孕甾烷生物碱及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途.pdf

本发明属药物领域，涉及含孕甾烷生物碱的单体化合物及其分离制备、以及用于治疗肿瘤的用途。本发明对野扇花属及其近缘的板凳果属植物板凳果(pachysandra axillaris)的化学成分及其药理作用进行了系统研究，分离得到一类孕甾烷生物碱及其单体化合物，经药理测试表明，获得的化合物具有良好的抗肿瘤活性。所述孕甾烷生物碱单体化合物及组合可制备抗肿瘤药物，用载体或赋形剂给予全身或局部用药，用于治疗结肠癌、肺癌、脑癌及乳腺癌。

权利要求书
1.  式（Ⅰ）通式结构的孕甾烷生物碱，

所述的孕甾烷甾体生物碱的骨架中，2，3位之间的连接和/或16，17位之间的连接是单键或双键；
所述的孕甾烷甾体生物碱的3-位和20-位为N原子取代；
所述的孕甾烷甾体生物碱的4-位与R2相连的键是单键或双键。

2.  按权利要求1所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱的3-位N原子上的取代基R1和20-位N原子上的取代基R3、R4是烃基、酰基或羰(醛)基。

3.  按权利要求2所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱的3-位和20-位的N原子上的取代基R1、R3和R4若为烃基，则该取代基是取代和未取代的烷烃、烯烃或炔烃。

4.  按权利要求2所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱的3-位N原子上的取代基R1若为酰基，则该取代基是异戊烯酰基、苯甲酰基、巴豆酰基、肉桂酰基，取代或未取代的磷酸酰基、磺酰基、苯磺酰基或其他有机酸酰基。

5.  按权利要求2所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱的20-位N原子上的取代基R3和R4是氢或甲基。

6.  按权利要求1所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱4-位的R2基团是氢、烃基、含氧基团、含氮基团、含硫基团或其它杂原子基团。

7.  按权利要求6所述的孕甾烷生物碱，其特征在于，所述的孕甾烷甾体生物碱4-位的R2基团若为含氧基团，则该基团是羟基或4-羰基。

8.  权利要求1所述通式结构的孕甾烷生物碱单体化合物，其特征在于，单体化合物是：
化合物1：(20s)-20-甲胺基-3-异戊烯酰胺基-5α-2-孕甾烯-4-酮；
化合物2：(20s)-20-甲胺基-3-异戊烯酰胺基-5α-2,16-孕甾二烯-4-酮；
化合物3：(20s)-20-(N，N-二甲胺基)-3β-苯甲酰胺基-5α-16-孕甾烯；
化合物4：(20S)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-(benzamido)-5α-pregnane，即表粉蕊黄胺D(epipachysamine D)；
化合物5：(20s)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-senecioylamino-5α-pregn-2-ene-4-one，即富贵草碱M(pachysamine M)；
化合物6：(20s)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-tigoylamino-5α-pregn-2-ene-4-one，即Sarcovagine D。

9.  按权利要求8所述通式结构的孕甾烷生物碱单体化合物，其特征在于，通过色谱分离方法从黄杨科野扇花属植物清香桂和板凳果属植物的板凳果中或其他属含类似孕甾烷生物碱的同科植物中提取分离得到。

10.  按权利要求9所述通式结构的孕甾烷生物碱单体化合物，其特征在于，所述的色谱分离方法中，采用正相氧化铝或硅胶色谱方法，用石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇有机溶剂作为洗脱剂；
或，采用反相色谱方法，反相色谱填料选用C18键合相硅胶、C8键合相硅胶、苯基键合相硅胶或氰基键合相硅胶，用醇-水混合溶剂进行洗脱；
或，采用凝胶、大孔吸附树脂、离子交换树脂、甲基丙烯酸聚合树脂的色谱方法，用醇-水混合溶剂进行洗脱。

11.  权利要求1的孕甾烷生物碱及其单体化合物及其组合在制备抗肿瘤药物中的用途。

12.  按权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是结肠癌、肺癌、脑癌或乳腺癌。

13.  按权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物通过抑制A549、H1299、HCT116、HT29、U87、U251、MCF-7或BT549肿瘤细胞的生长，导 致细胞凋亡，达到治疗肿瘤。

14.  按权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用载体或赋形剂给予全身或局部给药。

说明书孕甾烷生物碱及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属药物领域，涉及含孕甾烷生物碱的单体化合物及其分离制备、以及用于治疗肿瘤的用途。
背景技术
据报道，恶性肿瘤是目前危害人们健康的重大疾病之一。目前，临床实践中肿瘤的治疗方案有手术、放疗和化疗等治疗方案。化疗作为肿瘤治疗的三大传统手段之一，在肿瘤治疗中占据着重要地位。已知治疗肿瘤的化学药物包括化学合成药物和中药提取物等等，从天然药物中寻找发现活性成分一直是业内抗肿瘤药物研究的热点。
黄杨科野扇花属多种植物是我国民间中药材，主要用于治疗胃病、跌打劳伤、头晕心悸、喉咙肿痛等。研究发现该植物含生物碱成分，有研究在抗肿瘤天然产物的筛选工作中，发现野扇花属植物清香桂(Sarcococca ruscifolia)的乙醇提取物对多种肿瘤细胞具有抑制活性，进一步的研究发现其抗肿瘤的主要活性成分为孕甾烷类生物碱，多年来，国内外对于这类孕甾烷类生物碱的相关研究多局限于其对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性方面。
迄今，尚未见有关清香桂生物碱部位的化学成分及其药理作用的系统研究的报道。本申请的发明人拟提供新的一类孕甾烷生物碱及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。
与本发明相关的现有技术有：
[1].Kang He，et al.Two new steroidal alkaloids from the roots of sarcococca ruscifolia.Journal of Asian Natural Product Research，2010，12(3):233-238.
[2].Yun Sun，et al.Pregnane alkaloids from Pachysandra axillaris.Streoids，2010，75:818-824.
[3].庾石山，等.海南野扇花中甾体生物碱的化学研究.药学学报，1997，32(11):852-856.。
发明内容
本发明的目的是提供新的用于治疗肿瘤的天然药用植物单体化合物和药物组合。具体的涉及一类孕甾烷生物碱及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明对野扇花属及其近缘的板凳果属（又称富贵草属）植物板凳果(pachysandra axillaris)的化学成分及其药理作用进行了系统研究，分离得到包括多个新化合物在内的一类孕甾烷生物碱，经药理测试表明，获得的多个化合物具有良好的抗肿瘤活性。
本发明涉及的天然药用植物单体化合物为孕甾烷类生物碱化合物，具有式（Ⅰ）的结构通式。

本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱的骨架中，2，3位之间的连接和/或16，17位之间的连接可以是单键或双键。
本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱的3-位N原子上的取代基R1若为酰基，可以是且不局限于异戊烯酰基、苯甲酰基、巴豆酰基、肉桂酰基，取代或未取代的磷酸酰基、磺酰基、苯磺酰基或其他有机酸酰基。
本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱的20-位N原子上的取代基R3和R4可以是氢或甲基。
本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱的4-位与R2相连的键可以是单键或双键。
本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱4-位的R2基团可以是且不局限于氢、烃基、含氧基团、含氮基团、含硫基团或其它杂原子基团。
本发明中，所述的孕甾烷甾体生物碱4-位的R2基团若为含氧基团，则可为羟基或4-羰基。
本发明涉及的孕甾烷甾体生物碱化合物可以通过提取分离的方法从黄杨科野扇花属和板凳果属植物或其他属含类似孕甾烷生物碱的同科植物中分离得到，尤其是从野扇花属的清香桂或板凳果属的板凳果植物中分离得到。
本发明涉及的单体化合物的分离可以通过色谱分离方法制备得到。
本发明涉及的单体化合物的色谱分离可采用正相氧化铝或硅胶色谱方法，用石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂作为洗脱剂。
本发明涉及的单体化合物的色谱分离可采用反相色谱方法，反相色谱填料可以是但不局限于C18键合相硅胶、C8键合相硅胶、苯基键合相硅胶、氰基键合相硅胶等。
本发明涉及的单体化合物的色谱分离可采用凝胶、大孔吸附树脂、离子交换树脂、甲基丙烯酸聚合树脂的色谱方法，用醇-水混合溶剂进行洗脱。
本发明优选的单体化合物为：
化合物1
白色粉末(甲醇)，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.134-136℃；IR(KBr)：3384cm-1，1664cm-1，1643cm-1，1511cm-1；[α]D17：+37.50(c:0.064，CHCl3)；HR-ESIMS m/z427.3312[M+H]+；1H-NMR(CDCl3，400MHz)和13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据见表1。根据波谱数据，推断化合物1为(20s)-20-甲胺基-3-异戊烯酰胺基-5α-2-孕甾烯-4-酮，为一新的天然孕甾烷类生物碱，命名为清香桂碱E(Sarcorucinine E)。
化合物2
白色粉末(甲醇)，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.265-267℃；IR(KBr)：3418cm-1，1665cm-1，1641cm-1；[α]D18：+42.00(c:0.1，CHCl3)；HR-ESI-MS m/z425.3167[M+H]+；1H-NMR(CDCl3，400MHz)和13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据见表1。根据波谱数据，推断化合物2为(20s)-20-甲胺基-3-异戊烯酰胺基-5α-2,16-孕甾二烯-4-酮，为一新的天然孕甾烷类生物碱，命名为清香桂碱F(Sarcorucinine F)。
化合物3
白色粉末(甲醇)，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.186-188℃；IR(KBr)：3388cm-1，1642cm-1，1603cm-1，1574cm-1，1488cm-1，720cm-1；[α]D17：-40.63(c:0.064，CHCl3)；HR-ESI-MS m/z449.3512[M+H]+；1H-NMR(CDCl3，500MHz)和13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据如表2所示。根据波谱数据，推断化合物3为(20s)-20-(N，N-二甲胺基)-3β-苯甲酰胺基-5α-16-孕甾烯，为一新的天然孕甾烷类生物碱，命名为清香桂碱G(Sarcorucinine G)。
化合物4
白色粉末，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.246-248℃；[α]D17：+6.84(c:0.19，CHCl3)；ESI-MS m/z451.5[M+H]+；13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据见表2。化合物4与文献报道的表粉蕊黄胺D对照基本一致，确定该化合物的结构为：(20S)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-(benzamido)-5α-pregnane，即表粉蕊黄胺D(epipachysamine D)。
化合物5
白色粉末(甲醇)，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.96-98℃；[α]D17：+39.84(c:0.374，CHCl3)；ESI-MS m/z441.3[M+H]+；13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据见表3。化合物5与文献报道的富贵草碱M对照基本一致，确定该化合物的结构为：(20s)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-senecioylamino-5α-pregn-2-ene-4-one，即富贵草碱M(pachysamine M)。
化合物6
白色粉末(甲醇)，碘化铋钾显橙红色，说明为生物碱成分；m.p.170-172℃；[α]D18：+82.56(c:0.086，CHCl3)；ESI-MS m/z441.2[M+H]+；13C-NMR(CDCl3，100MHz)数据表3。化合物6与文献报道的Sarcovagine D对照基本一致，确定该化合物的结构为：(20s)-20-(N,N-dimethylamino)-3β-tigoylamino-5α-pregn-2-ene-4-one，即Sarcovagine D。
表1化合物1和2的NMR数据

表2化合物3和4的NMR数据


表3化合物5和6的NMR数据


本发明涉及的孕甾烷甾体生物碱可进一步制备抗肿瘤药物或与其他药物制成治疗肿瘤的药物组合。
本发明涉及的孕甾烷甾体生物碱及其单体化合物和药物组合主要用于但不局限于治疗结肠癌、肺癌、脑癌及乳腺癌，所述药物可以通过抑制A549、H1299、HCT116、HT29、U87、U251、MCF-7和BT549等不同类型的肿瘤细胞的生长、导致细胞凋亡以达到治疗肿瘤的作用
本发明的孕甾烷类生物碱单体化合物和药物组合可用载体或赋形剂给予全身或局部给药，更具体的可经鼻、经口、透皮、经肠道、静脉或肌肉注射给药。
具体实施方式
实施例1化合物1的提取及分离
清香桂(Sarcococca ruscifolia)根茎粉碎(635g)后用95%酒精渗漉。减压浓缩为酒精浸膏，悬浮于水后分别用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水层共三个部位。
氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(20:80-10:90)进行梯度洗脱，得化合物1：白色粉末，10.1mg；mp134-136℃；IR(KBr)：3384cm-1，1664cm-1，1643cm-1,1511cm-1；[α]D16.8：+37.50(c:0.064,CHCl3)；ESI-MS m/z427.3[M+H]+；核磁共振数据如表1所示。
实施例2化合物2的提取及分离
取上述清香桂氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(15:85)进行洗脱，得化合物2：白色粉末，9.1mg；mp265-267℃；IR(KBr)：3418cm-1，1665cm-1,1641cm-1；[α]D17.7：+42.00(c:0.1,CHCl3)；ESI-MSm/z425.4[M+H]+；核磁共振数据如表1所示。
实施例3化合物3的提取及分离
取上述清香桂氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(10:90)进行洗脱，得化合物3：白色粉末，8mg；mp186-188℃；IR(KBr)：3388cm-1，1642cm-11,1603cm-1，1574cm-1，1488cm-1，720cm-1；[α]D17.4：-40.63(c:0.064，CHCl3)；ESI-MS m/z449.4[M+H]+；核磁共振数据如表2所示。
实施例4化合物4的提取及分离
取上述清香桂氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(20:80-10:90)进行梯度洗脱，得化合物4：白色粉末，30.1mg；mp246-248℃；[α]D17.0：+6.84(c:0.19,CHCl3)；ESI-MS m/z451.5[M+H]+；核磁共振数据如表2所示。
实施例5化合物5的提取及分离(1)
取上述清香桂氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(10:90)进行洗脱，得化合物5：白色粉末，15mg；mp96-98℃；[α]D17.4：+39.84(c:0.374，CHCl3)；ESI-MS m/z441.3[M+H]+；核磁共振数据如表3所示。
实施例6化合物5的提取及分离(2)
板凳果(pachysandra axillaris)根茎(500g)粉碎后用95%酒精渗漉。减压浓缩为酒精浸膏，悬浮于水后分别用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水层共三个部位。
取氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(10:90)进行洗脱，得化合物5：4.2mg。
实施例7化合物6的提取及分离(1)
取上述清香桂氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(10:90)进行洗脱，得化合物6：白色粉末，27.8mg；mp170-172℃；[α]D17.6：+82.56(c:0.086，CHCl3)；ESI-MS m/z441.2[M+H]+；核磁共振数据如表3所示。
实施例8化合物6的提取及分离(2)
取板凳果氯仿部位经氧化铝柱色谱分离后，再用C18反相色谱分离，用水-甲醇(10:90)进行洗脱，得化合物6：5.5mg。
实施例9抗肿瘤活性试验
人肺癌细胞株A549、H1299，人结直肠癌细胞株HCT116、HT29，人乳腺癌细胞株MCF-7、BT-549和人胶质母细胞瘤U87、U251均在37°C含5％CO2条件下培养于含10％胎牛血清、50kU/L青霉素及50mg/L链霉素的DMEM培养液内，胰酶消化再用培养液稀释细胞浓度至5×104个/ml，取100μl加入96孔板的孔内，然后再加入不同浓度的抗癌药物，培养68h后，每孔加入10μl5mg/ml的MTT再培养4h，然后弃培养液每孔加入100μl的DMSO，用酶标仪在490nm读取每孔的吸光值。用Bliss法计算IC50值。结果如表4所示。
表4.抗肿瘤活性试验(IC50,μM)