4-NO2；
(2)式A中，Xaa为Ser，X为4-NO2；
(3)式A中，Xaa为Cys，X为4-NO2；
(4)式A中，Xaa为氨基丙二酸，X为4-NO2；
(5)式A中，Xaa为Asn，X为4-NO2；
(6)式A中，Xaa为Glu，X为4-NO2。
本发明所提供的式A化合物，均按照固相有机合成法得到(参考文献：Chan WG,White PD.Fmoc solid phase peptide synthesis A Practical Approach,Oxford University Press,2000；pp.9-74.)。
本发明采用Tobe等人的离体放射化学测定方法(a.Tobe,S.S.；Clarke,N.The effect of L-methionine concentration on juvenile hormone biosynthesis by corpora allata of the cockroach Diplopterapunctata.Insect Biochem.1985,15,175-179.b. Tobe,S.S.；Pratt,G.E.The influence of substrate concentrations on the rate of insect juvenile hormone biosynthesis by corpora allata of the desert locust in vitro.Biochem. J.1974,144,107-113.)，测试了式A化合物抑制太平洋折翅蠊 (Diplopterapunctata)保幼激素合成的离体活性。
本发明进一步采用注射和药剂涂抹的方法，测试了部分化合物对太平洋折 翅蠊的活体活性，测试结果表明，部分式A化合物在活体条件也有高效抑制昆 虫保幼激素合成和卵的发育的活性。
以本发明的式A化合物为活性成分的防治蟑螂的药物也属于本发明的保护 范围。
在需要的时候，在所述药物中还可以加入一种或多种农药制剂中可接受的载 体，所述载体包括农药制剂中常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等。制成的药物的剂型也是多样的， 可以是粉剂、微乳剂、饵剂、微胶囊剂、乳油等。
本发明的有益效果：围绕前期有较好活性的抑咽侧体素五肽模拟物(见 CN101519433)，针对结构中的第二位氨基酸进行改造，通过引入一系列天然或 非天然含有亲水侧链或疏水侧链的氨基酸取代第二位氨基酸，得到一类具有良好 抑制保幼激素活性的AST类似物，部分化合物的离体活性远优于核心五肽，同 时也优于前期发现的高活性类似物。进一步研究表明，活体条件下该类化合物可 以明显抑制蟑螂保幼激素的合成和卵的发育，符合昆虫生长调节剂的特征，具有 潜在的开发应用前景。
附图说明
图1注射法测定化合物A6对蟑螂保幼激素合成的影响
图2注射法测定化合物A6对蟑螂卵发育的影响
图3涂抹法测定化合物A6对蟑螂保幼激素合成的影响
图4涂抹法测定化合物A6对蟑螂卵发育的影响
具体实施方式
本发明可用以下实施例作进一步详细说明，但本发明并不仅限于这些实施 例。
实施例1
本发明式A化合物的制备均按照多肽固相合成的方法制备。
以化合物A1为例，其制备方法如下：
(1)树脂活化：称取220mg Rink Amide-AM resin，用15ml DCM溶涨活化 3h，加入20％哌啶DMF溶液切割20min，DMF和DCM各洗4次，Kaiser’s 试剂监测反应。
(2)接Leu：加入Fmoc-Leu-OH(3倍量)，HBTU(3倍量)，HOBt(3 倍量)，DIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，脱去反应液，DMF和DCM 各洗4次，Kaiser’s试剂监测反应。后加入20％哌啶DMF溶液切割20min，DMF 洗4次。
(3)接Gly：加入Fmoc-Gly-OH(3倍量)，HBTU(3倍量)，HOBt(3 倍量)，DIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，脱去反应液，DMF和DCM 各洗4次，Kaiser’s试剂监测反应。后加入20％哌啶DMF溶液切割20min，DMF 洗4次。
(4)接Phe：加入Fmoc-Phe-OH(3倍量)，HBTU(3倍量)，HOBt(3 倍量)，DIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，脱去反应液，DMF和DCM 各洗4次，Kaiser’s试剂监测反应。后加入20％哌啶DMF溶液切割20min，DMF 洗4次。
(5)接Asp：加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3倍量)，HBTU(3倍量)， HOBt(3倍量)，DIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，脱去反应液， DMF和DCM各洗4次，Kaiser’s试剂监测反应。后加入20％哌啶DMF溶液切 割20min，DMF洗4次。
(6)接4-硝基苯丙烯酸：加入4-硝基苯丙烯酸(3倍量)，HBTU(3倍 量)，HOBt(3倍量)，DIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室温搅拌2h，脱去反 应液，DMF和DCM各洗4次，Kaiser’s试剂监测反应。
(7)切割，脱去侧链保护基：树脂加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml 苯甲硫醚，4.0mlTFA，室温搅拌2.5h，过滤，除去TFA，加入30ml无水乙醚， 4000N/min离心5min，得白色沉淀，真空干燥，质谱检测。
(8)粗产品用HPLC分离纯化。收集的溶液脱去乙腈后，冻干制得纯产品。 色谱柱为C18半制备柱。
化合物A2-A16均按上述方法制备得到。
式A化合物结构，质谱数据及理化性状列于表1，
表1，式A化合物的结构、质谱数据和物理性状
实施例2化合物的离体活性
本发明采用Tobe等人的离体放射化学测定方法(参考：a.Tobe,S.S.；Clarke, N.The effect of L-methionine concentration on juvenile hormone biosynthesis by corpora allata of the cockroach Diplopterapunctata.Insect Biochem.1985,15, 175-179.b.Tobe,S.S.；Pratt,G.E.The influence of substrate concentrations on the rate of insect juvenile hormone biosynthesis by corpora allata of the desert locust in vitro.Biochem.J.1974,144,107-113.)，测定了式A化合物抑制太平洋折翅蠊 (Diplopterapunctata)保幼激素合成的离体活性。式A化合物离体生测结果见 表2。
表2 式A化合物的离体活性
表2结果表明：式A化合物可以明显抑制太平洋折翅蠊(Diplopterapunctata) 保幼激素的合成，A1-A8的离体活性要优于核心五肽，其中类似物A6的离体活 性是核心五肽的103倍。
实施例3注射法测试化合物的活体活性
配制10μM化合物A6的水溶液，选取成虫羽化后第一天的雌性蟑螂，注射 5μL于腿部关节处，注射过的蟑螂置于27±1℃，湿度80％，充足食物和水，无 光照的条件下培养到第三天，采用离体放射化学测定的方法测试注射后蟑螂合成 保幼激素的能力，并测量其卵的长度。
化合物A6抑制保幼激素合成和抑制卵发育的结果分别如图1，图2所示。 注射测试结果表明，化合物A6对蟑螂保幼激素生物合成具有显著抑制作用，同 时对其卵的发育也有明显抑制作用。所有实验结果均采用t检验方法统计，**** 表示P＜0.0001，**表示P值为0.0021。柱形图上数字为重复次数。
实施例4体表涂抹法测试化合物的活体活性
配制100μM化合物A6的DMSO溶液，并与丙酮配成混合溶液(比例1:5)。 取5μM混合溶液涂抹于羽化当天的雌性蟑螂背部，每头试虫的施药量为 0.1nmol，将处理过的蟑螂置于27±1℃，湿度80％，充足食物和水，无光照的 条件下培养到第三天，采用离体放射化学测定的方法测试注射后蟑螂合成保幼激 素的能力，并测量其卵的长度。
化合物A6抑制保幼激素合成和抑制卵发育的结果分别如图3，图4所示。 实验结果表明，涂抹类似物后试虫的保幼激素合成和卵的发育均被明显抑制。所 有实验结果均采用t检验方法统计，***表示P＜0.0001，柱形图上数字为重复次 数。